■ 劉 漫 程 順 鄭連寶 張 旭 章美芳 沈 佳 遲美麗 李 飛*

（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313001；2.德清縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江湖州 313200）

紅螯螯蝦（Cherax quadricariratus）俗稱澳洲淡水龍蝦、小青龍，是世界性淡水名貴經(jīng)濟(jì)蝦類之一，目前其繁育方式主要有室內(nèi)水泥池繁育與室外土塘繁育，其中包括浙江省在內(nèi)的非熱帶地區(qū)更趨向于室內(nèi)水泥池繁育，該方式的出苗量更高、更穩(wěn)定，且環(huán)境可控，集約化程度高，特別是對(duì)于紅螯螯蝦這一熱帶品種更適宜[1-3]。但因該蝦抱卵量少、孵化率低、出苗量不足，且規(guī)?；缂夹g(shù)滯后，導(dǎo)致目前其苗種供應(yīng)緊張，亟需針對(duì)性解決其大規(guī)模繁育中的技術(shù)瓶頸問(wèn)題。

營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，即保證親本的營(yíng)養(yǎng)充足供給，既是提高親本抱卵量及蝦苗孵化率和成活率的物質(zhì)保證，也是保證胚胎正常發(fā)育和開(kāi)口前幼體營(yíng)養(yǎng)需求的基礎(chǔ)[4-5]。親本餌料中充足的營(yíng)養(yǎng)和能量對(duì)于其性腺的成熟是必要的，并影響卵巢的組成和卵子的質(zhì)量[6]。在親蝦性腺發(fā)育前，體內(nèi)儲(chǔ)存的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類物質(zhì)（以磷脂為主），這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在性腺發(fā)育時(shí)會(huì)迅速轉(zhuǎn)移至性腺加以利用[7-9]，其中蛋白質(zhì)主要用于性腺發(fā)育，脂類主要滿足能量需求[10]。通訊螯蝦（Pacifastacus leniusculus）雌蝦餌料中應(yīng)含有足夠的蛋白質(zhì)和必需氨基酸，以滿足其生長(zhǎng)和卵黃發(fā)育的需要[11]。使用蛋白質(zhì)含量較高的餌料可明顯提高紅螯螯蝦產(chǎn)卵效果[12]。除蛋白質(zhì)外，性腺發(fā)育還受餌料中脂類、類胡蘿卜素等物質(zhì)影響[13]。脂質(zhì)是最重要的能量物質(zhì)，它們的氧化分解可用于饑餓或繁殖過(guò)程中的能量消耗[14]。性腺的脂質(zhì)需求部分來(lái)自餌料，因?yàn)樽陨砀我认俚闹|(zhì)儲(chǔ)備不能滿足卵巢需求[15]。類胡蘿卜素對(duì)紅螯螯蝦性腺發(fā)育也起著至關(guān)重要的作用[16]，類胡蘿卜素（β-胡蘿卜素和蝦青素）與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，繁育期間餌料中應(yīng)補(bǔ)充類胡蘿卜素[17]。對(duì)繁殖期親蝦投喂多種混合餌料，親蝦體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)加速積累，有利于雌蝦的抱卵，可明顯改善親蝦性腺再成熟和產(chǎn)卵能力，再次產(chǎn)卵所需時(shí)間也會(huì)縮短[18-19]。每日補(bǔ)充螺螄肉和魚(yú)肉，紅螯螯蝦卵的質(zhì)量與抱卵量均會(huì)提高[20]。投喂動(dòng)物性餌料的克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）雌蝦性腺發(fā)育狀況明顯好于投喂配合飼料[21]。美國(guó)龍蝦（Homarus americanus）繁殖期間應(yīng)加強(qiáng)投喂動(dòng)物性餌料，為蝦提供充足的營(yíng)養(yǎng)[22]。植物性和動(dòng)物性餌料混合喂養(yǎng)更有利于促進(jìn)克氏原螯蝦卵巢發(fā)育[23]。因此，富含蛋白質(zhì)、脂類等的動(dòng)物性餌料與富含類胡蘿卜素等的植物性餌料的充足供給是保證親蝦性腺成熟度與卵質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。

胚胎發(fā)育所需的蛋白質(zhì)和氨基酸均直接來(lái)源于卵黃物質(zhì)的逐漸水解，蛋白質(zhì)和氨基酸含量的變化可進(jìn)一步促進(jìn)各種組織與器官的形成。在紅螯螯蝦整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中，總蛋白的含量大致呈直線下降趨勢(shì)，總氨基酸的含量變化則呈拋物線狀。在紅螯螯蝦的胚胎發(fā)育過(guò)程中，卵內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷地進(jìn)行著異化和同化作用，一部分的蛋白質(zhì)用于構(gòu)建組織與器官，另一部分的蛋白質(zhì)為胚胎發(fā)育提供能量[24]。紅螯螯蝦胚胎發(fā)育有代表性、發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的階段分別為黃卵期（原腸期至5 對(duì)附肢期，呈黃色的卵）、桔卵期（7 對(duì)附肢期至18對(duì)附肢期，呈桔色的卵）[25]。

本研究通過(guò)在餌料中使用一定比例的帶魚(yú)、螺螄肉、胡蘿卜等營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化紅螯螯蝦親本，探討營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化對(duì)其抱卵效果及胚胎質(zhì)量的影響，并分別探討有代表性的黃卵期、桔卵期胚胎指標(biāo)，用于指導(dǎo)親蝦培育。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用紅螯螯蝦來(lái)自浙江省淡水水產(chǎn)研究所德清試驗(yàn)基地，所用蝦體質(zhì)健康、四肢齊全，規(guī)格基本一致。

1.2 養(yǎng)殖試驗(yàn)方法

將親蝦以雌雄比為4∶1 的比例放入養(yǎng)殖槽內(nèi)，每個(gè)槽放入10尾蝦[8雌蝦2雄蝦，平均體重為（67.26±4.98） g]，設(shè)置3 組餌料類型，每期3 個(gè)重復(fù)。1 組：每日早、晚各投喂一次飼料，早上投喂量為蝦總重的2%，傍晚投喂量為蝦總重的4%；2 組：早上投喂飼料，投喂量為蝦總重的2%，傍晚投喂順序?yàn)榈? 日帶魚(yú)、第2 日配合飼料+胡蘿卜、第3日螺螄肉、第4日配合飼料、第5 日帶魚(yú)、第6 日配合飼料+胡蘿卜、第7 日配合飼料，7 日重復(fù)1 次，傍晚飼料、胡蘿卜投喂量為蝦總重的4%，帶魚(yú)、螺螄肉投喂量為蝦總重的8%；即每周帶魚(yú)、螺螄肉、胡蘿卜與配合飼料的總投喂量比例為2∶1∶1∶3.75；3 組：早上投喂飼料，投喂量為蝦總重的2%，傍晚每日的投喂順序?yàn)榈?日帶魚(yú)、第2日配合飼料+胡蘿卜、第3 日帶魚(yú)、第4 日螺螄肉、第5 日帶魚(yú)、第6 日配合飼料+胡蘿卜、第7 日螺螄肉，7 日重復(fù)1次，傍晚飼料、胡蘿卜投喂量為蝦總重的4%，帶魚(yú)、螺螄肉投喂量為蝦總重的8%；即每周帶魚(yú)、螺螄肉、胡蘿卜與配合飼料的總投喂量比例為3∶2∶1∶2.75。

隔日吸污換水，各組環(huán)境條件均相同，保證培育環(huán)境的溶氧、溫度、水質(zhì)狀況良好及一致。試驗(yàn)期共30 d。

1.3 抱卵指標(biāo)檢測(cè)

交配30 d 后抓取抱卵蝦，統(tǒng)計(jì)各組的抱卵指標(biāo)，包括抱卵率、絕對(duì)懷卵量（平均每尾抱卵蝦懷卵數(shù)量，粒/尾）、相對(duì)懷卵量、畸形胚胎比例，檢測(cè)分析不同營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備下雌蝦的抱卵狀況。

抱卵率（%）=抱卵蝦數(shù)量/雌蝦數(shù)量×100

相對(duì)懷卵量（粒/g）=絕對(duì)懷卵量/雌蝦體質(zhì)量

畸形胚胎比例（%）=畸形胚胎數(shù)量/總胚胎數(shù)×100

1.4 胚胎指標(biāo)檢測(cè)

剝離各組抱卵蝦的胚胎（黃卵期及桔卵期胚胎）進(jìn)行分析，包括：①胚胎總體指標(biāo)：檢測(cè)各組胚胎的濕重、干重及總蛋白、總脂含量，分析不同營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備下雌蝦抱卵后胚胎的基本狀況；②營(yíng)養(yǎng)成分分析：分析各組胚胎內(nèi)氨基酸（必需與非必需氨基酸）及脂肪酸含量，分析不同營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備下雌蝦產(chǎn)卵后胚胎的營(yíng)養(yǎng)狀況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Excel 軟件完成，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示。以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抱卵指標(biāo)

由表1 可知，2、3 組紅螯螯蝦的抱卵率、相對(duì)懷卵量均顯著高于1 組（P<0.05），紅螯螯蝦絕對(duì)懷卵量、畸形胚胎比例則3 組之間均無(wú)顯著差異（P>0.05），2、3組紅螯螯蝦的各指標(biāo)則均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表1 抱卵指標(biāo)

2.2 胚胎總體指標(biāo)

由表2 可知，黃卵期胚胎的濕重、干重與桔卵期胚胎無(wú)顯著差異（P>0.05），但黃卵期胚胎的總蛋白含量均顯著低于桔卵期胚胎（P<0.05），總脂含量則均顯著高于桔卵期胚胎（P<0.05）。另外，黃卵期胚胎各組之間的濕重、干重、總蛋白及總脂含量均無(wú)顯著差異（P>0.05）。桔卵期胚胎各組之間的濕重、干重及總脂含量均無(wú)顯著差異（P>0.05），但桔卵期胚胎中1 組的總蛋白含量顯著低于2、3 組（P<0.05），2、3 組之間的總蛋白含量無(wú)顯著差異（P>0.05），但總體上桔卵期胚胎中3組的總蛋白含量略高。

表2 胚胎總體指標(biāo)

2.3 胚胎氨基酸含量

由表3 可知，必需氨基酸含量比較中，黃卵期胚胎的必需氨基酸含量（除苯丙氨酸外）均顯著低于桔卵期胚胎（P>0.05）。另外，黃卵期胚胎各組之間均無(wú)顯著差異（P>0.05）。桔卵期胚胎中，3 組的必需氨基酸含量均顯著高于其他兩組（P<0.05），其中1 組賴氨酸含量顯著低于2 組（P>0.05），其他必需氨基酸含量1、2組間則無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表3 胚胎必需氨基酸含量（mg/g干物質(zhì)）

由表4 可知，非必需氨基酸含量比較中，黃卵期胚胎的天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、胱氨酸含量均顯著低于桔卵期胚胎（P<0.05），但黃卵期胚胎的精氨酸含量則顯著高于桔卵期胚胎（P<0.05）。另外，黃卵期胚胎中，1 組的胱氨酸含量顯著低于2、3組（P<0.05）；1、2 組中的酪氨酸顯著低于3 組（P<0.05）。桔卵期胚胎的非必需氨基酸含量中，3 組的天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、胱氨酸含量顯著高于1、2 組（P<0.05）；3 組的甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸含量顯著高于1組（P<0.05）。

表4 胚胎非必需氨基酸含量（mg/g干物質(zhì)）

2.4 胚胎脂肪酸含量

由表5、表6 可知，黃卵期胚胎的C15∶0、C18∶3n-6、C20∶5n-3（EPA）顯著高于桔卵期胚胎（P<0.05），黃卵期胚胎中2、3 組的C22∶6n-3（DHA）顯著高于桔卵期胚胎（P<0.05），而C20∶3n-3 則顯著低于桔卵期胚胎（P<0.05）。另外，黃卵期胚胎中，1 組的C14∶0 顯著高于2 組（P<0.05），1 組的C18∶3n-3 顯著低于2 組（P<0.05），2 組的C20∶4n-6、C23∶0 顯著高于其他兩組（P<0.05），3組的EPA、DHA顯著高于其他兩組（P<0.05）。桔卵期胚胎中，1 組的C17∶0、C17∶1n-7、C18∶0、C18∶1n-9、C18∶2n-6、C18∶3n-3、C20∶4n-6、C20∶3n-3、EPA 顯著低于其他兩組（P<0.05），但1 組的C20∶0、C20∶2n-6 顯著高于其他兩組（P<0.05）。

表5 胚胎脂肪酸含量（mg/g干物質(zhì)，C14∶0～C20∶0）

表6 胚胎脂肪酸含量（mg/g干物質(zhì)，C20∶1～C22∶6n-3）

3 討論

餌料能否滿足一定的蛋白質(zhì)或氨基酸供應(yīng)對(duì)保證親蝦的正常繁殖具有重要意義[26-27]。研究表明，在餌料中補(bǔ)充魚(yú)肉和螺螄肉等動(dòng)物性餌料，有助于雌蝦性腺發(fā)育，可提高紅螯螯蝦抱卵率與懷卵量[20-23]。本次研究結(jié)果顯示，2、3組紅螯螯蝦的抱卵率、相對(duì)懷卵量均顯著高于1組，這與上述研究結(jié)果一致。

本次試驗(yàn)中，胚胎總脂質(zhì)含量隨胚胎發(fā)育而降低，推測(cè)是卵黃中大量脂質(zhì)被不斷分解，為新組織、新器官的形成和生長(zhǎng)提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。有研究顯示，胚胎從黃卵期發(fā)育至桔卵期的過(guò)程中，是各組織與器官分化和形成的關(guān)鍵時(shí)期，該階段胚胎新陳代謝旺盛，所以脂質(zhì)可能為該階段的各項(xiàng)生理活動(dòng)提供較多能量[25，28]。胡先成等[29]的研究也指出，河川沙塘鱧的胚胎發(fā)育至眼黑色素期出現(xiàn)時(shí)，其細(xì)胞、組織分化速度加快，脂質(zhì)被大量利用，造成胚胎內(nèi)脂質(zhì)的含量急劇降低。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，EPA 和DHA 等關(guān)鍵脂肪酸含量隨胚胎發(fā)育的深入而下降，可能是因?yàn)橥瑢儆讦?3 系列不飽和脂肪酸，為重要的多不飽和脂肪酸，是動(dòng)物發(fā)育的必需脂肪酸，其含量隨胚胎發(fā)育的深入而下降，可能與這兩種脂肪酸有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及作為主要能源維持胚胎發(fā)育的作用有關(guān)。

同時(shí)，卵黃的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要是卵黃蛋白和脂質(zhì)，本試驗(yàn)中，與脂質(zhì)的變化趨勢(shì)不同，胚胎發(fā)育過(guò)程中，總蛋白含量明顯增加。這可能是因?yàn)樵谂咛グl(fā)育與各組織、器官的不斷形成過(guò)程中，需要蛋白質(zhì)的快速合成。因此推測(cè)從黃卵期發(fā)育至桔卵期過(guò)程中，主要消耗脂質(zhì)作為能量，并積蓄大量蛋白質(zhì)，這些積累的蛋白質(zhì)將用于桔卵期之后的胚體發(fā)育與胚胎孵化。

另外，本研究中，桔卵期2、3 組的總蛋白含量顯著高于1 組，這是由于蛋白質(zhì)不但是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而且是細(xì)胞生理代謝的重要能源物質(zhì)之一，在胚胎發(fā)育及苗種孵化中較為重要[30]。因此，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化使總蛋白含量顯著增加有利于胚胎和幼體的發(fā)育。而蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值又取決于氨基酸，特別是必需氨基酸的組成與含量[30]。另外，有研究表明，必需氨基酸中的亮氨酸、異亮氨酸可分解成乙酰CoA 和乙酰乙酸，兩者均是溝通糖類與脂類代謝的重要中間物質(zhì)[31]；非必需氨基酸中的谷氨酸與排氨有關(guān)，另外谷氨酸在酶的催化下，可生成相應(yīng)的α-酮戊二酸，而α-酮戊二酸又是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物[32-33]，而精氨酸可參與肌酸的合成，在能量代謝中起重要作用[33]。因此，異亮氨酸與谷氨酸含量的提高對(duì)胚胎的順利發(fā)育具有積極作用。本研究中，桔卵期胚胎中，3組胚胎內(nèi)的異亮氨酸等必需氨基酸及谷氨酸、精氨酸等非必需氨基酸含量均顯著高于其他兩組，說(shuō)明帶魚(yú)、螺螄肉、胡蘿卜等比例的適當(dāng)增加可顯著提高胚胎的必需氨基酸含量，對(duì)胚胎發(fā)育具有積極意義。

脂類對(duì)胚胎的正常孵化極為重要。幼體在開(kāi)口前無(wú)外源性營(yíng)養(yǎng)的攝入，僅能依靠胚胎中已有脂肪作為能源以實(shí)現(xiàn)孵化[34]。胚胎中的脂肪由親蝦性腺發(fā)育過(guò)程中的餌料所提供，因此保證足夠的營(yíng)養(yǎng)有利于胚胎質(zhì)量的提高[35]。本研究表明，EPA 與DHA等脂肪酸含量基本為1 組的低于其他兩組，由于蝦蟹類脂肪酸中的EPA 與DHA 能夠用于合成磷脂，磷脂能促進(jìn)膽固醇（合成蛻皮激素的前體物質(zhì)）的吸收和利用，間接影響了蝦蟹類幼體的蛻殼與提高幼體存活率，這也有利于胚胎發(fā)育[36]。胚胎中EPA 水平與親蝦產(chǎn)卵量、DHA 水平與受精卵孵化率之間分別存在著正相關(guān)關(guān)系[37]。本研究中，黃卵期3 組的EPA、DHA 顯著高于其他兩組（P<0.05）。桔卵期2、3 組的EPA 等大部分脂肪酸顯著高于1 組（P<0.05），結(jié)合抱卵率、相對(duì)懷卵量、總蛋白含量等也是2、3 組顯著高于1 組，說(shuō)明單純只投喂飼料可能不足以最大程度提高胚胎發(fā)育的效果，因此有必要混合添加動(dòng)物性和植物性餌料。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，胚胎從黃卵期發(fā)育為桔卵期，總蛋白含量升高，總脂含量則降低，可能與器官的生成及之后胚體發(fā)育與胚胎孵化有關(guān)。同時(shí)，每周帶魚(yú)、螺螄肉、胡蘿卜與配合飼料的總投喂量比例為3∶2∶1∶2.75 或2∶1∶1∶3.75 進(jìn)行紅螯螯蝦親本的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，有助于提高親本抱卵率、相對(duì)懷卵量、胚胎總蛋白含量、大部分氨基酸與脂肪酸含量，促進(jìn)親蝦的性腺發(fā)育，其中每周帶魚(yú)、螺螄肉、胡蘿卜與配合飼料的總投喂量比例為3∶2∶1∶2.75有助于提高黃卵期胚胎的EPA與DHA含量。