■ 孫 宇 祖曉偉 韓 旭 吳春會(huì) 李秋鳳 楊燕燕 王明亞*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.河北省畜牧總站，河北石家莊 050000；3.承德魚兒山承墾農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，河北承德 067000）

紫花苜蓿富含蛋白質(zhì)，氨基酸組成優(yōu)良，營養(yǎng)價(jià)值高，易于消化，畜禽喜采食，對動(dòng)物健康具有重要意義[1]，在動(dòng)物生產(chǎn)中能夠代替部分精料，是奶牛重要的優(yōu)質(zhì)飼草[2]，常青貯保存。但是，新鮮苜蓿水分含量高，附生菌少，發(fā)酵底物不足，導(dǎo)致苜蓿直接青貯難以成功，在生產(chǎn)實(shí)踐中，常將水分控制在50%，進(jìn)行半干青貯。然而，河北省大部分地區(qū)，苜蓿刈割季節(jié)多逢雨季，刈割的苜蓿不利于晾曬萎蔫，同時(shí)還耗費(fèi)大量的人力，而混合青貯可以有效避免這種情況。前人研究已表明，將苜蓿與低水分飼草（如稻殼、麥麩等）混合青貯能夠改善青貯品質(zhì)，但未見苜蓿與花生秧混合青貯的報(bào)道[3]?；ㄉ碜鳛檗r(nóng)業(yè)資源廢棄物，營養(yǎng)價(jià)值豐富，粗蛋白含量高，纖維品質(zhì)好，質(zhì)地松軟，適口性佳，是一種優(yōu)質(zhì)的粗飼料資源，近年來，花生秧已逐漸被應(yīng)用至反芻動(dòng)物的生產(chǎn)中[4]。所以本試驗(yàn)選擇將苜蓿與花生秧混合青貯。

苜蓿與花生秧均屬豆科植物，可溶性碳水化合物（WSC）含量低，因此添加纖維素酶，以期將纖維素、半纖維和木質(zhì)素等物質(zhì)降解為單糖或雙糖，增加發(fā)酵底物。由于苜蓿與花生秧的附生菌較少，人工添加植物乳桿菌，保證青貯初期發(fā)酵所需的乳酸菌數(shù)量，使之盡快、盡早進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段。魏曉斌等[5]研究表明纖維素分解酶與乳酸菌的聯(lián)合使用效果好于兩者單獨(dú)使用。單寧能夠抑制微生物的活動(dòng)及酶的活性，并能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成絡(luò)合蛋白，在青貯過程中能夠降低CP 降解[6]。Chen 等[7]研究表明，將苜蓿分別添加5個(gè)單寧水平（0、10、20、40、60 g/kg DM）青貯，結(jié)果表明，添加單寧的量不宜超過40 g/kg DM，且此時(shí)青貯效果最佳。

纖維素酶、植物乳桿菌和單寧能夠改善苜蓿與花生秧混合青貯的品質(zhì)，但對動(dòng)物消化利用的影響尚不明確，本試驗(yàn)通過體外發(fā)酵試驗(yàn)，探究添加纖維素酶、植物乳桿菌和單寧及其不同組合使用，對紫花苜蓿與花生秧混合青貯后體外發(fā)酵特性的影響，以期篩選出適宜的添加劑，為調(diào)控紫花苜蓿與花生秧混合青貯料在反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料及添加劑

紫花苜蓿刈割于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)基地，品種為WL358，第三茬（2022 年7 月29 日），收割時(shí)期為現(xiàn)蕾期，留茬高度7～8 cm，鍘短長度2～3 cm。花生秧購自河北省保定市唐縣某農(nóng)場，為風(fēng)干花生秧，干物質(zhì)含量為92.86%。添加劑所用單寧為復(fù)配水解單寧，純度>93%，購自河南萬邦化工科技有限公司；纖維素酶的酶活為10 000 U/g，由李氏木霉深層發(fā)酵生產(chǎn)，購自夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)，植物乳桿菌活菌數(shù)為1×1010CFU/g，購自天益生物科技有限公司。

紫花苜蓿與花生秧以7∶3 比例均勻混合，其營養(yǎng)水平見表1。

表1 苜蓿與花生秧混合原料的營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 瘤胃液供體動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

保定市滿城宏達(dá)牧業(yè)3 頭帶有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦閹牛為瘤胃液供體，每天飼喂2 次，自由飲水。其日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將紫花苜蓿與花生秧以7∶3 比例混合青貯，將添加劑均勻噴灑于青貯料上，混合均勻后裝入250 mm×350 mm 聚乙烯袋抽真空青貯，每袋青貯原料400 g，室溫青貯45 d，青貯結(jié)束后，將青貯樣在65 ℃烘箱干燥至恒重，室內(nèi)回潮，制成風(fēng)干樣，粉碎，然后過20 目篩，稱取0.5 g 裝入ANKOM F57 纖維袋，放入發(fā)酵瓶中進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗(yàn)，體外發(fā)酵48 h，共8 個(gè)處理，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)。各處理組添加量見表3。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 體外瘤胃培養(yǎng)

1.4.1 人工瘤胃液的配制

在保定市滿城宏達(dá)牧業(yè)選用3 頭體重相近、帶有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦閹牛為瘤胃液供體，于晨飼前采集瘤胃液，經(jīng)4 層紗布過濾至預(yù)熱保溫瓶內(nèi)，并不斷充入CO2隔絕空氣，采集完畢迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。將預(yù)處理好的裝有青貯樣品的ANKOM F57纖維袋放置到100 mL 發(fā)酵瓶中，在39 ℃恒溫氣浴搖床中進(jìn)行預(yù)熱處理，每個(gè)處理8 個(gè)重復(fù)。再按照Menke 等[8]方法配制的厭氧人工瘤胃緩沖液，然后使其與采集的瘤胃液以3∶1 比例混合制成人工瘤胃混合發(fā)酵液（操作過程始終保持厭氧條件）。取60 mL人工瘤胃混合發(fā)酵液倒入提前預(yù)熱好的發(fā)酵瓶中，蓋緊蓋子，并放置在39 ℃的恒溫氣浴搖床中進(jìn)行發(fā)酵（操作過程始終保持厭氧條件），測量2、4、6、8、12、24、36、48 h 發(fā)酵瓶的壓力值。每種處理在培養(yǎng)48 h 時(shí)取出發(fā)酵瓶進(jìn)行冰水浴終止發(fā)酵，發(fā)酵液分裝至2 個(gè)15 mL 離心管和2 個(gè)10 mL 離心管中，用于測定氨態(tài)氮（NH3-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。同時(shí)將發(fā)酵瓶中纖維袋取出，沖洗至沖洗液無色，于烘箱中65 ℃烘至恒重，測定干物質(zhì)降解率（DMD）、中性洗滌纖維降解率（NDFD）、酸性洗滌纖維降解率（ADFD）、CP 降解率（CPD）。

1.4.2 體外瘤胃發(fā)酵指標(biāo)

pH使用 UB-7 型精確酸度計(jì)（美國）測定；NH3-N采用馮宗慈等[9]比色法進(jìn)行測定；瘤胃液預(yù)處理參照王加啟[10]的方法，用安捷倫7890A 氣相色譜儀（美國）測定瘤胃發(fā)酵液中的VFA 的含量，標(biāo)品選擇2-乙基丁酸。

1.4.3 體外降解率指標(biāo)

式中：DMD——干物質(zhì)消化率（%）；

M1——體外前樣品重量（g）;

A——體外前樣品干物質(zhì)含量（%）；

M2——體外后樣品重量（g）;

B——體外后樣品干物質(zhì)含量（%）。

式中：D——某營養(yǎng)物質(zhì)降解率（%）；

m1——體外前該營養(yǎng)物質(zhì)的含量（g）;

m2——體外后該營養(yǎng)物質(zhì)的含量（g）。

1.4.4 體外產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)指標(biāo)

使用HT-935專業(yè)壓差測量儀記錄產(chǎn)氣量發(fā)酵瓶壓力值（Psi），每次測量結(jié)束排空發(fā)酵瓶中氣體，通過空白瓶校正，計(jì)算48 h累計(jì)產(chǎn)氣量[11]。

GP=0.18+3.697Pt+0.082 4Pt2

式中：GP——t時(shí)間總產(chǎn)氣體積（mL）；

Pt——t時(shí)間壓力值（Psi）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 進(jìn)行計(jì)算處理，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，利用SPSS 23.0進(jìn)行顯著性方差分析，數(shù)據(jù)采用ANOVA-單因素進(jìn)行方差分析，并利用鄧肯氏多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯的體外發(fā)酵pH和NH3-N的影響

由表4 可知，pH 差異不顯著（P>0.05），處理組的NH3-N 含量均顯著低于CK 組（P<0.05），其中，Ta 組NH3-N 含量顯著低于Lp、Ce、Lp+Ce 組，顯著高于Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta組（P<0.05）。

表4 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵pH和NH3-N影響

2.2 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵VFA含量的影響

由表5 可知，與CK 組相比，Ce、Ce+Lp、Ce+Ta、Ce+Lp+Ta組的乙酸/丙酸顯著降低（P<0.05）。Ce+Ta、Ce+Lp+Ta 組的丁酸含量顯著低于Ce、Ce+Lp 組，且顯著高于其他處理組（P<0.05）。Ce、Ce+Lp 組的戊酸含量顯著高于其他處理組（P<0.05）。Ta 組的TVFA顯著低于CK、Ce、Lp、Ce+Lp、Lp+Ta、Ce+Lp+Ta組（P<0.05）。

2.3 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

由表6 可知，發(fā)酵24 h 時(shí)，CK、Ce、Lp+Ce 組的產(chǎn)氣量顯著高于其他各處理組（P<0.05），發(fā)酵36、48 h時(shí)，CK、Lp、Ce、Lp+Ce 組的產(chǎn)氣量均顯著高于Ta、Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta組（P<0.05）。

表6 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響（mL）

2.4 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯的體外發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

由表7可知，Ta、Lp+Ta、Lp+Ce+Ta組的DMD顯著低于CK、Lp、Ce 組（P<0.05）；Ta、Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta組的CPD顯著低于CK、Lp、Ce、Lp+Ce組（P<0.05）；Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta組的NDFD分別顯著低于Lp、Ce組（P<0.05），其中，Lp組的NDFD最高；CK、Lp、Ce、Ta組的ADFD顯著高于其他處理組（P<0.05）。

表7 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響（%）

3 討論

3.1 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯樣的體外發(fā)酵pH和NH3-N的影響

瘤胃pH 的變化與反芻動(dòng)物瘤胃微生物代謝、瘤胃中營養(yǎng)物質(zhì)的消化等有關(guān)，瘤胃內(nèi)VFA含量直接影響pH[12]。同時(shí)，pH 的變化影響瘤胃微生物菌群的多樣性及瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[13]。瘤胃液pH 在5.00～7.50屬于正常范圍[14]。本試驗(yàn)中，各處理組體外發(fā)酵液pH 均在正常范圍內(nèi)，說明添加不同添加劑對瘤胃發(fā)酵無不利影響。NH3-N 能夠反映蛋白在瘤胃內(nèi)的降解速率，CP 降解產(chǎn)生NH3-N，瘤胃微生物將其轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，高博蘭等[15]研究表明反芻動(dòng)物瘤胃微生物NH3-N適宜含量為6～30 mg/dL，在此范圍內(nèi)表明蛋白質(zhì)合成與分解處于平衡狀態(tài)，含量高則表明蛋白在瘤胃內(nèi)的降解速度快。但超過或低于正常范圍均不利于瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，影響瘤胃內(nèi)微生物生長。本試驗(yàn)中，各處理組的NH3-H 顯著低于CK 組，其中，添加單寧處理組的NH3-H 含量顯著降低，說明單寧對NH3-N 的降低有積極作用。這可能是因?yàn)闇p少了CP 在瘤胃內(nèi)的降解。單寧一方面與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，蛋白酶不能將單寧蛋白質(zhì)絡(luò)合物中蛋白質(zhì)的脫氨基作用減弱，無法將其水解，降低了發(fā)酵中NH3-N的含量，另一方面，單寧抑制了瘤胃內(nèi)革蘭氏陽性菌的生長，進(jìn)一步降低了蛋白質(zhì)分解和脫氨基的速率。本試驗(yàn)中，各組瘤胃微生物NH3-N含量皆在8～15 mg/dL之間，在反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵的適宜范圍內(nèi)。相對而言，添加單寧對NH3-N 形成的抑制作用更大，所以在飼草中添加單寧能夠有效阻止CP 在瘤胃內(nèi)的降解，提高CP在體內(nèi)的利用率。

3.2 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵VFA含量的影響

VFA 為瘤胃提供70%～80%的能量需求。瘤胃內(nèi)發(fā)酵底物的組成，降解速率及瘤胃內(nèi)微生物的種類均對VFA 的產(chǎn)生有影響[16]。不同添加劑會(huì)影響發(fā)酵底物的營養(yǎng)組成和瘤胃微生物，進(jìn)而對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的VFA造成一定影響。瘤胃VFA含量的變化，會(huì)影響瘤胃中氮代謝過程及瘤胃pH[17]。發(fā)酵底物富含纖維性碳水化合物利于乙酸發(fā)酵，丙酸發(fā)酵底物主要是非纖維性碳水化合物。從乙丙比可以推測瘤胃的發(fā)酵類型。本試驗(yàn)中，Ce、Lp+Ce、Ce+Ta、Ce+Lp+Ta 組的乙酸/丙酸顯著低于對照組，這是可能是因?yàn)槔w維素酶能夠降解發(fā)酵底物中的纖維，使得瘤胃對纖維性碳水化合物的利用減少，進(jìn)而產(chǎn)生的乙酸降低。李巖等[18]研究表明，添加纖維素酶能降低小麥秸稈體外發(fā)酵中的乙丙比，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。丁酸能夠刺激胃上皮細(xì)胞成熟，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收[19]。Ce、Lp+Ce 組的丁酸含量顯著高于其他處理組，表明添加植物乳桿菌能夠增加發(fā)酵過程中丁酸的含量。加入單寧后，抑制了丁酸的生成，但與對照組和單獨(dú)添加纖維素酶或植物乳桿菌的處理組相比還是有顯著促進(jìn)作用。相對而言，添加單寧能夠降低總酸含量，提升乙丙比。

3.3 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量可綜合反映瘤胃微生物對青貯的消化利用程度[20]，而且降低產(chǎn)氣量，可以預(yù)防膨脹病的發(fā)生[21]。王滿紅等[22]研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)增加，產(chǎn)甲烷菌增多，產(chǎn)氣量也隨著菌的增多而隨之增加。本試驗(yàn)中，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，產(chǎn)氣量呈增長趨勢。發(fā)酵48 h時(shí)，纖維素酶和植物乳桿菌對產(chǎn)氣量均無顯著影響，不添加單寧時(shí)，Lp+Ce 組的產(chǎn)氣量最少的，這可能是因?yàn)長p+Ce 組的纖維含量低，CP 含量高。單寧能顯著降低瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的。這可能與單寧降低甲烷排放和抑制微生物生長的作用相關(guān)。瘤胃在進(jìn)行消化時(shí)會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性氣體，在甲烷菌的作用下，還會(huì)產(chǎn)生甲烷。單寧能抑制甲烷菌的活性，從而降低甲烷的排放。丁學(xué)智[23]研究單寧對體外瘤胃發(fā)酵特性的影響，結(jié)果表明單寧酸對甲烷產(chǎn)量的抑制作用隨著單寧添加濃度的增加而增強(qiáng)。劉立成等[24]將單寧酸作為飼料補(bǔ)充劑，發(fā)現(xiàn)可以顯著降低奶牛甲烷產(chǎn)氣量。另一方面，單寧可能抑制甲烷菌的生長，降低甲烷產(chǎn)生，從而減少產(chǎn)氣量。

3.4 不同添加劑對紫花苜蓿與花生秧混合青貯體外發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

飼料的養(yǎng)分被機(jī)體消化吸收的程度可通過瘤胃DM 消化率衡量,其消化率與利用率呈正相關(guān)[25]，飼料的消化程度可通過中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解率衡量[26]。牧草消化程度越高，NDF 瘤胃降解率越高，說明瘤胃發(fā)酵狀態(tài)越好[27]。在本試驗(yàn)中，單獨(dú)添加植物乳桿菌組的DM 和NDF 消化率最高，這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌能改變青貯中纖維素的總體結(jié)構(gòu)，在瘤胃中繼續(xù)水解剩余的纖維素，進(jìn)一步提高纖維降解率，進(jìn)而有效增加了青貯飼糧的DMD 和NDFD。添加纖維素酶對NDFD 無顯著影響，這可能是因?yàn)橐紫腘DF 被溶解，但NDF 的潛在消化率并未增加[28]。由于NDF 在飼料中的含量和消化率決定了有機(jī)物的消化率，所以纖維素酶對NDF含量的最終影響可能會(huì)改變最終青貯的能值[29]。本試驗(yàn)中,添加植物乳桿菌和纖維素酶對CP 消化率沒有顯著影響。添加單寧后，各營養(yǎng)成分的瘤胃降解率均有一定的降低，對CP消化率的影響顯著。飼料中蛋白質(zhì)大多以含氮化合物的形式存在于細(xì)胞內(nèi)的組織液中，因此飼草細(xì)胞壁的纖維結(jié)構(gòu)也會(huì)影響蛋白質(zhì)的降解程度[30]。CP 的瘤胃降解率也受蛋白質(zhì)在瘤胃中滯留的時(shí)間、組分以及含量等因素的影響[31]。Satter[32]還特別指出飼料粗蛋白降解率受飼料本身的特性的影響比較大，粗蛋白的迅速降解部分、粗蛋白的慢降解部分以及粗蛋白的不易降解部分在各種飼料中的比重不同。添加單寧后，各組的CP 消化率均顯著降低，這可能與發(fā)酵底物中結(jié)合蛋白質(zhì)含量（PC）有關(guān)，添加單寧后，單寧與蛋白質(zhì)結(jié)合形成絡(luò)合物，導(dǎo)致PC 含量增加，該部分蛋白不能在瘤胃內(nèi)降解，所以，CP消化率因此降低。

4 結(jié)論

乳酸菌、纖維素酶和單寧對苜蓿與花生秧混合青貯后瘤胃降解特性和營養(yǎng)物質(zhì)降解率均有不同程度的影響。綜合評價(jià)來看，單寧對苜蓿與花生秧混合青貯飼料體外發(fā)酵有抑制作用，添加植物乳桿菌和纖維素酶能夠緩解單寧的抑制作用。