朱文瑞,王鐵烽,徐洪鋒

朱文瑞,王鐵烽,徐洪鋒,紹興市中醫(yī)院中藥劑科 浙江省紹興市 312000

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種以腹痛、腹瀉、膿血便等腸道癥狀為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1].目前,UC的西藥治療以5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制和生物制劑為主,但長(zhǎng)期應(yīng)用易出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)、藥物依賴(lài)及停藥后易復(fù)發(fā)等問(wèn)題[2,3],而類(lèi)似糞菌移植[4]、干細(xì)胞移植[5]等治療手段多僅在臨床起步階段,價(jià)格昂貴且療效欠穩(wěn)定.中醫(yī)藥治療UC有其特有的優(yōu)勢(shì)[6],從中醫(yī)藥寶庫(kù)中挖掘安全有效的UC治療手段迫在眉睫.“黃連-木香-肉豆蔻”(Huanglian-Muxiang-Roudoukou,HMR)組方出自經(jīng)典名方豆蔻香連丸,據(jù)記載可用于“治泄瀉,腹痛,不拘寒熱赤白.”,其治療癥狀與UC的臨床表現(xiàn)大體相符.進(jìn)一步通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘分析姚乃禮等[7-9]全國(guó)名老中醫(yī)在治療UC方面的用藥規(guī)律,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連、木香、肉豆蔻是臨證治療中的高頻藥物.姚乃禮教授[10]、謝晶日教授[11]在治療UC的經(jīng)驗(yàn)方中,用HMR以清腸燥濕,澀腸止瀉.綜上所述,HMR是中醫(yī)藥治療UC的常用藥物組合,但其治療UC的主要成分及潛在作用機(jī)制尚不明確,導(dǎo)致其在臨床中的使用受到限制.中藥復(fù)方成分多,靶點(diǎn)復(fù)雜,既往逐一靶點(diǎn)驗(yàn)證的研究方式太過(guò)于繁瑣,需要消耗大量的人力及物力,無(wú)法全面性地探索藥物機(jī)制.基因表達(dá)譜、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)的出現(xiàn),使系統(tǒng)全面分析探索中藥治療疾病的機(jī)制實(shí)現(xiàn)了可能.因此,本文利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)中的芯片數(shù)據(jù)挖掘與UC發(fā)病相關(guān)的特異性表達(dá)基因,獲取健康人群和UC患者的核心差異表達(dá)基因,再運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)HMR治療UC的可能作用機(jī)制,以期為該組方的進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 UC差異表達(dá)基因分析:在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞檢索與UC相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),選取人類(lèi)正常樣本及UC患者樣本均大于10的GEO數(shù)據(jù)芯片,下載其對(duì)應(yīng)的結(jié)果矩陣(Matrix)與平臺(tái)注釋文件(Platforms),數(shù)據(jù)整理分組后導(dǎo)入R軟件,利用Limma包以|lgFC|＞1(FC表示差異倍數(shù))、P＜0.05為條件篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并分別繪制差異基因火山圖和排名前40位差異基因的熱圖.

1.2 方法

1.2.1 HMR中活性成分及靶點(diǎn)篩選:利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)分別以“肉豆蔻”、“黃連”及“木香”為關(guān)鍵詞搜集HMR中各個(gè)中藥的化學(xué)成分,設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類(lèi)藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18為條件,篩選出符合條件的活性成分和其所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息.借助UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/),限定物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行基因名匹配及標(biāo)準(zhǔn)化處理.

1.2.2 “中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的建立:將篩選得到的藥物靶點(diǎn)基因與疾病差異基因相互映射,得到交集基因,并查找與之相對(duì)應(yīng)的有效成分,將搜集到的中藥、活性成分、疾病、靶標(biāo)蛋白中的基因依次輸入,利用Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò).

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)的建立:將“1.2.2”項(xiàng)得到的交集基因?qū)隨TRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),物種選擇人類(lèi),設(shè)置相互作用閾值為“medium confidence(置信度＞0.400)”,隱藏沒(méi)有相互聯(lián)系的節(jié)點(diǎn),將蛋白互作關(guān)系結(jié)果通過(guò)Cytoscape3.9.1軟件中進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),借助cytoCNA插件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析,計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)、介度中心性(betweenness centrality,BC)和緊密中心性(closeness centrality,CC)值,并以Degree、BC和CC的中位數(shù)值作為節(jié)點(diǎn)重要性的量化參考[12,13],篩選核心靶點(diǎn).

1.2.4 生物學(xué)功能富集分析:將“1.2.2”項(xiàng)得到的交集基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/),設(shè)置P＜0.01,限定物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)富集分析.

1.2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證:從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中下載核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),利用PyMOL 2.2軟件除去水分子,分離原配體,保存后導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.6軟件中加氫、計(jì)算總電荷、設(shè)置原子類(lèi)型,保存為“pdbqt”格式.從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載上述篩選得到的核心成分(配體)的mol2結(jié)構(gòu),利用Autodock Tools 1.5.6軟件設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式文件,最后利用Autodock-vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接,在PyMOL下實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果可視化,繪制對(duì)接相互作用模式圖.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R4.1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析組間差異,組間兩兩比較用最小顯著性差異法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 UC差異基因分析 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇編號(hào)為GSE87473基因表達(dá)譜數(shù)據(jù).該芯片數(shù)據(jù)所采用的平臺(tái)為GPL13158[HT_HG-U133_Plus_PM] Affymetrix HT HGU133+PM Array Plate,包含了21例健康受試者和87例成人UC患者的結(jié)腸黏膜組織樣本,以|lgFC|＞1、P＜0.05為條件共篩選出差異表達(dá)基因967個(gè),其中上調(diào)基因619個(gè)下調(diào)基因348個(gè).篩選所得差異基因即為UC相關(guān)的基因差異基因,UC差異基因的火山圖及熱圖見(jiàn)圖1.

圖1 UC差異基因分析.A:火山圖;B:熱圖.紅色:上調(diào)基因;綠色:下調(diào)基因;黑色:無(wú)差異基因;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;FC:差值倍數(shù).

2.2 活性成分篩選及其作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 根據(jù)限定條件,從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集到肉豆蔻主要活性成分9個(gè)、木香主要活性成分6個(gè)、黃連主要活性成分14個(gè),共得到HMR的主要活性成分29個(gè),見(jiàn)表1.根據(jù)篩選所得的活性成分,獲得其所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù),刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到163個(gè)有效靶點(diǎn)基因.

表1 HMR主要活性成分信息

2.3 “中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的建立 將藥物靶點(diǎn)基因與疾病差異基因相互映射,共得到28個(gè)交集基因,并查找與之對(duì)應(yīng)的有效成分,共得到24個(gè)有效成分,其中黃連10個(gè)、木香6個(gè)、肉豆蔻8個(gè).運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2.圖中共有54個(gè)節(jié)點(diǎn)和111條邊線(xiàn),運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得到各節(jié)點(diǎn)Degree值,其值越大意味著該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮越重要的作用.通過(guò)計(jì)算結(jié)果可知:Degree值排名前5位的活性成分為槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、berberine(小檗堿)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、palmatine(巴馬汀).

圖2 HMR治療UC的“中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖.HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;MMP3:基質(zhì)金屬蛋白酶3;MMP1:基質(zhì)金屬蛋白酶1;GJA1:縫隙連接蛋白α;IL-6:白介素6;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細(xì)胞間黏附分子-1;Fos:原癌基因蛋白;EGF:表皮生長(zhǎng)因子;DUOX2:雙氧化酶;CXCL2:CXC趨化因子配體2;CXCL11:CXC趨化因子配體11;CXCL10:CXC趨化因子配體10;CCL2:CC趨化因子配體2;BCL2:結(jié)合蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2;VCAM1:血管細(xì)胞粘附分子1;TNF:腫瘤壞死因子;THBD:血栓調(diào)節(jié)素;STAT1:信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1;SPP1:分泌磷蛋白1;SELE:E選擇素;PTGS2:環(huán)加氧酶2;PPARg:過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ;PLAU:尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子;PCOLCE:前膠原C-蛋白酶增強(qiáng)蛋白;NR3C2:核受體亞家族C組成員2;NOS2:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;NFKBIA:核因子κB抑制劑α.

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立 基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/)分析HMR治療UC的靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用,得到的PPI網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖3.通過(guò)Cytoscape軟件及內(nèi)置的Cyto NCA模塊進(jìn)行可視化呈現(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白,邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián),Degree值越大,則對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)越大和顏色越濃.該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及26個(gè)節(jié)點(diǎn)、224條邊,經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果后,以Degree、BC和CC的均大于其相應(yīng)的中位數(shù)值為條件[12-14],并按照Degree值由大到小排序,篩選出白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、CC趨化因子配體2[chemokine (C-C motif) ligand 2,CCL2]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)共11個(gè)核心靶點(diǎn).

圖3 HMR治療UC的PPI網(wǎng)絡(luò).HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;PPI:蛋白互作;Degree:度值;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;MMP3:基質(zhì)金屬蛋白酶3;MMP1:基質(zhì)金屬蛋白酶1;GJA1:縫隙連接蛋白α;IL-6:白介素6;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細(xì)胞間黏附分子-1;Fos:原癌基因蛋白;EGF:表皮生長(zhǎng)因子;DUOX2:雙氧化酶;CXCL2:CXC趨化因子配體2;CXCL11:CXC趨化因子配體11;CXCL10:CXC趨化因子配體10;CCL2:CC趨化因子配體2;VCAM1:血管細(xì)胞粘附分子1;TNF:腫瘤壞死因子;THBD:血栓調(diào)節(jié)素;STAT1:信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1;SPP1:分泌磷蛋白1;SELE:E選擇素;PTGS2:環(huán)加氧酶2;PPARg:過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ;PLAU:尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子;NR3C2:核受體亞家族C組成員2;NOS2:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;NFKBIA:核因子κB抑制劑α.

2.5 生物學(xué)功能富集分析 運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)將28個(gè)藥物靶點(diǎn)基因與UC疾病差異基因的交集基因進(jìn)行GO功能富集分析,主要包括生物過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC),篩選各項(xiàng)排列前5的條目所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)具有的功能信息,繪制氣泡圖,見(jiàn)圖4.由圖4可知,HMR治療UC的BP主要涉及脂多糖刺激變化過(guò)程、對(duì)神經(jīng)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、對(duì)輻射的反應(yīng)、對(duì)肽的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等;MF主要涉及細(xì)胞因子活性、整合素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合等;CC主要涉及質(zhì)膜外側(cè)面、膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔等.運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG功能富集分析,篩選排列前10的條目所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)具有的功能信息,繪制氣泡圖,見(jiàn)圖5.由圖5可知,HMR治療UC靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的通路主要有TNF信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號(hào)通路等.

圖4 HMR治療UC的GO分析.HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;GO:基因本體;BP:生物過(guò)程;MF:分子功能;CC:細(xì)胞組分.

圖5 HMR治療UC的KEGG分析.HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;KEGG:京都基因與基因組百科全書(shū);TNF:腫瘤壞死因子;HIF-1:缺氧誘導(dǎo)因子1.

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 將“2.4”項(xiàng)下“中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前5的活性成分,與“2.5”項(xiàng)下PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前5的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,計(jì)算活性成分與核心靶點(diǎn)間的結(jié)合能,結(jié)果見(jiàn)表2.結(jié)合能值越小表示結(jié)合能越高,活性成分越容易與蛋白結(jié)合,結(jié)合能-5.0 kcal/mol表明兩者之間結(jié)合活性較好;小于-7.0 kcal/mol表明兩者之間有很強(qiáng)結(jié)合活性[15].然后再分別選取結(jié)合能最低的成分,并用PyMol軟件對(duì)其對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示,見(jiàn)圖6.

圖6 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接模式.綠色:配體;黃色:與配體對(duì)接的氨基酸殘基;紅色虛線(xiàn):氫鍵;IL-1β:白介素1β;IL-6:白介素6;CCL2:趨化因子配體2;TNF:腫瘤壞死因子;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表2 分子對(duì)接結(jié)果

對(duì)接結(jié)果顯示,槲皮素、豆甾醇、小檗堿、β-谷甾醇、巴馬汀與關(guān)鍵靶點(diǎn)IL6、CCL2、TNF、IL-1β、MMP9的結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1,說(shuō)明活性成分與靶點(diǎn)之間具有較好結(jié)合活性,槲皮素與MMP9,β-谷甾醇與TNF的結(jié)合能小于9.0 kcal·mol-1,說(shuō)明兩者之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性.分子對(duì)接可視化分析研究發(fā)現(xiàn),槲皮素通過(guò)氨基酸殘基Q227、A242、R249與MMP9形成3條氫鍵,β-谷甾醇通過(guò)氨基酸殘基TYR-119與TNF形成1條氫鍵,β-谷甾醇通過(guò)氨基酸殘基GLY-44、PHE-96、PHE-98、TRP-47與MMP9形成4條氫鍵,并且上述配體化合物均能良好地包埋在受體靶蛋白的活性口袋中.

3 討論

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn),傳統(tǒng)的藥理學(xué)方法不能系統(tǒng)闡述其治療UC的作用機(jī)制.隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)因能多系統(tǒng)闡述藥理作用機(jī)制,與中醫(yī)整體觀(guān)相契合而被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥治療疾病作用機(jī)制研究[16,17].為了更好地挖掘和利用我國(guó)豐富的中醫(yī)藥資源,本文立足于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)地探討HMR治療UC的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制.

本研究發(fā)現(xiàn)HMR中含有的槲皮素、豆甾醇、小檗堿、β-谷甾醇和巴馬汀等為治療UC的主要活性成分.研究表明[18],槲皮素通過(guò)誘導(dǎo)緊密連接蛋白修復(fù)UC模型小鼠的的腸上皮細(xì)胞,并顯著降低腸道炎癥損傷;豆甾醇在結(jié)腸炎中通過(guò)激活丁酸-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ軸修復(fù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與輔助性T細(xì)胞17平衡,可抑制模型小鼠血液中炎癥細(xì)胞增殖,有效控制結(jié)腸組織損傷[19];β-谷甾醇以濃度依賴(lài)的方式降低UC模型小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平,并且β-谷甾醇可顯著增加腸道上皮細(xì)胞抗菌肽的表達(dá),降低致病菌(含傷寒沙門(mén)氏菌等)的存活率[20];小檗堿以微生物依賴(lài)的方式恢復(fù)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC小鼠炎癥,并且小檗堿通過(guò)維持腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)節(jié)腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)來(lái)發(fā)揮對(duì)結(jié)腸的保護(hù)作用[21-23];巴馬汀通過(guò)抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體的活化,降低UC小鼠結(jié)腸中髓過(guò)氧化物酶、IL-1β、TNF-α的水平[24].以上結(jié)果表明從HMR中的篩選得到的多種活性成分在治療UC方面發(fā)揮著重要的作用.

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn),HMR治療UC核心靶點(diǎn)有IL-1β、IL-6、CCL2、TNF、MMP9等.炎癥反應(yīng)是UC病理生理基礎(chǔ),炎癥因子在UC腸道炎癥持續(xù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.研究發(fā)現(xiàn),UC發(fā)病期間IL-1β分泌增加直接介導(dǎo)了UC初期炎癥的發(fā)生,且IL-1β分泌過(guò)多可激活樹(shù)突樣細(xì)胞、促進(jìn)白細(xì)胞介素-2受體過(guò)表達(dá),加重結(jié)腸黏膜局部的炎癥反應(yīng);IL-6分泌增加影響腸上皮細(xì)胞電解質(zhì)分泌紊亂,介導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)[26,27].TNF-α參與細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng),在UC患者受損腸黏膜中呈高水平表達(dá),誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞大量凋亡,從而增加腸道上皮細(xì)胞通透性[28-30].CCL2是一種重要的趨化因子[31],腸道炎癥時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞在TNF-α、IL-1等炎性因子刺激下會(huì)大量釋放CCL2,而該趨化因子可高度特異性地激活并趨化淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向正常腸黏膜組織聚集,并促進(jìn)這些免疫細(xì)胞潛入發(fā)炎的腸黏膜組織,進(jìn)而使腸黏膜發(fā)生更嚴(yán)重的免疫炎性損害[32].此外,一項(xiàng)臨床發(fā)現(xiàn)[33]MMP9在活動(dòng)性UC患者結(jié)腸黏膜中持續(xù)高表達(dá),而活化的MMP9可分解多種蛋白底物,甚至導(dǎo)致抗TNF藥物無(wú)效.近年來(lái)有學(xué)者提出,高效且高選擇性的MMP抑制劑的研發(fā)或?qū)⒊蔀閁C生物制劑研發(fā)的新方向[34].上述結(jié)果提示PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)在UC的調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答上有著重要作用,表明HMR治療UC主要通過(guò)上述多靶點(diǎn)發(fā)揮作用.

KEGG富集分析顯示,HMR治療UC主要涉及的通路為炎癥反應(yīng)及腸黏膜免疫相關(guān)通路,如TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等.本研究發(fā)現(xiàn),在HMR治療UC中TNF信號(hào)通路的基因數(shù)富集最多且表達(dá)顯著.TNF信號(hào)通路可通過(guò)影響腸黏膜T細(xì)胞的活化、增殖,促進(jìn)Th1細(xì)胞的極化及效應(yīng)功能,上調(diào)γ干擾素的表達(dá),從而促進(jìn)腸黏膜的炎癥反應(yīng)[35].同時(shí),還可作用于輔助性T細(xì)胞17使其分泌白介素17(interleukin-17,IL-17)增加,導(dǎo)致腸黏膜免疫失調(diào)引發(fā)腸道炎癥反應(yīng).此外,TNF信號(hào)通路還能激活下游NF-κB通路,促進(jìn)IL-lβ、IL-6、IL-17等炎癥因子釋放[36],而這些炎癥因子又可以反作用于NF-κB信號(hào)通路,調(diào)控多種炎癥因子相關(guān)基因,進(jìn)一步加重腸道炎癥反應(yīng).GO富集分析顯示,HMR治療UC與脂多糖刺激變化等生物過(guò)程有關(guān),且多發(fā)生在細(xì)胞的質(zhì)膜外側(cè)面、膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)區(qū)域,通過(guò)影響細(xì)胞因子活性、整合素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等分子功能發(fā)揮作用.本研究通過(guò)GO、KEGG富集分析證明HMR治療UC是多個(gè)分子、多條信號(hào)通路對(duì)多種細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)的結(jié)果.

4 結(jié)論

綜上所述,HMR可能是通過(guò)槲皮素、豆甾醇及小檗堿等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶點(diǎn),調(diào)節(jié)TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路等多種信號(hào)通路,從抗炎和調(diào)節(jié)腸道免疫等方面發(fā)揮對(duì)UC的治療作用.本次分析結(jié)果表明HMR治療UC的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制,為今后臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供了一定的思路和參考.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病,常反復(fù)發(fā)作,纏綿難愈,多數(shù)需要終身用藥維持.長(zhǎng)期使用抗UC藥物可引發(fā)藥物不良反應(yīng).隨著中醫(yī)治療的發(fā)展,越來(lái)越多的中藥方劑在治療UC上展現(xiàn)出了較好的療效.“黃連-木香-肉豆蔻”(Huanglian-Muxiang-Roudoukou,HMR)是眾多名老中醫(yī)治療UC的常用組方,研究其抗UC機(jī)制有助于藥物開(kāi)發(fā)和推廣.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

探索HMR治療UC的作用機(jī)制,以期為該組方的進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用提供參考.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

通過(guò)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)中的基因芯片分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法探究HMR治療UC的潛在分子機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

采用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取UC芯片數(shù)據(jù),運(yùn)用R語(yǔ)言綜合分析篩選出疾病差異表達(dá)基因,獲得UC的疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù);利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)分別檢索HMR的活性成分及其作用靶點(diǎn);取疾病差異表達(dá)基因與藥物作用靶點(diǎn)間的交集基因,通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?以此篩選出主要活性成分及核心靶點(diǎn);同時(shí)利用Metascapes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路;最后使用AutoDock vina軟件對(duì)主要活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

共篩選得到UC差異表達(dá)基因967個(gè),HMR活性成分29種,對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)163個(gè).“中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中有活性成分24個(gè),主要活性成分涉及槲皮素、豆甾醇、小檗堿、β-谷甾醇、巴馬汀等;蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中有蛋白26個(gè),核心靶點(diǎn)涉及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、CC趨化因子配體2[chemokine (C-C motif) ligand 2,CCL2]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)等;GO富集分析主要涉及脂多糖刺激變化等生物過(guò)程,質(zhì)膜外側(cè)面等細(xì)胞成分,細(xì)胞因子活性等分子功能;KEGG通路分析主要涉及TNF信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號(hào)通路等;運(yùn)用分子對(duì)接模擬證實(shí)排名前5的主要活性成分與核心靶點(diǎn)之間均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選及預(yù)測(cè),HMR可能是通過(guò)槲皮素、豆甾醇及小檗堿等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶點(diǎn),調(diào)節(jié)TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、TLRs信號(hào)通路等多種信號(hào)通路,進(jìn)而影響UC涉及的炎癥、腸道免疫等多種方式,來(lái)發(fā)揮改善UC的作用.

展望前景

基于以上分析,HMR治療UC是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路的,也提示中藥的研究是較為復(fù)雜的,需要從多維度、多靶點(diǎn)進(jìn)行研究.基于生物信息學(xué)方法,本研究初步揭示了HMR治療UC相關(guān)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜關(guān)系,也挖掘了其潛在治療靶點(diǎn)及可能參與機(jī)制.但對(duì)于HMR整體治療UC的機(jī)制仍是初步的,考慮到具體到臨床中的個(gè)人更為復(fù)雜,如藥物的劑量、煎煮方法、劑型等不同,會(huì)起到不一樣的臨床療效.因此,基于以上不足,仍需進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證和闡明HMR治療UC的作用機(jī)制.