梁秋楊，白新鵬,*，李國勝，常會敏，朱恒偉，橋振栓，黃桂花

1. 海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心，海南?？?570228；2. ?？谥仓厣镔Y源研究所有限公司，海南?？?570000；3. 海南北緯十八度食品科學(xué)有限公司，海南東方 572633

火龍果（Hylocereus undatus）屬仙人掌科多年生攀援植物，是一種營養(yǎng)豐富的熱帶經(jīng)濟水果，在我國臺灣、廣西、廣東、海南以及福建等?。▍^(qū)）有較大規(guī)模種植面積[1]?；瘕埞o生長茂盛，為了保證果實品質(zhì)，需要不斷修剪枝條，加上果實采摘后產(chǎn)生的大量根莖，這些果莖如果僅作為廢棄物處理，不但提高了火龍果生產(chǎn)加工成本，還導(dǎo)致環(huán)境污染[2]。因此，為提升火龍果的經(jīng)濟附加值，減少資源浪費，對火龍果莖進行開發(fā)利用具有重要意義。

火龍果莖多糖（pitaya stem polysaccharide,PSP）作為天然活性多糖的一種，是火龍果莖的重要活性成分之一，具有抗氧化、調(diào)節(jié)腸道等生物功能，能夠提高機體免疫力[3]。目前火龍果莖多糖的研究方向較多集中于提取、純化以及抗氧化活性檢測。李國勝等[4]比較了3種多糖提取方法，其中亞臨界水提取得率為20.53%，遠高于熱水提取和超聲輔助提取的得率，這一結(jié)果和馬若影[5]用亞臨界與微波輔助和超聲微波協(xié)同提取比較得出的結(jié)論相似，說明亞臨界水提取要比其他提取方法更高效；王超雪[6]利用超濾膜截留[7]和分子篩凝膠柱層析[8]純化得到不同分子量的多糖成分，這些多糖組分濃度變化對其抗氧化活性影響較大。此外，有研究指出，利用火龍果莖多糖的生物活性應(yīng)用于美容護膚上開發(fā)出的產(chǎn)品，具有一定的獨特效果。唐雅園等[9]在制備護手霜時發(fā)現(xiàn)，添加火龍果莖多糖的護手霜，其DPPH自由基清除能力隨著添加量的提高而顯著增強，與未添加樣品相比，護手霜的保濕率提高了20%以上，且添加多糖不會改變護手霜的穩(wěn)定性，這是由多糖流變學(xué)性質(zhì)所決定的。

除以上研究外，對于火龍果莖多糖在機體免疫調(diào)節(jié)方面的研究尚未報道。植物多糖具有顯著的免疫活性，能促使機體免疫器官正常生長，提升淋巴細胞增殖能力，通過調(diào)節(jié)紅細胞免疫，影響蛋白質(zhì)和抗體產(chǎn)生，從而影響機體免疫信息[10-12]。據(jù)研究表明，孫加燕等[13]研究發(fā)現(xiàn)瑪咖多糖濃度在0.1~10.0 mg/L范圍內(nèi)能促進大鼠上皮細胞增殖，在10.0 mg/L濃度時能促進上皮細胞遷移，這一結(jié)果和CHEN等[14]研究得出的瑪咖多糖具備調(diào)節(jié)機體免疫功能的觀點基本一致。YIN等[15]從海藻中提取的多糖具有調(diào)節(jié)機體腸道菌群和免疫應(yīng)答等活性功能，劉紅萍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量白芷多糖處理可增強免疫低下小鼠的先天免疫功能，也可以促進小鼠脾淋巴細胞增殖。

基于以上研究基礎(chǔ)，本研究以Balb/c小鼠為實驗動物，對火龍果莖多糖樣品進行毒性評價，探究火龍果莖多糖對體外小鼠淋巴細胞增殖效應(yīng)，及其對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠細胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響，旨在明確火龍果莖多糖是否具有免疫調(diào)節(jié)活性，為火龍果莖多糖開發(fā)為功能產(chǎn)品提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮火龍果莖由海南省東方市北緯十八度果業(yè)有限公司提供。

實驗動物：Balb/c小鼠，雌性，55只，每只18~20 g。小鼠SPF環(huán)境飼養(yǎng)，正常供食供水（動物實驗過程獲得海南大學(xué)和海南醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)）。

RPMI-1640培養(yǎng)液：RPMI-1640（Gibco），NaHCO3；HEPES，丙酮酸鈉110，青霉素鈉，硫酸鏈霉素，2-ME，胎牛血清（FBS）10%；磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）；紅細胞裂解液：NH4Cl，KHCO3，EDTA（pH 7.6）；環(huán)磷酰胺（cytoxan,CTX），江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；刀豆球蛋白A（concanavalin A, ConA）（Sigma）；脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）（Sigma）；CCK-8檢測試劑盒（美侖生物）。

1.2 方法

1.2.1 體外小鼠淋巴細胞增殖效應(yīng)檢測 （1）火龍果莖多糖制備與配制。多糖制備：清洗干凈的新鮮火龍果莖剖切去刺去芯，切成小塊取200 g，在2.0 MPa，120 s的條件下進行汽爆，汽爆后使用紗布分離固體殘渣，8000 r/min離心15 min，除掉沉淀，通過旋蒸濃縮上清液至1/4，按4倍體積加入95%乙醇于4 ℃低溫醇沉，醇沉后6000 r/min離心10 min，取沉淀凍干，得到粗多糖PSP-1，得率為2.18%，PSP-1中總糖含量為44.64%，按馬若影[5]的多糖純化方法，利用大孔樹脂對PSP-1進行脫色除蛋白得到純化多糖PSP-2，PSP-2在PSP-1組分中約占1/5。

多糖配制：稱取33.8 mg PSP-1加至676 μL二甲基亞砜（DMSO）中配成濃度為50 mg/mL的溶液，稱取6.9 mg PSP-2加至690 μL DMSO中配成濃度為10 mg/mL的溶液，二者均無法完全溶解，靜置有棕黃色沉淀物質(zhì)，通過渦旋和冰浴超聲助溶后可以成為混懸狀態(tài)，由于無法確定未溶物的質(zhì)量，故后續(xù)實驗先混懸再吸取使用。在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中將PSP-1多糖DMSO溶液配制成濃度為200 μg/mL，PSP-2多糖DMSO溶液配制成濃度為40 μg/mL，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將待測樣品稀釋至所需樣品液濃度。

因PSP-2在PSP-1組分中約占1/5，故設(shè)置PSP-1體外劑量為PSP-2的5倍，則最終PSP-1的培養(yǎng)濃度為50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.000 05 μg/mL；PSP-2的培養(yǎng)濃度為10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 μg/mL。顯微鏡下觀察均未出現(xiàn)明顯不溶物顆粒。

（2）小鼠淋巴細胞的制備。脫脊椎處死5只Balb/c小鼠，無菌環(huán)境下取脾臟進行破碎，過膜，于4 ℃，1200 r/min離心5 min，離心沉淀加入紅細胞裂解液約1 mL，混勻，靜置30 s；加入PBS，終止紅裂，離心，循環(huán)2次；洗滌2次剩余細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液將細胞懸至5 mL，對細胞樣品進行活細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為4×106個/mL。

（3）淋巴細胞增殖活性檢測。①對淋巴細胞毒性濃度排除。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL各組細胞樣品懸液，50 μL培養(yǎng)液，50 μL各濃度待測多糖培養(yǎng)液，總體積200 μL。每個樣品設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)4孔加培養(yǎng)液作為正常對照組，2孔無細胞等體積培養(yǎng)液作為本底空白對照。細胞于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前12 h每孔加入10 μL CCK-8溶液。測定時將標(biāo)記的細胞樣品用全波長酶標(biāo)儀在450 nm處讀取OD值，以正常對照組細胞生存率為100%，空白對照組作為本底扣除，即0%，計算待測樣品組細胞生存比率。②對T、B淋巴細胞增殖活性效應(yīng)的評價。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL各組細胞樣品懸液，50 μL有絲分裂原（ConA終濃度1 μg/mL或LPS終濃度2 μg/mL），50 μL各濃度待測多糖培養(yǎng)液，總體積200 μL。每個樣品設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)4孔僅加有絲分裂原不加待測多糖培養(yǎng)液作為細胞增殖的陽性對照，另設(shè)4孔不加有絲分裂原作為細胞增殖的陰性對照。細胞于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前12 h每孔加入10 μL CCK-8溶液。測定時將標(biāo)記的細胞樣品用全波長酶標(biāo)儀在450 nm處讀取OD值，以僅加有絲分裂原的陽性對照組細胞的增殖率為100%，陰性對照組作為未增殖本底扣除，即0%，計算待測樣品組細胞增殖比率。

1.2.2 體內(nèi)小鼠細胞免疫調(diào)控活性檢測 （1）實驗小鼠分組。準(zhǔn)備50只Balb/c小鼠，其中，空白（正常）對照組10只，免疫低下模型對照組10只，火龍果莖多糖低劑量組（125 mg/kg）10只，火龍果莖多糖中劑量組（250 mg/kg）10只，火龍果莖多糖高劑量組（500 mg/kg）10只。

（2）實驗小鼠模型。小鼠隨機分為5組，每組10只，提前1周經(jīng)胃給予小鼠多糖，以注射等體積生理鹽水為空白對照組，其余組在第1、4、7天腹腔注射環(huán)磷酰胺75 mg/kg。

（3）多糖樣品的配制與干預(yù)。用純水溶解火龍果莖多糖受試樣品，配制成所需干預(yù)濃度如下，分別對應(yīng)樣品干預(yù)的低（125 mg/kg）、中（250 mg/kg）、高濃度（500 mg/kg）。低劑量組：125 mg/kg×0.1 kg/mL= 12.5 mg/mL；中劑量組：250 mg/kg×0.1 kg/mL= 25 mg/mL；高劑量組：500 mg/kg×0.1 kg/mL= 50 mg/mL。

CTX造模前，各濃度組干預(yù)1周，每組每天灌胃0.1 mL/10 g。第1次CTX發(fā)作后，繼續(xù)干預(yù)10 d，第10天處死各組實驗小鼠，評估干預(yù)效果。期間，空白對照組和模型對照組按相同方法灌胃純水。

（4）體重觀測。自實驗小鼠分組開始，每天監(jiān)測每只實驗小鼠的體重變化，并記錄。

（5）脾指數(shù)。在多糖干預(yù)終點，脫脊椎處死小鼠，無菌取脾臟，并對臟器質(zhì)量稱重，計算每只小鼠的脾指數(shù)。脾指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重，單位為mg/g。

（6）全脾免疫細胞計數(shù)。在多糖樣品的干預(yù)終點，參照1.2.1-（2），計算每只小鼠的全脾免疫細胞的總數(shù)。

（7）T、B淋巴細胞增殖能力檢測。將細胞樣品的細胞濃度調(diào)至4×106個/mL。每個樣品設(shè)12個復(fù)孔，另設(shè)12孔不加有絲分裂原作為細胞增殖的空白對照。參照1.2.1-（3）檢測T、B淋巴細胞在火龍果莖多糖作用后的淋巴細胞增殖比率。

（8）血細胞計數(shù)。在體內(nèi)實驗終點，取各組小鼠全血，檸檬酸鈉抗凝處理。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用血細胞分析儀檢測全血中白細胞、淋巴細胞、中間細胞、粒細胞、紅細胞以及血小板等成分的數(shù)量。以每升血液中的血細胞數(shù)量表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗結(jié)果均以均值±SD表示，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外小鼠淋巴細胞增殖效應(yīng)

2.1.1 對淋巴細胞毒性濃度排除 脾臟淋巴細胞在無誘導(dǎo)條件下無增殖能力，可在無誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下通過活細胞檢測評價火龍果莖多糖是否對淋巴細胞具有毒性效應(yīng)，或者可能的毒性濃度范圍。結(jié)果如圖1，火龍果莖多糖樣品在測試濃度范圍內(nèi)對活細胞均未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性效應(yīng)，即在該濃度范圍內(nèi)火龍果莖多糖對脾臟淋巴細胞存活率均無抑制作用。PSP-1在0.5 μg/mL條件下具有一定增殖促進作用，但其他濃度條件下細胞存活率的變化不明顯；PSP-2在濃度范圍內(nèi)均呈明顯的促進增殖作用，并具有濃度依賴關(guān)系。這說明火龍果莖多糖，尤其是PSP-2可能具有誘導(dǎo)淋巴細胞增殖的效應(yīng)。

圖1 火龍果莖多糖對淋巴細胞的毒性效應(yīng)Fig. 1 Toxic effects of pitaya stem polysaccharides on lymphocytes

2.1.2 對T淋巴細胞增殖活性的影響 檢測淋巴細胞增殖能力是評價免疫功能最重要的指標(biāo)，有絲分裂原ConA主要誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖。結(jié)果如圖2，在有絲分裂原ConA（1 μg/mL）誘導(dǎo)的條件下，火龍果莖多糖在無毒性濃度范圍內(nèi)對T淋巴細胞均表現(xiàn)出顯著的增殖促進效應(yīng)，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，PSP-1和PSP-2多糖濃度分別為50、10 μg/mL時的增殖效果最好，PSP-1為PSP-2的5倍濃度的條件下，增殖促進作用與PSP-2相當(dāng)。這說明純化后的火龍果莖多糖PSP-2可能是PSP-1促進免疫功能的主要效應(yīng)成分。

圖2 火龍果莖多糖對T淋巴細胞增殖效應(yīng)的影響Fig. 2 Effects of pitaya stem polysaccharides on the proliferative effect of T lymphocytes

2.1.3 對B淋巴細胞增殖活性的影響 有絲分裂原LPS主要誘導(dǎo)B淋巴細胞增殖。結(jié)果如圖3，在有絲分裂原LPS（2 μg/mL）誘導(dǎo)的條件下，火龍果莖多糖在無毒性濃度范圍內(nèi)，PSP-1與PSP-2均未對B淋巴細胞表現(xiàn)出增殖促進效應(yīng)。結(jié)合在無誘導(dǎo)條件下和ConA誘導(dǎo)條件下火龍果莖多糖對淋巴細胞的效應(yīng)，可見火龍果莖多糖促進淋巴細胞增殖主要作用于T淋巴細胞增殖，且表現(xiàn)出非有絲分裂原誘導(dǎo)依賴的特征，而PSP-2可能為其中的主要效應(yīng)成分。

2.2 體內(nèi)小鼠細胞免疫調(diào)控活性

2.2.1 體重觀測 結(jié)果如圖4，在為期10 d的體重觀測期內(nèi)，各組實驗小鼠在各體重監(jiān)測點中均未表現(xiàn)出組間差異，體重基本維持在18~20 g之間。這說明環(huán)磷酰胺與火龍果莖多糖對實驗小鼠體重均無明顯影響。

圖4 小鼠體重監(jiān)測結(jié)果Fig. 4 Mouse weight monitoring results

2.2.2 脾指數(shù) 結(jié)果如圖5，經(jīng)環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠脾指數(shù)與正常小鼠相比，其脾指數(shù)降低幅度較大，表明環(huán)磷酰胺建?？捎糜诙嗵堑拿庖咝?yīng)評價?；瘕埞o多糖模型CK、低劑量組和中劑量組的脾指數(shù)比高劑量組略低，但三組均與空白CK呈極顯著差異。

圖5 小鼠脾指數(shù)Fig. 5 Mouse spleen weight index

2.2.3 全脾免疫細胞計數(shù) 對裂解后的全脾細胞進行計數(shù)，結(jié)果如圖6，與正常組（空白CK）相比，模型CK、低劑量和中劑量的細胞數(shù)顯著降低，而高劑量處理的全脾細胞數(shù)比這三組明顯提升，且具有顯著性差異。這表明經(jīng)胃給予火龍果莖多糖的模型小鼠具有一定的恢復(fù)或增強免疫的效應(yīng)。

圖6 小鼠脾臟免疫細胞計數(shù)Fig. 6 Mouse spleen immune cell counts

2.2.4 對T、B淋巴細胞增殖能力評價 小鼠體內(nèi)淋巴細胞增殖結(jié)果如圖7，火龍果莖多糖在體內(nèi)促進淋巴細胞增殖效應(yīng)評價中，出現(xiàn)了跟體外增殖實驗一樣的結(jié)果。結(jié)果表明，經(jīng)ConA誘導(dǎo)的各模型處理組T淋巴細胞增殖能力明顯減弱，由LPS誘導(dǎo)的各模型處理組B淋巴細胞也出現(xiàn)相同結(jié)果，但經(jīng)胃給與火龍果莖多糖的小鼠T淋巴細胞增殖能力與模型CK組相比有明顯的促進效應(yīng)，但給予相同劑量多糖的小鼠B淋巴細胞無明顯效應(yīng)。這種結(jié)果的一致性進一步說明，T淋巴細胞可能是火龍果莖多糖促進機體免疫的主要靶細胞。

圖7 小鼠淋巴細胞增殖率Fig. 7 Mouse lymphocyte proliferation rate

2.2.5 血細胞計數(shù) 結(jié)果如圖8，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠模型其外周血細胞比例并未發(fā)生有規(guī)律的改變，這可能是由于環(huán)磷酰胺對骨髓抑制與造血代償效應(yīng)的相互作用造成的。其中，雖然外周淋巴細胞可能由于造血代償導(dǎo)致模型處理組淋巴細胞的比例增加，而火龍果莖多糖高劑量處理組能夠進一步提高其細胞比例，這與全脾免疫細胞數(shù)增加的研究結(jié)果一致，這也從另一方面表明火龍果莖多糖，特別是高劑量具有一定的免疫增強效應(yīng)。

圖8 小鼠血細胞計數(shù)Fig. 8 Mouse blood cell count

3 討論

生物體通過在漫長的種系發(fā)展過程和進化歷程中產(chǎn)生的適應(yīng)型免疫應(yīng)答來保證體內(nèi)環(huán)境的相對平衡，這種防御機制中主要利用T、B淋巴細胞產(chǎn)生的不同抗體來實現(xiàn)免疫作用，而脾臟作為人體最主要的免疫器官，可以產(chǎn)生大量淋巴細胞來實現(xiàn)免疫作用，而免疫細胞的活躍度以及免疫器官的發(fā)育也能夠反映機體免疫程度，細胞繁殖能力以及脾臟指數(shù)越高，則表示人體免疫力也越高[17-18]。

多糖是火龍果莖的重要活性物質(zhì)，作為一種來源安全、天然的植物多糖，具備多種生理功能，具有較高的開發(fā)利用價值。目前關(guān)于火龍果莖多糖免疫功能的研究尚未報道，但發(fā)現(xiàn)多種植物多糖均具有顯著的免疫活性，如茶葉多糖[19]在處理免疫低下小鼠后能顯著提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，也可降低脾細胞腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的含量。巖藻多糖[20]可以通過增加免疫球蛋白和細胞因子的分泌，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而提高免疫低下小鼠的免疫功能，并能有效緩解環(huán)磷酰胺造成的免疫器官損傷。荔枝多糖[21]可誘導(dǎo)脾臟細胞增殖、平衡脾臟淋巴細胞亞群比例、提高胸腺和脾臟指數(shù)等系統(tǒng)免疫應(yīng)答。白術(shù)多糖[22]同樣對淋巴細胞、脾臟細胞的增殖具有顯著的提升效果。因此，本研究將火龍果莖多糖應(yīng)用于免疫低下小鼠模型對其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性進行研究，旨在明確火龍果莖多糖是否具有免疫調(diào)節(jié)功能，為火龍果莖多糖的功能性利用提供依據(jù)。

研究結(jié)果顯示：①火龍果莖多糖PSP-1和PSP-2對原代脾臟淋巴細胞均無毒性效應(yīng)。②火龍果莖多糖PSP-2在沒有有絲分裂原誘導(dǎo)的條件下，其檢測濃度范圍均具有誘導(dǎo)淋巴細胞的增殖效應(yīng)，且在0.01~10 μg/ml濃度范圍內(nèi)具有明顯的量效關(guān)系。③有絲分裂原誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖結(jié)果表明，火龍果莖多糖在LPS誘導(dǎo)條件下無顯著的促進增殖效應(yīng)，而能促進ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖，并具備一定的濃度依賴關(guān)系，說明火龍果莖多糖的主要效應(yīng)細胞為T淋巴細胞。并且在PSP-1與5倍濃度PSP-2的效應(yīng)比較中，2種多糖表現(xiàn)出相近的效應(yīng)與量效關(guān)系，說明PSP-2可能是主要促進T淋巴細胞增殖的活性組成部分。④通過環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠模型評價火龍果莖多糖對增進免疫功能的可能效應(yīng)。結(jié)果表明，火龍果莖多糖能一定程度緩解環(huán)磷酰胺對脾臟免疫細胞數(shù)量的抑制作用，對全脾免疫細胞數(shù)量與脾指數(shù)的效應(yīng)一致，且高劑量的作用更為顯著。

綜上所述，火龍果莖多糖在小鼠體內(nèi)外的實驗中均表現(xiàn)出對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖反應(yīng)的特異性促進作用，說明T淋巴細胞可能是火龍果莖多糖促進免疫作用的主要效應(yīng)細胞。而相對細胞數(shù)量與細胞增殖能力的效應(yīng)，高劑量對脾指數(shù)的提升效果不顯著，表明火龍果莖多糖促進免疫主要是通過增加淋巴細胞的功能實現(xiàn)的。