葉 霞，吳 倩，謝國(guó)芳

1. 貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽 550005；2. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院/貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025

火龍果（Hylocereus undulates）又稱吉祥果、玉龍果、芝麻果等，起源于拉丁美洲[1]，是仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）多年生攀援的典型熱帶植物[2-3]。火龍果果實(shí)外形亮麗、口感清甜[2]，且富含甜菜色素、不飽和脂肪酸、有機(jī)酸、植物多糖、蛋白質(zhì)及微量元素[4]，具有預(yù)防便秘、降血脂及抗氧化等作用[5-6]，深受消費(fèi)者的青睞。然而，火龍果成熟于高溫多雨的夏秋季節(jié)，采后生理代謝旺盛，加速果實(shí)衰老腐爛，縮短果實(shí)貨架期，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3,7]。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）又稱茶子樹或茶油樹，起源于中國(guó)，是我國(guó)重要木本食用油料樹種，與油棕、椰子和油橄欖并稱世界四大木本油料植物[8]。我國(guó)年產(chǎn)油茶籽265萬t左右，加工油茶籽油后產(chǎn)生約70萬t餅粕，大部分被廢棄[9]。研究顯示，油茶餅粕對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌等食源性致病菌[10]和稻瘟病菌、柑橘青霉病菌、黃瓜炭疽病菌、番茄小核病菌、玉米小斑病菌等植物病原菌均具有較好的抑制作用[11]，還發(fā)現(xiàn)其對(duì)圣女果和荔枝具有較好的保鮮效果[12-13]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，采前噴施油茶餅粕提取液可維持火龍果采后貯藏品質(zhì)[14-15]，但其作用機(jī)理尚不明確。為此，以紫紅龍火龍果為試材，采前噴施不同濃度的油茶餅粕提取液，探究油茶餅粕提取液對(duì)火龍果果實(shí)采后抗病性的影響。研究結(jié)果為油茶餅粕提取液在火龍果的貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)提高油茶資源的利用率具有重要意義，為開發(fā)綠色、環(huán)保的果蔬貯藏保鮮新技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 紫紅龍火龍果：于2019年9月6日采摘于貴州省羅甸縣火龍果基地，八成熟時(shí)采收，選擇無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小一致的果實(shí)開展試驗(yàn)。

油茶餅粕提取液：以采自貴州省思南縣野生油茶樹的油茶果經(jīng)液壓榨油后的餅粕為原料，參照謝國(guó)芳等[15]的方法進(jìn)行提取。

1.1.2 儀器與設(shè)備 YGA2100型O2和CO2分析儀，北京陽光億事達(dá)；ES100型乙烯分析儀，意大利FCE公司；PAL-BX手持型糖酸一體機(jī)，日本Atago公司；TCL-16A冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 油茶餅粕提取液處理 采前1 d，采用濃度分別為0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%的油茶餅粕提取液對(duì)火龍果果實(shí)進(jìn)行噴施（以果面水珠下滴為準(zhǔn)），每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以相鄰果樹果實(shí)噴施清水為對(duì)照（CK）。采后立即運(yùn)回貴陽學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，散去田間熱，置于(10±0.5)℃、相對(duì)濕度90%~95%下貯藏，每7 d取樣分析，液氮凍樣，于-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2.2 火龍果理化特性的測(cè)定 采用分級(jí)法測(cè)定果實(shí)腐爛指數(shù)（decay index, DI），依照果實(shí)腐爛面積分為4級(jí)，0級(jí)：果實(shí)表面無腐爛現(xiàn)象；1級(jí)：果實(shí)表面腐爛面積小于1/4；2級(jí)：果實(shí)表面腐爛面積為1/4~1/2；3級(jí)：果實(shí)表面腐爛面積大于1/2。腐爛指數(shù)=∑(腐爛級(jí)別×該級(jí)別果實(shí)數(shù))/(最高級(jí)別×總果實(shí)數(shù))。呼吸速率（respiratory rate, RR）和乙烯釋放速率（ethylene release rate, ERR）測(cè)定參照XIE等[16]的方法。相對(duì)電導(dǎo)率（relative conductivity, RC）測(cè)定參照曹建康等[17]的方法。脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）活力測(cè)定參照邵琪等[18]的方法。

1.2.3 火龍果營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 總可溶性固形物（total soluble solid, TSS）含量采用PAL-BX手持型糖酸一體機(jī)測(cè)定，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4個(gè)果實(shí)，去皮，果肉切碎并混勻，4000 r/min離心10 min，取少量上清液于糖酸一體機(jī)測(cè)定其TSS含量，重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果用°Brix表示。抗壞血酸（ascorbic acid, AsA）含量測(cè)定參照NUNCIO-JáUREGUI等[19]的方法。

1.2.4 火龍果活性氧代謝的測(cè)定 過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）含量和過氧化氫酶（catalase, CAT）活力測(cè)定參照SHADMANI等[20]的方法；采用南京建成生物工程研究所SOD試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活力。

1.2.5 火龍果防御相關(guān)酶活力的測(cè)定 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase, PAL）活力測(cè)定參照YU等[21]的方法；過氧化物酶（peroxidase, POD）活力測(cè)定參照LI等[22]的方法；多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）活力測(cè)定參照ZHANG等[23]的方法；β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase, GLU）、幾丁質(zhì)酶（chitinase,CHI）活力測(cè)定參照PAN等[24]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，使用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 9.0軟件制圖，采用RStudio軟件進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，并生成相關(guān)性矩陣，采用IBM SPSS 25軟件進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前噴施油茶餅粕提取液對(duì)火龍果理化特性的影響

不同濃度油茶餅粕提取液處理火龍果后，貯藏至21 d時(shí)開始腐爛，處理組果實(shí)腐爛指數(shù)均低于CK（圖1A）。油茶餅粕提取液處理火龍果后，采后貯藏期間火龍果果實(shí)呼吸速率呈下降趨勢(shì)，除0.25%濃度處理果實(shí)的乙烯釋放速率呈先增后降外，其他均呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且貯藏21 d時(shí)，與CK相比，處理組均顯著抑制火龍果果實(shí)的呼吸速率和乙烯釋放速率（P<0.05，圖1B~圖1C）。油茶餅粕提取液處理火龍果后，火龍果果皮的相對(duì)電導(dǎo)率均呈先升后降趨勢(shì)，與CK相比，油茶餅粕提取液可有效抑制相對(duì)電導(dǎo)率的增加（圖1D）。火龍果果實(shí)的脂氧合酶（LOX）活力均呈先降后升趨勢(shì)，貯藏7 d和14 d時(shí)，與CK相比，1.00%油茶餅粕提取液可有效抑制LOX活力升高（圖1E）。

2.2 采前噴施油茶餅粕提取液對(duì)火龍果營(yíng)養(yǎng)成分的影響

油茶餅粕提取液處理能有效維持火龍果果實(shí)總可溶性固形物（TSS）含量，且采收貯藏21 d時(shí)均顯著高于CK（P<0.05）；貯藏期間，火龍果果實(shí)抗壞血酸（AsA）含量呈下降趨勢(shì)，其中1.00%油茶餅粕提取液處理能有效維持果實(shí)AsA含量（圖2）。

2.3 采前噴施油茶餅粕提取液對(duì)火龍果活性氧代謝的影響

油茶餅粕提取液處理可顯著提高火龍果果實(shí)采收時(shí)H2O2含量（P<0.05），但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，尤其是貯藏末期CK的H2O2含量顯著高于處理組（P<0.05，圖3A）。貯藏期間，火龍果果實(shí)過氧化氫酶（CAT）活力呈下降趨勢(shì)，貯藏前14 d，0.10%油茶餅粕提取液處理組火龍果果實(shí)的CAT活力均顯著高于CK（P<0.05）；貯藏21 d時(shí)處理組果實(shí)CAT活力均顯著低于CK（P<0.05），可能是由于果實(shí)體內(nèi)的H2O2濃度的增加激活CAT活力（圖3B）。油茶餅粕提取液處理后，貯藏期間火龍果果實(shí)超氧化物歧化酶（SOD）活力呈先升后降趨勢(shì)，且0.05%油茶餅粕提取液處理能有效維持果實(shí)SOD活力（圖3C）。

圖3 采前油茶餅粕提取液處理對(duì)火龍果活性氧代謝的影響Fig. 3 Effects of preharvest treatment of C. oleifera cake extract on reactive oxygen species metabolism of pitaya

2.4 采前噴施油茶餅粕提取液對(duì)火龍果防御相關(guān)酶活力的影響

0.10%和0.50%油茶餅粕提取液處理能顯著提高火龍果果實(shí)采收時(shí)苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力，0.05%、0.25%、1.00%油茶餅粕提取液處理的果實(shí)貯藏期間PAL活力逐漸上升，貯藏21 d時(shí)處理組PAL活力均顯著高于CK（P<0.05，圖4A）。貯藏期間，火龍果果實(shí)過氧化物酶（POD）活力呈先升后降趨勢(shì)，貯藏21 d時(shí)，0.05%、0.25%、1.00%處理組的POD活力顯著高于CK（P<0.05，圖4B）。油茶餅粕提取液處理能顯著提高火龍果果實(shí)采收時(shí)（0 d）多酚氧化酶（PPO）活力（P<0.05，圖4C）。與CK相比，油茶餅粕提取液處理能顯著提高火龍果果實(shí)采收后的β-1,3-葡聚糖酶（GLU）活力（P<0.05），并能有效延緩貯藏期間GLU活力的下降（圖4D）。CK和1.00%油茶餅粕提取液處理的火龍果果實(shí)幾丁質(zhì)酶（CHI）活力呈先降后升趨勢(shì)，其余處理組則呈持續(xù)上升趨勢(shì)，說明油茶餅粕提取液可有效維持或提高火龍果CHI活力，從而增強(qiáng)果實(shí)抗病性（圖4E）。

圖4 采前油茶餅粕提取液處理對(duì)火龍果防御酶活力的影響Fig. 4 Effects of preharvest treatment of C. oleifera cake extract on defense-related enzymes activity of pitaya

2.5 不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析

如表1所示，腐爛指數(shù)（DI）與乙烯釋放速率（ERR）、相對(duì)電導(dǎo)率（RC）、H2O2含量、脂氧合酶（LOX）和幾丁質(zhì)酶（CHI）活力呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與總可溶性固形物（TSS）含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）及過氧化物酶（POD）活力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。相對(duì)電導(dǎo)率與乙烯釋放速率、TSS含量和CHI活力呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與PAL活力呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與呼吸速率（RR）、抗壞血酸（AsA）A含量、CAT、PPO、POD和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）GLU活力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與LOX和SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。H2O2含量與乙烯釋放速率和CHI活力呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與呼吸速率、SOD活力、POD活力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。

表1 不同指標(biāo)間相關(guān)性分析Tab. 1 Correlation analysis among indicators

2.6 火龍果抗病性評(píng)價(jià)因素主成分分析

由表2可知，前5個(gè)因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)79.90%，保留了15項(xiàng)指標(biāo)的大部分信息。將所提取的因子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)處理，由5個(gè)因子的載荷值可知，因子1的方差貢獻(xiàn)高達(dá)38.64%，代表相對(duì)電導(dǎo)率、POD活力、乙烯釋放速率、CAT活力和腐爛指數(shù)；因子2主要代表LOX活力和呼吸速率；因子3主要代表CHI活力和AsA含量；因子4主要代表PPO活力、H2O2含量和PAL活力；因子5主要代表TSS含量、SOD和GLU活力。

表2 主成分因子載荷矩陣Tab. 2 Component load matrix after principal component analysis

2.7 采前噴施油茶餅粕提取液對(duì)火龍果采后綜合評(píng)分的影響

綜合評(píng)分結(jié)果顯示，1.00%油茶餅粕提取液處理的火龍果果實(shí)貯藏期間綜合評(píng)分均高于CK（圖5），說明1.00%油茶餅粕提取液處理效果較好。

圖5 采前油茶餅粕提取液處理對(duì)火龍果采后綜合評(píng)分的影響Fig. 5 Effects of preharvest treatment of C. oleifera cake extract on comprehensive score of pitaya

3 討論

火龍果果實(shí)為呼吸躍變型水果，而高強(qiáng)度的呼吸作用會(huì)消耗果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[25]。本研究中，與CK相比，貯藏后期不同濃度油茶餅粕提取液處理能顯著抑制火龍果果實(shí)呼吸速率和乙烯釋放速率，有效提高火龍果果實(shí)TSS含量，維持果實(shí)AsA含量穩(wěn)定。細(xì)胞膜通透性是衡量膜完整性的重要指標(biāo)，相對(duì)電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜損壞程度的重要指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比，貯藏后期不同濃度油茶餅粕提取液均能有效抑制火龍果果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率的增加，并有效抑制其腐爛指數(shù)上升。說明油茶餅粕提取液可有效減輕火龍果果實(shí)細(xì)胞膜的損傷程度，保持膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而減輕品質(zhì)劣變的程度。

活性氧（ROS）代謝是果蔬采后重要的生理代謝活動(dòng)，低水平的ROS在細(xì)胞中發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，而高水平的ROS則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂[26]，其水平與ROS相關(guān)清除酶的活性有關(guān)[27]。本研究中，油茶餅粕提取液可有效維持或提高火龍果果實(shí)的SOD活力，從而抑制H2O2的積累。說明茶餅粕提取液可有效促進(jìn)火龍果果實(shí)H2O2代謝，清除果實(shí)體內(nèi)代謝過程中過多的ROS自由基，從而提高果實(shí)的抗氧化能力。

已有研究顯示，油茶餅粕粗提物及其活性成分對(duì)食源性致病菌以及植物病原菌活性具有較好的抑制作用，對(duì)果蔬具有良好的保鮮效果[9-14]。PAL、POD、PPO、GLU和CHI是植物抗病性相關(guān)的重要防御酶，在保護(hù)植物免受氧化損傷、病原菌侵害中起著重要作用，防御酶活力的增強(qiáng)可提高采后果蔬的抗病性[11,28]。PAL是植物苯丙素途徑中的關(guān)鍵酶，在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病原菌侵害過程中發(fā)揮重要作用，并能延長(zhǎng)采后果蔬的貯藏期[29-30]。PPO和POD參與果蔬活性氧代謝，同時(shí)能催化形成木質(zhì)素及其他酚類氧化產(chǎn)物有毒醌類等抗菌物質(zhì)，抵御病菌侵入，從而保護(hù)植物體免受病菌侵害[23,31]。GLU和CHI是兩類重要的植物病程相關(guān)蛋白，被認(rèn)為是參與植物系統(tǒng)抗性的標(biāo)記酶，植物被病原體感染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一些致病相關(guān)蛋白來抵抗病原體進(jìn)一步的感染[23]。GLU可以降解致病性菌絲細(xì)胞壁上的β-1,3-葡聚糖，而CHI能夠降解大多數(shù)病原體的細(xì)胞壁，具有直接的抑菌作用[24]。本研究結(jié)果表明，與CK相比，采前噴施油茶餅粕提取液可有效提高或維持火龍果采后貯藏期間果皮的PAL、GLU和CHI活力，增強(qiáng)采后火龍果果實(shí)對(duì)病原菌的普遍抗性，從而抑制果實(shí)腐爛指數(shù)上升。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，火龍果果實(shí)腐爛與ROS的積累、膜脂過氧化密切相關(guān)，減輕火龍果果實(shí)氧化應(yīng)激、維持細(xì)胞膜完整性是提高抗病性的基礎(chǔ)。結(jié)果表明，噴施油茶餅粕提取液可能在火龍果果實(shí)的抗氧化平衡中起著重要作用，可維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)節(jié)ROS對(duì)果實(shí)的毒性，降低膜脂過氧化程度，并提高果實(shí)的抗性，緩解病原菌對(duì)生物膜的傷害，減輕貯藏期間火龍果果實(shí)的腐爛。以上結(jié)果表明，油茶餅粕提取液可激活ROS清除酶和抗病性相關(guān)酶活力，進(jìn)而降低ROS的積累，提高火龍果抗病能力，這可能是改善園藝作物貯藏期氧化和防御應(yīng)激的關(guān)鍵。同時(shí)，本研究通過主成分分析對(duì)所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行有效降維，并對(duì)不同處理的果實(shí)抗病性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，綜合評(píng)分最高的為1.00%油茶餅粕提取液處理組，說明其作用效果最佳。

綜上所述，采前噴施油茶餅粕提取液處理可通過提高火龍果果實(shí)SOD等ROS清除酶的活力，降低ROS的積累，減輕膜脂過氧化程度。同時(shí)，提高果實(shí)PAL、GLU及CHI等防御相關(guān)酶活力，增強(qiáng)火龍果果實(shí)的抗氧化和抗病性能力，進(jìn)而減輕果實(shí)腐爛。這些結(jié)果說明油茶餅粕提取液處理對(duì)減輕火龍果果實(shí)腐爛與調(diào)控ROS代謝、提高抗氧化能力及抗病性密切相關(guān)。