王 燕，黃曦澤，馮德宇，王 萌，梁曉宇*，張 宇*

1. 海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，海南?？?570228；2. 海南大學(xué)三亞南繁研究院，海南三亞 572025

由白粉菌（Erysiphe quercicola）引起的白粉病是近年來影響橡膠樹產(chǎn)膠量的主要因素之一，在環(huán)境條件適宜情況下極易暴發(fā)成災(zāi)，造成橡膠樹反復(fù)落葉，嚴(yán)重推遲割膠時(shí)間。橡膠樹白粉病暴發(fā)大多起始于每年的冬春交替之際，此時(shí)林段中橡膠樹大多處于落葉期，可為白粉菌提供寄生的葉片較少。因此尋找橡膠樹白粉菌的其他寄主植物，控制其初侵染的菌源，可在一定程度上降低白粉病的危害規(guī)模。目前已報(bào)道的橡膠樹白粉菌寄主主要有馬占相思（Acacia mangium）、飛揚(yáng)草（Euphorbia hirtaL.）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcasL.）和刺頭婆（Urena lobatasp.）等[1]。其中馬占相思是豆科（Leguminosae）含羞草亞科（Mimosoideae）金合歡屬（Vachellia）的一種熱帶常綠高大喬木。作為重要的膠園防護(hù)林樹種，馬占相思有降低風(fēng)速、貯水防旱、保護(hù)水土、降溫防寒、改良土壤等生態(tài)效能，可為橡膠樹的生長(zhǎng)和產(chǎn)膠提供良好的條件，還可生產(chǎn)上等薪炭材料，創(chuàng)造豐厚的經(jīng)濟(jì)效益[2-4]。研究馬占相思與橡膠樹白粉菌的生物互作，可進(jìn)一步了解白粉菌在寄主上的行為反應(yīng)，為橡膠樹白粉病的高效防治提供理論基礎(chǔ)。

低溫馴化是植物感受和傳遞低溫信號(hào)引起低溫適應(yīng)性反應(yīng)，提高抗凍性的過程[5]。低溫馴化過程中植物體內(nèi)發(fā)生許多生理與生化變化，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累、抗氧化酶活性增強(qiáng)、細(xì)胞膜脂質(zhì)組成發(fā)生變化等[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境中馬占相思的新抽嫩葉不再感染橡膠樹白粉菌，獲得了顯著的抗病性，推測(cè)是低溫馴化提高了馬占相思對(duì)橡膠樹白粉病的抗性。為了探究其中的抗性誘導(dǎo)機(jī)制，本研究以23、19、15 ℃溫度條件下培養(yǎng)的馬占相思植株葉片為試驗(yàn)材料，驗(yàn)證這一抗性現(xiàn)象，利用掃描電鏡和GC-MS/MS等儀器分析低溫馴化對(duì)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)和組成的影響，并測(cè)定接種橡膠樹白粉菌的植株氧化酶活性，初步解析其抗病誘導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試品種為馬占相思1年生幼苗，該品種購自廣州市瑞景園林景觀設(shè)計(jì)有限公司，在自然條件下繼續(xù)培養(yǎng)待用；橡膠樹品種為熱研73397橡膠樹芽接苗，購自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，在自然條件下培養(yǎng)抽古銅葉片待接種。

1.1.2 菌株 橡膠樹白粉菌OH-3菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離純化，接種至熱研73397橡膠樹芽接苗上擴(kuò)繁培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 低溫馴化 馬占相思的原產(chǎn)地屬于熱帶濕潤(rùn)氣候，年均溫度不低于23 ℃[7]。故本研究以23 ℃作為馬占相思的自然生長(zhǎng)溫度，19 ℃和15 ℃作為馬占相思的低溫馴化溫度，將長(zhǎng)勢(shì)一致且健康的馬占相思幼苗分別轉(zhuǎn)移至上述3個(gè)溫度的人工氣候箱（光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度10 000 lx，空氣相對(duì)濕度85%）中培養(yǎng)30 d。

1.2.2 橡膠樹白粉菌接種 用軟毛筆刷將橡膠樹芽接苗葉片上白粉菌的孢子粉輕輕掃到燒杯中，加入無菌水渦旋振蕩搖勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備濃度為105個(gè)/mL的孢子懸浮液。用噴壺將孢子懸浮液均勻地噴霧至馬占相思幼苗葉片表面，后將幼苗置于培養(yǎng)條件為19 ℃、光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度10 000 lx，濕度85%~90%的人工氣候室中培養(yǎng)并觀察病程。每個(gè)馴化溫度下接種6株苗，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 掃描電鏡觀察 將馬占相思葉片剪成1 cm2大小的片段，用2.5%戊二醛浸泡后，4 ℃下固定12 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，每次20 min；梯度酒精脫水（30%、50%、70%、90%、100%）各20 min，醋酸異戊酯置換酒精清洗1次；冷凍干燥12 h。將樣品粘于導(dǎo)電膠并固定在托盤上，抽真空后噴金，利用掃描電鏡（Phenom G6 pure）對(duì)葉片表面進(jìn)行蠟質(zhì)晶體形態(tài)的觀察[8-9]。每個(gè)馴化溫度下處理3片葉，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 蠟質(zhì)提取 蠟質(zhì)提取參照趙帥等[10]的方法稍加改進(jìn)。將馬占相思葉片至于裝有20 mL三氯甲烷的燒杯中，輕輕搖晃燒杯加速蠟質(zhì)溶解，后將液體轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，待三氯甲烷在40 ℃下完全蒸干，分別加入30 μL吡啶和30 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，密封后放入70 ℃水浴鍋中衍生反應(yīng)1 h，反應(yīng)完全后再次40 ℃旋蒸干，分次加入1 mL三氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。每個(gè)馴化溫度下處理9片葉，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.5 GC-MS/MS分析 使用Trace1300-TSQ 9000氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛）對(duì)上述蠟質(zhì)提取液進(jìn)行成分的定性定量分析。GC-MS/MS條件：載氣為氦氣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測(cè)器溫度320 ℃；檢測(cè)程序：50 ℃保持2 min，以20 ℃/min升溫至240 ℃保持2 min，再以1.5 ℃/min升溫至320 ℃保持15 min。參考計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，依據(jù)蠟質(zhì)成分中酸、醇、醛和烷烴均有其明顯的M-15特殊離子峰判定各蠟質(zhì)組分種類以及碳原子數(shù)，檢索后判定化合物名稱[11]。蠟質(zhì)中各組分相對(duì)含量根據(jù)其離子峰面積占總離子峰面積的比值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 氧化酶活性測(cè)定 稱取0.2 g馬占相思葉片，在預(yù)冷研缽中研磨成粉后加入4 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L, pH 7.8），4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中用于抗氧化酶活性測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法NBT法測(cè)定[12]；過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫法測(cè)定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[13]。每個(gè)馴化溫度下處理6片葉子，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酶活性單位均以單位蛋白含量的酶活性表示，U/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS和Origin軟件進(jìn)行差異顯著性分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫馴化增強(qiáng)馬占相思對(duì)橡膠樹白粉病的抗性

將馬占相思幼苗分別置于23、19、15 ℃溫度條件下培養(yǎng)抽出嫩葉，后轉(zhuǎn)移至橡膠樹白粉菌最適溫度19 ℃條件下接種（圖1）。接種12 d后發(fā)現(xiàn)，23 ℃培養(yǎng)的植株嫩葉發(fā)病嚴(yán)重，上下表面布滿含有大量菌絲的病斑；23 ℃培養(yǎng)的植株成熟葉均不發(fā)病；19 ℃培養(yǎng)的嫩葉發(fā)病較輕，上下表面有少量且菌絲稀少的病斑，19 ℃培養(yǎng)的成熟葉均不發(fā)??；15 ℃培養(yǎng)的嫩葉和成熟葉均不發(fā)病，將低溫馴化后不發(fā)病植株重新置于23 ℃下培養(yǎng)至抽出嫩葉，新抽葉片接種白粉菌后發(fā)病嚴(yán)重。由此可見，低溫馴化顯著增強(qiáng)了馬占相思對(duì)橡膠樹白粉病的抗性。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下馬占相思葉片接種橡膠樹白粉菌的病癥Fig. 1 Lesion of A. mangium leaves inoculated with E. quercicola under different culture temperature conditions

2.2 低溫馴化對(duì)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的影響

通過觀察不同溫度條件培養(yǎng)的馬占相思葉片表面形態(tài)（圖2），發(fā)現(xiàn)23 ℃培養(yǎng)的嫩葉表面不平整，有明顯的凹凸，19 ℃和15 ℃培養(yǎng)的嫩葉表面趨于平滑，有輕微的凹凸，葉片形態(tài)更趨近于23 ℃培養(yǎng)的成熟葉。利用掃描電鏡觀察了馬占相思葉片表面的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)23 ℃嫩葉蠟質(zhì)層凸起、排列不規(guī)則，晶體結(jié)構(gòu)相互疊加纏繞；19 ℃嫩葉蠟質(zhì)層凸起，結(jié)構(gòu)排列有序；23 ℃成熟葉和15 ℃嫩葉蠟質(zhì)層平滑，有明顯的晶體狀蠟質(zhì)。綜上所述，低溫馴化可促進(jìn)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的成熟化。

圖2 不同培養(yǎng)溫度條件下馬占相思葉片的上表面形態(tài)Fig. 2 Morphology of the upper surface of A. mangium leaves under different culture temperature conditions

2.3 低溫馴化對(duì)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)組分的影響

提取不同溫度條件下培養(yǎng)的馬占相思葉片蠟質(zhì)，利用GC-MS/MS檢測(cè)體系對(duì)蠟質(zhì)組分進(jìn)行定性定量分析，不同葉片的蠟質(zhì)檢測(cè)總離子峰圖如圖3所示。與23 ℃嫩葉的蠟質(zhì)檢測(cè)離子峰相比，15 ℃嫩葉、19 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉的檢測(cè)離子峰更多，峰圖更趨近一致，說明15 ℃嫩葉、19 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉的蠟質(zhì)組成更復(fù)雜。進(jìn)一步篩選到10個(gè)響應(yīng)強(qiáng)度高的離子峰，經(jīng)檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，推測(cè)出這些化合物的種類。10個(gè)蠟質(zhì)成分主要?dú)w為5類，其中烷烴類化合物有5種，分別為C25烷、C27烷、C31烷、C36烷、C44烷；酚類化合物有2種，分別為C14酚和C23酚；酮類、醇類和酯類化合物各1種，分別為C30酮、C30醇和C32酯。

圖3 不同培養(yǎng)溫度條件下馬占相思葉片的蠟質(zhì)成分檢測(cè)總離子峰Fig. 3 The total ion peak of A. mangium leaf wax under different culture temperature conditions

以檢測(cè)總離子峰為100%分析比較以上化合物在不同溫度條件下培養(yǎng)的馬占相思葉片蠟質(zhì)中的相對(duì)含量（表1）。結(jié)果表明，馬占相思葉片蠟質(zhì)中C30酮的相對(duì)含量最高，不同培養(yǎng)溫度的葉片C30酮相對(duì)含量差異顯著，由低到高排列依次為：15 ℃嫩葉<23 ℃成熟葉<19 ℃嫩葉<23 ℃嫩葉。另外，在23 ℃嫩葉中相對(duì)含量較高的有C36烷、C32酯和C30醇，而15 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉中的相對(duì)含量均顯著降低。由此可見，不同溫度對(duì)馬占相思葉片蠟質(zhì)成分的影響較大，低溫馴化使葉片蠟質(zhì)組成更復(fù)雜，一定程度上使嫩葉的主要蠟質(zhì)成分趨近于成熟葉。

表1 不同培養(yǎng)溫度條件下馬占相思葉片蠟質(zhì)主要成分的相對(duì)含量Tab. 1 Relative contents of the main components of wax in A. mangium leaves under different culture temperature conditions

2.4 低溫馴化對(duì)馬占相思嫩葉氧化酶活性的影響

通過比較23 ℃和15 ℃培養(yǎng)的馬占相思嫩葉接種橡膠樹白粉菌后SOD、CAT和POD氧化酶活性發(fā)現(xiàn)。隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，2種溫度培養(yǎng)的嫩葉的3種氧化酶活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在24 h時(shí)達(dá)到最高值。與23 ℃嫩葉相比，15 ℃嫩葉的SOD、CAT和POD酶活性在部分侵染時(shí)間內(nèi)顯著增強(qiáng)，其中SOD酶表現(xiàn)最為明顯（圖4）。綜上表明，低溫馴化可以在一定程度上提高馬占相思嫩葉在接種白粉菌時(shí)的氧化酶活性。

圖4 23 ℃和15 ℃培養(yǎng)的馬占相思嫩葉的氧化酶活性Fig. 4 Oxidase activity of young leaves of A. mangium incubated at 23 ℃ and 15 ℃

3 討論

溫度是影響植物生理過程的重要非生物因素[14]。本研究利用不同溫度馴化的馬占相思幼苗嫩葉接種橡膠樹白粉菌后發(fā)現(xiàn)，15 ℃溫度條件下抽出的嫩葉不發(fā)病，說明低溫馴化可顯著增強(qiáng)馬占相思嫩葉對(duì)橡膠樹白粉病的抗性。已有研究表明，植物可以通過改變根、莖、葉的形態(tài)，解剖結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)來適應(yīng)低溫環(huán)境[15]。植物還可以通過積累細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[16]，增加代謝相關(guān)蛋白、分子伴侶、抗凍蛋白的合成來耐受或抵抗低溫脅迫[17]。推測(cè)馴化過程中的低溫脅迫引起馬占相思的嫩葉形態(tài)結(jié)構(gòu)或組成物質(zhì)的變化，從而產(chǎn)生了對(duì)橡膠樹白粉病的抗性。

本研究觀察了不同馴化溫度條件下馬占相思葉片的表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)19 ℃和15 ℃培養(yǎng)的嫩葉表面相對(duì)平滑，形態(tài)更接近23 ℃培養(yǎng)的成熟葉。掃描電鏡結(jié)果表明15 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)趨近一致，表面平滑且有明顯的晶體狀蠟質(zhì)，這進(jìn)一步說明低溫馴化可促進(jìn)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的成熟化。植物表皮蠟質(zhì)是植物抵御外界生物脅迫的第一屏障，通過提高表皮的機(jī)械強(qiáng)度和疏水性，能有效防止真菌等病原體的侵害[18-19]。蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)容易受溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生重組現(xiàn)象，當(dāng)植物處于低溫環(huán)境時(shí)，蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)容易形成棒狀、管狀等結(jié)構(gòu)，而處于高溫環(huán)境時(shí)容易形成板狀、片狀結(jié)構(gòu)[20]。本研究中，馬占相思的嫩葉易受橡膠樹白粉菌侵染，而成熟葉片對(duì)橡膠樹白粉病具有天然抗性，因此，推測(cè)低溫馴化可能是通過促進(jìn)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的成熟化，形成了更具防御性的物理屏障，通過阻礙白粉菌的侵染發(fā)揮抗病作用。

環(huán)境溫度不僅能夠影響植物蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，還會(huì)影響烷烴、烯烴、醇、酮、酯和酚等蠟質(zhì)組分的分布和比例[21]。本研究利用GC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)對(duì)不同溫度馴化的馬占相思葉片蠟質(zhì)組分進(jìn)行了定性定量分析，發(fā)現(xiàn)其主要含有烷烴、醇、酮、酯、酚等5類有機(jī)化合物，C30酮相對(duì)含量最高?？傠x子峰圖和相對(duì)含量結(jié)果進(jìn)一步表明，低溫培養(yǎng)使葉片蠟質(zhì)組成更復(fù)雜，15 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉的蠟質(zhì)組成較一致，說明低溫馴化在一定程度促進(jìn)嫩葉的主要蠟質(zhì)成分比例趨近于成熟葉。已有研究表明，一些植物蠟質(zhì)組分可以抑制或者刺激真菌孢子的萌發(fā)。水稻葉片蠟質(zhì)組分十六烷二醇可以誘導(dǎo)稻瘟菌附著胞的分化形成，并促進(jìn)灰霉菌孢子萌發(fā)和角質(zhì)酶的表達(dá)[22]。因此，推測(cè)低溫馴化也可能促進(jìn)或抑制了馬占相思嫩葉的某種蠟質(zhì)成分，從而調(diào)控病原菌的侵染和增殖分化來實(shí)現(xiàn)蠟質(zhì)的化學(xué)防御功能。

另外，一些植物蠟質(zhì)成分被真菌角質(zhì)酶降解的產(chǎn)物，也可作為植物損傷相關(guān)分子模式的誘導(dǎo)子被植物模式識(shí)別受體所識(shí)別，通過誘導(dǎo)植物活性氧的積累，繼而啟動(dòng)下游包括超敏反應(yīng)在內(nèi)的一系列防御反應(yīng)[23-24]。如，外施無抑菌活性的蠟質(zhì)單體可增加大麥對(duì)白粉菌的抗性[25]。本研究測(cè)定了23 ℃和15 ℃培養(yǎng)的馬占相思嫩葉接種橡膠樹白粉菌后的SOD、CAT和POD氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)低溫馴化可以在一定程度上提高馬占相思嫩葉在接種白粉菌時(shí)的氧化酶活性。因此，推測(cè)低溫馴化也可能促進(jìn)馬占相思嫩葉生成可作為誘導(dǎo)子的蠟質(zhì)組分，當(dāng)被白粉菌侵染時(shí)激發(fā)了下游的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗病性。當(dāng)然本研究還有許多值得探討的問題，如，馬占相思葉片中哪種蠟質(zhì)成分發(fā)揮了對(duì)橡膠樹白粉病的抗病作用？低溫馴化是否還會(huì)通過影響蠟質(zhì)之外的物質(zhì)來提高馬占相思的抗病性？抗病相關(guān)機(jī)制需要代謝組和轉(zhuǎn)錄組等高通量分析手段和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究對(duì)不同溫度培養(yǎng)的馬占相思接種橡膠樹白粉菌，發(fā)現(xiàn)低溫馴化顯著增強(qiáng)了馬占相思對(duì)橡膠樹白粉菌的抗性；通過比較不同馴化溫度的嫩葉蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和組分差異，發(fā)現(xiàn)低溫馴化可促進(jìn)馬占相思嫩葉蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和主要成分的成熟化；進(jìn)一步比較不同溫度培養(yǎng)的葉片氧化酶活性發(fā)現(xiàn)，低溫馴化可以一定程度提高馬占相思接種橡膠樹白粉菌后的氧化酶活性。本研究初步探索了橡膠樹白粉病寄主的抗病機(jī)制，為橡膠樹的抗病育種提供了理論依據(jù)。