文│辛勤（山東省鄒城市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心）

胃腸道的完整性和腸道微生物群在營養(yǎng)吸收、免疫發(fā)育和抗病方面起至關(guān)重要的作用。胃腸道微生物群的改變可能對雞的飼料效率、生產(chǎn)力和健康產(chǎn)生不利影響。了解雞胃腸道微生物群的作用和目前微生物群研究方法對改善家禽胃腸道微生物群具有重要意義。當(dāng)前，細(xì)菌16S核糖體RNA基因測序的應(yīng)用極大提高了對雞胃腸道微生物群組成和多樣性的了解。筆者就雞腸道功能及影響雞胃腸道微生物群多樣性的因素進(jìn)行綜述，還比較和回顧了過去和現(xiàn)在用于雞腸道微生物群研究的方法。

一、雞胃腸道微生物群的作用

雞胃腸道分布著復(fù)雜的微生物群落，包括細(xì)菌、真菌、古生菌、原生動物和病毒。腸道微生物群可以附著在腸上皮細(xì)胞壁上形成保護(hù)屏障，從而減少致病菌定植的機(jī)會。這些細(xì)菌產(chǎn)生維生素（如維生素K和維生素B）、短鏈脂肪酸（如乙酸、丁酸和丙酸）、有機(jī)酸（如乳酸）和抗菌化合物（如細(xì)菌素），降低甘油三酯，并誘導(dǎo)非致病性免疫反應(yīng)，為動物提供營養(yǎng)和保護(hù)。另一方面，胃腸道微生物群也可能是沙門氏菌和彎曲桿菌等病原體的來源，它們可以傳播給人類，可能對公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

正常的腸道微生物群對宿主有好處也有壞處。共生微生物群提供的主要好處是競爭性地排除病原體或非本體微生物，免疫刺激，以及對宿主提供營養(yǎng)。此外，共生微生物群可以刺激免疫系統(tǒng)的發(fā)育，包括黏液層、上皮單層、腸道免疫細(xì)胞（如細(xì)胞毒性和輔助性T細(xì)胞、免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞和吞噬細(xì)胞）和固有層，在宿主和微生物之間建立屏障，對抗有害腸道微生物。在遠(yuǎn)端腸道（盲腸和結(jié)腸）中，微生物群也可產(chǎn)生能量和營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸和短鏈脂肪酸，最終為宿主所利用。這些短鏈脂肪酸具有抑菌特性，能消除食源性病原體，如沙門菌。短鏈脂肪酸也是動物的能量來源，并能進(jìn)一步刺激腸道上皮細(xì)胞增殖，從而增加胃腸道吸收表面積。短鏈脂肪酸的產(chǎn)生會降低結(jié)腸pH值，從而抑制膽汁向次級膽汁產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。此外，腸道微生物群還參與宿主氮化合物的代謝，盲腸細(xì)菌可以將尿酸轉(zhuǎn)化為氨，隨后被鳥類吸收，并進(jìn)一步用于生產(chǎn)谷氨酰胺等氨基酸。共生微生物群也會給宿主帶來危害。在近端腸道（砂囊和小腸）中，微生物群與宿主爭奪能量和蛋白質(zhì)。在近端和遠(yuǎn)端腸道中，微生物可產(chǎn)生有毒代謝物（如氨基酸分解代謝物）和分解膽汁酸，分別抑制雞只生長和降低脂肪消化率。微生物群的存在和活動增加了機(jī)體對能量和蛋白質(zhì)的需求，對雞的生長性能有一定影響。

不平衡的腸道微生物群通常被稱為腸道生態(tài)失調(diào)，可能導(dǎo)致胃腸道的一系列不良反應(yīng)，包括腸道屏障功能降低（如腸壁變薄）和營養(yǎng)物質(zhì)消化不良，增加了微生物群更替和炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。非傳染性和傳染性應(yīng)激源均可導(dǎo)致微生物群失調(diào)。非感染性因素包括環(huán)境應(yīng)激、營養(yǎng)失衡、飲食改變、霉菌毒素、管理不善、酶功能障礙或宿主遺傳。感染因素包括病毒或細(xì)菌侵入、球蟲病或有害微生物如產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的有毒代謝物。

腸道微生物群可進(jìn)一步分為腸腔內(nèi)微生物群和黏膜微生物群。腸腔內(nèi)微生物群的組成由可用營養(yǎng)物質(zhì)、抗菌物質(zhì)含量和飼料通過速率決定。黏膜附著菌群的組成受多種宿主因素的影響，如腸細(xì)胞膜上特異性黏附位點(diǎn)的表達(dá)、分泌免疫球蛋白的分泌和黏液的產(chǎn)生率。

腸道微生物群的組成和功能已被證明根據(jù)雞只日齡、在腸道中的位置和飲食成分而變化。日齡是影響胃腸道細(xì)菌組成、細(xì)胞密度和代謝功能的重要因素之一。隨著雞日齡的增長，梭狀芽孢桿菌的相對豐度較高，而乳酸桿菌在整個(gè)生長周期中含量較低。3日齡雞的腸道中含有乳酸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和彎曲桿菌，而7～21日齡雞的腸道中更常見的是嗜酸乳酸桿菌、腸球菌和鏈球菌，28～49日齡時(shí)，腸道中開始含有大量卷曲乳桿菌。腸道不同位置的微生物群大不相同，小腸中主要的細(xì)菌包括腸球菌、梭菌、乳酸桿菌、葡萄球菌、甲基桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌、埃希氏菌、彎曲桿菌、志賀菌和棒狀桿菌等；盲腸中主要的細(xì)菌包括甲烷球菌、乳酸螺旋桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌、梭菌、葡萄球菌、鏈球菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和彎曲桿菌等；大腸中主要的細(xì)菌包括乳酸桿菌和埃希氏桿菌。飼料成分直接影響到腸道微生物群，如飼料中的益生元對結(jié)腸中的一些細(xì)菌具有積極影響，低聚果糖和低聚半乳糖可增加雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，除Bifidobacterium bifidum（雙歧桿菌的一種）外，大多數(shù)雙歧桿菌菌株（如Bifidobacterium fiagilk、Bifidobacterium thetaiotaomicron、Bifidobacterium vulgatus、Bifidobacterium dktasonk和Bifidobacterium ovatus）都可以利用低聚果糖作為生長和發(fā)酵促進(jìn)劑。而大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等微生物無法利用低聚果糖作為發(fā)酵碳水化合物來源。另一種益生元，甘露寡糖與具有1型菌毛（甘露糖敏感凝集素）的潛在致病性革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）結(jié)合，防止病原體附著在腸壁上。因此，飲食中的益生元對下腸道的影響包括作為盲腸和結(jié)腸微生物群的食物和發(fā)酵源，發(fā)酵終產(chǎn)物（如不飽和脂肪酸）的產(chǎn)生，刺激糖解發(fā)酵；大腸內(nèi)容物的酸化，盲腸和結(jié)腸上皮的增生，刺激結(jié)腸激素肽的分泌和腸道內(nèi)容物在盲腸-肛門運(yùn)輸?shù)募铀佟Ｄc道微生物群的組成和功能還受到飼養(yǎng)管理、品種、性別和環(huán)境應(yīng)激等多種因素的影響。

二、雞胃腸道微生物群的研究方法

研究雞腸道微生物群的傳統(tǒng)方法是基于微生物培養(yǎng)，這些方法對特定條件下的可培養(yǎng)細(xì)菌具有高度選擇性。但大多數(shù)微生物難以被培養(yǎng)，一般認(rèn)為給定樣本中存在的極少數(shù)（僅為0.1%～1%）微生物群可以被培養(yǎng)。因此，腸道微生物群的豐富度（物種數(shù)量）和多樣性（相對豐度）難以通過培養(yǎng)的方法被了解和研究。

分子生物技術(shù)的發(fā)展為研究腸道不同部位微生物群的組成、多樣性、功能研究和預(yù)測，以及相互作用提供了新的研究方法，每種技術(shù)都有相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測序方法能廣泛鑒定腸道微生物群的屬、種、株，數(shù)據(jù)庫豐富，但成本高昂，耗時(shí)費(fèi)力。Realtime PCR方法能對靶向群體中的特異性基因表達(dá)，靈敏度高，同樣受限于成本。變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、時(shí)間溫度梯度凝膠電泳、末端限制性片段長度多態(tài)性和單鏈構(gòu)象多態(tài)性等方法能擴(kuò)增常見的16S rDNA序列，快速且方便比較，但只能提供相對粗略的分類和分辨，數(shù)據(jù)通常是定性或半定量的。其中，16S rRNA基因擴(kuò)增子的高通量測序已迅速成為雞胃腸道微生物群研究的首選方法。16S rRNA分子是核糖體的一個(gè)小亞基，具有所有細(xì)菌中高度保守的序列相似區(qū)域。從糞便或消化物樣本中提取微生物DNA，并使用靶向16S rRNA基因保守區(qū)的寬范圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這些擴(kuò)增產(chǎn)物的測序通?？梢栽趯倩蚍N水平上區(qū)分細(xì)菌，每個(gè)序列的相對豐度反映了原始樣本中該細(xì)菌的相對豐度。

高通量或下一代測序方法成為研究腸道微生物群的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)作用的有力工具。下一代測序方法已成為一種方便、快速、準(zhǔn)確的基因組研究方法，盡管有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在局限性，包括讀取時(shí)間短和成本高。宏基因組學(xué)已被用于研究盲腸功能、腸道對病原體攻擊的反應(yīng)、微生物反應(yīng)與生產(chǎn)性能參數(shù)的相關(guān)性、肥瘦肉雞品系的比較、病毒組描述和抗生素耐藥基因。然而，由于使用的數(shù)據(jù)平臺、品種、樣本類型、采樣方法等方面的差異，很難進(jìn)行比較。為了規(guī)避基于序列分析的一些限制，蛋白質(zhì)組學(xué)方法最近也被用于確定微生物群的代謝和功能特性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測量基因原位轉(zhuǎn)錄，即使在采樣過程中需要非常小心，也能準(zhǔn)確反映生理功能。多組學(xué)方法的開發(fā)和應(yīng)用對未來的研究非常重要，將有助于我們更好地了解如何根據(jù)環(huán)境、飲食和生理變化來優(yōu)化雞腸道微生物群，從而為提升雞的健康提供新的可能。