陳子杰, 劉臻, 伍倩, 廖力夫, 肖錫林, 譚琰

南華大學(xué) 1.衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院, 2.化學(xué)化工學(xué)院,湖南衡陽 421001

新型冠狀病毒,即嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),對全球的公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅,也對全球經(jīng)濟和社會發(fā)展造成了巨大沖擊。世界衛(wèi)生組織公布了五種關(guān)切變異株[1],即阿爾法(Alpha)、貝塔(Beta)、伽馬(Gamma)、德爾塔(Delta)、奧密克戎(Omicron),因此,準(zhǔn)確地篩查并確診SARS-CoV-2感染者是新冠疫情防控的首要任務(wù)。選擇合適的新型冠狀病毒檢測技術(shù)和方法在應(yīng)對傳染病暴發(fā)流行與診治防控方面起著關(guān)鍵作用。本文對目前應(yīng)用的SARS-CoV-2實驗室檢測方法進行概述,為新型冠狀病毒的檢測和防控提供參考。

1 SARS-CoV-2病原學(xué)結(jié)構(gòu)特點

SARS-CoV-2是目前發(fā)現(xiàn)的第7種β屬冠狀病毒,呈圓形或橢圓形,直徑60～140 nm。SARS-CoV-2基因組是單股正鏈的核糖核酸,大小27～32 kb。SARS-CoV-2除了有β冠狀病毒屬結(jié)構(gòu)的血凝素-酯酶蛋白外,還含有4種結(jié)構(gòu)蛋白,即表面刺突(spike,S)蛋白、核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和包膜(envelop,E)蛋白。SARS-CoV-2通過S蛋白能特異性地識別細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)并與之結(jié)合[2],隨后很快催化病毒基因組釋放到細(xì)胞中。S蛋白位于囊膜上,可分為N端S1結(jié)構(gòu)域和C端S2結(jié)構(gòu)域,S1結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合,S2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合作用。研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2的S蛋白對ACE2的親和力非常高,同時S蛋白也是大部分疫苗針對的標(biāo)靶[3]。

2 SARS-CoV-2主要檢測技術(shù)

2.1 病毒實驗室分離、培養(yǎng)、鑒定

Zhu等[4]將患者支氣管肺泡灌洗液的病毒接種到人呼吸道上皮細(xì)胞、猴腎Vere-E6和人肝癌Huh-7細(xì)胞株分離培養(yǎng)出新型冠狀病毒。SARS-CoV-2的分離培養(yǎng)在呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)只需96 h,在Vero-E6和Huh-7細(xì)胞系中分離培養(yǎng)則需6天。新型冠狀病毒的分離培養(yǎng)與鑒定為致病機制的研究、快速檢測試劑的開發(fā)、疫苗和抗病毒特效藥的研制奠定了基礎(chǔ)[5]。但病毒培養(yǎng)必須在生物安全三級及以上的實驗室進行,實驗操作存在很大的感染風(fēng)險,而且單次培養(yǎng)成本高。因此,當(dāng)面臨新冠感染人數(shù)多、檢測樣本量大的情況,病毒培養(yǎng)鑒定的方法則不適用。

2.2 高通量測序

高通量測序是新型冠狀病毒疫情初期檢出SARS-CoV-2的方法之一,其原理是對標(biāo)本的病毒核酸進行廣泛獨立平行的測序,通過比對生物信息來分析病毒的全部序列結(jié)構(gòu)。SARS-CoV-2的測序方法主要包括宏基因組測序、探針捕獲測序、多重PCR擴增子測序和納米孔靶向測序。研究表明,探針捕獲測序和多重PCR擴增子測序在高病毒載量(≥105copies/mL)標(biāo)本中都具有很好的富集效果,但在低病毒載量(≤104copies/mL)樣本中,多重PCR擴增子測序的富集效果更好[6]。納米孔靶向測序法是第三代測序方法,其檢測設(shè)備小巧便攜,同時適用于從臨床樣本中識別SARS-CoV-2的突變監(jiān)測。宏基因組測序平臺的建立需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員,不適用于SARS-CoV-2的快速檢測和大規(guī)模標(biāo)本的篩查和診斷,因此較難推廣普及。高通量測序目前主要用于科學(xué)研究,臨床醫(yī)療機構(gòu)的應(yīng)用還需要制定規(guī)范化的操作流程。

2.3 熒光定量PCR

SARS-CoV-2屬RNA病毒,熒光定量PCR法先將RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄為cDNA再進行擴增檢測,通過熒光定量PCR反應(yīng)所得到的樣本循環(huán)閾值的大小來判斷患者標(biāo)本中是否有SARS-CoV-2的存在。熒光定量PCR法一般能在4 h內(nèi)獲得結(jié)果。

由于RNA病毒容易發(fā)生變異,為了防止錯檢,SARS-CoV-2的實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測分別在ORF1ab基因、N基因上選取兩個靶標(biāo),同時在E基因上選取第3個靶標(biāo),能有效提高病毒的陽性檢出率。熒光定量PCR法對病毒RNA進行定量分析,檢測效率快,而且整個檢測過程無需對PCR產(chǎn)物進行后期處理,還可以使用特異性探針等方式降低非特異性擴增,降低了檢測過程中可能出現(xiàn)的污染和假陽性,具有操作便捷,特異度強,靈敏度高的優(yōu)點。診療方案提出,新型冠狀病毒核酸檢測陽性是確診新型冠狀病毒感染的首要標(biāo)準(zhǔn)[7]。熒光定量PCR法檢測結(jié)果容易受到采樣操作不規(guī)范,RNA易被環(huán)境RNase降解,核酸提取量不足和測試劑盒質(zhì)量不達(dá)標(biāo)等諸多因素影響而成假陰性,因此,應(yīng)對疑似患者多部位同時采樣,從而確保SARS-CoV-2檢出結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增

反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)在傳統(tǒng)的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)上,加入了有熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶,可同時進行核酸擴增和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),在50～65 ℃的條件下,1 h內(nèi)擴增DNA產(chǎn)量是常規(guī)PCR的100倍以上。李歡等[8]利用RT-LAMP技術(shù)建立了一種新型冠狀病毒核酸的快速檢測方法,只需要肉眼觀察即可判斷有無擴增反應(yīng)產(chǎn)物生成和確認(rèn)是否有靶基因存在,適合條件有限的邊境地區(qū)進行SARS-CoV-2的核酸檢測。RT-LAMP法不需要改變擴增中的溫度,而且具有靈敏度高、反應(yīng)時間短和擴增結(jié)果可直觀判讀的優(yōu)點。因此,該技術(shù)可現(xiàn)場快速檢測SARS-CoV-2,實現(xiàn)核酸提取、擴增和檢測一體化,但是恒溫擴增法對引物集的設(shè)計、專業(yè)人員技術(shù)要求較高。

2.5 基因芯片

基因芯片是微流控芯片的一種特殊類型,原理是通過微加工技術(shù),將大量特定的序列基因探針集成在硅片上,構(gòu)成一個高密度的探針陣列,再與標(biāo)記的樣品分子進行雜交,通過檢測雜交信號分子可得到樣品分子的序列結(jié)構(gòu)。博奧生物集團等研發(fā)了一款基于恒溫擴增芯片法的多病毒核酸聯(lián)合檢測試劑盒;該試劑盒獲得國家藥監(jiān)局應(yīng)急審批批準(zhǔn),并迅速應(yīng)用于中國SARS-CoV-2的檢測,能在90 min內(nèi)同時檢測包括新型冠狀病毒在內(nèi)的6種呼吸道病毒[9]?；蛐酒m然可以一次性對樣品中大量序列進行檢測分析,能快速同時檢測多種疾病,但是容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)成本昂貴,信息解讀復(fù)雜,難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大批量生產(chǎn),目前不能在多種病原體混合感染時鑒別主要病原體,不適于醫(yī)療機構(gòu)的常規(guī)檢測。

2.6 抗原抗體檢測

新型冠狀病毒抗體檢測試劑主要是檢測N蛋白和S蛋白IgM、IgG抗體。研究表明,高滴度恢復(fù)期抗體血漿治療有助于降低新冠病毒感染住院患者的死亡風(fēng)險[10]。在核酸檢測的基礎(chǔ)上,增加抗原檢測作為補充,可有助于早期篩查疑似SARS-CoV-2病例[11]。SARS-CoV-2的抗原抗體檢測主要包括膠體金免疫層析法和磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法。

2.6.1 膠體金免疫層析法 膠體金是氯金酸水溶液在還原劑作用下聚合成特殊大小的金顆粒,顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。SARS-CoV-2的膠體金免疫層析法檢測包括了抗原檢測和抗體檢測,兩種試劑盒均獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn),使用時應(yīng)當(dāng)注意區(qū)分開。膠體金免疫層析法的樣本為血清、血漿和鼻咽拭子,以實時熒光PCR法作為對比,IgM和IgG抗體檢測的靈敏度和特異度有所不同,二者聯(lián)合檢測的檢出率大大提高[12]。膠體金免疫層析法可實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢驗,可用于社區(qū)居民自我檢測,可在15～20 min即可肉眼觀察檢測結(jié)果,可輔助確診SARS-CoV-2,具有操作簡便、檢測時間短和無需復(fù)雜儀器等優(yōu)點。但是該法存在窗口期,具有無法定量檢測和有交叉反應(yīng)等缺點。作為前期篩選的陽性病例,仍然需要核酸檢測進行確診。

2.6.2 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法采用化學(xué)發(fā)光法和磁性納米粒子技術(shù)相結(jié)合。該方法比普通化學(xué)發(fā)光檢測法有更高的靈敏度和更快的檢測速度(只需30～60 min)。研究發(fā)現(xiàn),磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測IgM和IgG抗體陽性率均高于膠體金免疫層析法,兩種方法的IgM抗體檢測差異大于IgG抗體檢測[13]。該法具有檢測范圍寬、操作標(biāo)準(zhǔn)化的特點,但選擇性差,會對一系列的化合物做出反應(yīng),而且需要特殊的化學(xué)發(fā)光檢測分析儀,單次檢測成本較高,很難在醫(yī)院和基層社區(qū)進行普及。

2.7 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)

2.7.1 DETECTR DETECTR技術(shù)是利用Cas12a的特性建立的核酸檢測方法[14]:通過激活Cas12a使crRNA-Cas12a復(fù)合物與靶DNA結(jié)合并誘導(dǎo)與熒光報告分子偶聯(lián)的ssDNA的非特異性切割,從而釋放熒光信號,熒光信號可做成流層析紙條,以此判定目標(biāo)序列的存在,實現(xiàn)病毒DNA檢測可視化。Broughton等[15]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12的DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報告器新型SARS-CoV-2檢測系統(tǒng),可檢測SARS-CoV-2 N和E基因?？傊?DETECTR可將恒溫擴增與CRISPR/Cas檢測相結(jié)合,檢測時間<40 min,可通過定性和可視化的橫向流動分析輸出結(jié)果,實現(xiàn)快速且可視化的SARS-CoV-2核酸檢測。

2.7.2 SHERLOCK SHERLOCK技術(shù)是Gootenberg等[16]在拉沙熱等RNA病毒核酸檢測基礎(chǔ)上用Cas13a蛋白的非特異切割活性和重組酶聚合酶擴增技術(shù)所研發(fā)的一種核酸檢測方法;該方法設(shè)計了新型冠狀病毒的向?qū)NA,分別用于識別新冠病毒的S基因和ORF1ab基因。Gootenberg等[17]將SHERLOCK進一步改進,SHERLOCK V2將Cas13a與Csm6結(jié)合,實現(xiàn)了四通道(LwaCas13a、CcaCas13b、As-Cas12a、PsmCas13b)多重檢測分析與橫向金標(biāo)流動試紙讀數(shù),使靈敏度提高了3.5倍,能定量檢測到最低病毒載量為2×10-18mol/L。目前SHERLOCK技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于檢測鼻咽拭子樣本的SARS-CoV-2,實現(xiàn)了檢測限內(nèi)100%敏感的熒光信號監(jiān)測[18]。

2.7.3 STOPCovid STOPCovid技術(shù)采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增RT-LAMP和SHERLOCK技術(shù)相結(jié)合。先采用RT-LAMP在60 ℃下擴增病毒RNA,然后擴增的病毒核酸被Cas12b識別介導(dǎo)切割,最后把樣品添加到橫向流動試紙條進行檢測。STOPCovid技術(shù)是基于核酸檢測的即時檢驗,優(yōu)點是不需要從患者樣本中提取和純化RNA,檢測SARS-CoV-2只需在一個試管中一步完成,不需要使用任何大型的儀器,20～45 min就能獲得結(jié)果,而且靈敏度與熒光定量PCR一樣高。STOPCovid升級改進后,STOPCovid V2通過引入磁珠來富集SARS-CoV-2的RNA,去除了乙醇清洗和洗脫過程,將RNA富集過程精簡到15 min之內(nèi),使反應(yīng)起始RNA數(shù)量大大提高[19]。該方法的不足是檢測數(shù)據(jù)有限,需要進一步的臨床驗證來確定關(guān)鍵性能指標(biāo)。

綜上所述,基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,同時能定量檢測,在SARS-CoV-2的感染檢測中呈現(xiàn)出優(yōu)異的檢測性能。該技術(shù)具有操作步驟簡單、耗時短、污染小和檢測結(jié)果可視化的特點,有望成為檢測SARS-CoV-2的下一代主流核酸檢測技術(shù)[20]。但該技術(shù)對操作人員要求高,需要進行專業(yè)培訓(xùn),同時實驗檢測的數(shù)據(jù)還需要進行臨床驗證,研究體系和平臺仍需完善。表1對DETECTR、SHERLOCK、STOPCovid技術(shù)進行了比較。

表1 DETECTR、SHERLOCK、STOPCovid技術(shù)比較

3 總結(jié)與展望

快速有效地檢出SARS-CoV-2是疫情防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在了解SARS-CoV-2的病原學(xué)結(jié)構(gòu)特點后,可采用多種檢測方法來判斷結(jié)果。檢測過程中各個環(huán)節(jié)的疏忽都有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果,因此,SARS-CoV-2的檢測應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進行,如樣品的采集、保存、運輸、病毒預(yù)處理、RNA提取、擴增檢測、結(jié)果報告及對操作人員進行規(guī)范化技術(shù)培訓(xùn),同時注重對實驗室環(huán)境的清潔和安全管理工作。

目前,實時熒光PCR法仍然是診斷新冠病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)[21]?？乖贵w檢測可作為篩選SARS-CoV-2的前期手段,適應(yīng)于居家隔離群眾、密切接觸者、封控區(qū)和管控區(qū)內(nèi)人員。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)(DETECTR、SHERLOCK、STOPCovid)具有靈敏度高和特異性強的特點,在新型冠狀病毒感染檢測中呈現(xiàn)出優(yōu)異的檢測性能,是目前具有良好發(fā)展前景的檢測技術(shù)。為了發(fā)揮好快速檢測SARS-CoV-2在疫情防控中的關(guān)鍵作用,應(yīng)該就提高SARS-CoV-2檢測技術(shù)的靈敏度、特異性、樣品通量,減少檢測時間和檢測成本方面開展深入研究。信息化、智能化技術(shù)的廣泛運用,能夠為快速檢測SARS-CoV-2技術(shù)的發(fā)展提供更廣闊的思路。