高蕓, 王中群, 李麗華

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1.病理科, 2.心內(nèi)科,江蘇鎮(zhèn)江 212001

醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)是人體組織結(jié)構(gòu)重建的主要手段。利用微型CT對(duì)血管組織進(jìn)行重建,但受限于儀器分辨率不足等因素,血管壁鈣化斑塊和細(xì)胞外基質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)難以呈現(xiàn)[1]。依賴計(jì)算機(jī)優(yōu)化算法能精準(zhǔn)呈現(xiàn)影像技術(shù),但由于所需運(yùn)算量大,運(yùn)算時(shí)間過(guò)長(zhǎng),反而限制了實(shí)際的臨床應(yīng)用[2]。隨著計(jì)算機(jī)輔助人體組織連續(xù)切片(serial sections,SS)后三維重建技術(shù)的高速發(fā)展,不僅能精確展示人體組織復(fù)雜結(jié)構(gòu),并且可以多維度查看[3];通過(guò)與測(cè)量軟件的結(jié)合應(yīng)用,對(duì)重建的目標(biāo)組織進(jìn)行不同參數(shù)的測(cè)量,還可便于分析其空間結(jié)構(gòu)[4]。本文綜述基于計(jì)算機(jī)輔助組織連續(xù)切片后三維重建的研究進(jìn)展,對(duì)其過(guò)程方法和應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié),旨在為其應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。

1 三維重建前的組織切片準(zhǔn)備

1.1 組織包埋

1.1.1 石蠟包埋法 組織標(biāo)本在10%多聚甲醛溶液中固定24 h[5]。待標(biāo)本固定完全后,依據(jù)需求切取合適部位,分成厚度約3 mm,面積約2 cm×1.5 cm的連續(xù)小塊,區(qū)分近心端和遠(yuǎn)心端,按順序標(biāo)號(hào),保證取材過(guò)程中切面的平整。所取標(biāo)本組織放入包埋盒經(jīng)脫水處理完畢后取出,按所標(biāo)順序?qū)⑶忻尜N于裝有液態(tài)石蠟的金屬包埋盒底模并輕壓組織防止出現(xiàn)氣泡,待組織冷卻凝固后進(jìn)行切片。石蠟包埋法所做切片具有能夠完整展現(xiàn)組織形態(tài)的優(yōu)勢(shì),但因處理過(guò)程較長(zhǎng),石蠟浸入組織導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,組織體積縮小,對(duì)后期進(jìn)行特殊染色和完整結(jié)構(gòu)重建的效果產(chǎn)生一定的影響[6]。

1.1.2 冷凍切片法 常規(guī)冷凍技術(shù)是將所取新鮮組織切取合適大小并用冷凍切片包埋劑完全包裹后,直接置于冷凍切片機(jī)中等待冷凍凝固后切片,亦可采用液氮直接冷凍標(biāo)本。孫紅星等[7]將液氮冷凍包埋技術(shù)分為液氮浸入法(快速冷凍)、液氮漂浮法(較慢冷凍)和直接-80 ℃法。對(duì)于骨骼肌適合采用液氮浸入法處理,而心肌和平滑肌則適合采用液氮漂浮法處理。用冷凍包埋方法所做的切片能更好地保持組織細(xì)胞抗原的活性,但對(duì)操作技術(shù)要求較高,處理方法受組織組成成分的影響較大[8];脂肪較多的組織,冷凍的時(shí)間有所增加;而較致密的組織冷凍時(shí)間則不宜過(guò)長(zhǎng)[9]。冷凍切片雖不會(huì)對(duì)組織的體積和細(xì)胞的形狀造成影響,但對(duì)于組織內(nèi)微小結(jié)構(gòu)的展示上有一定的缺陷[10]。

1.1.3 瓊脂石蠟雙包埋法 瓊脂石蠟雙包埋法是將所需組織切成合適的大小后,用配比好的瓊脂液將其完全包裹后,再采用常規(guī)石蠟包埋法進(jìn)行處理。賓業(yè)健等[11]對(duì)小鼠血管采用瓊脂石蠟雙包埋法處理,在切片中可以觀察到完整的血管內(nèi)膜,且管腔圓潤(rùn)不皺縮。Dahele等[12]將肺非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)本采用瓊脂石蠟雙包埋處理后連續(xù)切片重建了三維模型,發(fā)現(xiàn)此方法可以保證肺組織在切片時(shí)不會(huì)發(fā)生塌陷。瓊脂石蠟雙包埋法既保證了組織能夠在切片上完整展現(xiàn),又避免了組織因?yàn)槊撍a(chǎn)生的變形問(wèn)題;但操作結(jié)果受瓊脂含量影響較大,不同的組織處理時(shí)所需瓊脂含量有所差異,過(guò)稀會(huì)產(chǎn)生組織脫水后變形,過(guò)于濃稠會(huì)導(dǎo)致組織脫水不完全發(fā)生垮塌等問(wèn)題。

1.2 組織連續(xù)切片和切片染色

完整組織的連續(xù)切片是后續(xù)三維重建的基礎(chǔ),切片時(shí)需厚度一致,組織平整,連貫等距[4],避免攤片溫度不合適導(dǎo)致組織不能完全攤開(kāi)或散開(kāi)過(guò)大,以及因?yàn)榈镀睋p產(chǎn)生不必要的刀痕。

在切片厚度的選擇上,常規(guī)石蠟切片的厚度一般為3～5 μm。吉佳樂(lè)等[13]對(duì)不同石蠟切片厚度進(jìn)行相同的免疫標(biāo)記,經(jīng)對(duì)比,6、8 μm厚度的切片比2 μm厚度切片的非特異性染色多,且組織結(jié)構(gòu)存在脫落的現(xiàn)象;而切片厚度為4 μm時(shí),組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,背景干凈更利于細(xì)胞計(jì)數(shù)。冷凍切片的厚度可稍大,一般為8～10 μm;當(dāng)組織較致密時(shí),切片厚度5 μm即可;對(duì)于脂肪含量較多的組織,可大于10 μm,以保證組織結(jié)構(gòu)的完整[9]。對(duì)于較小、較干的組織,為防止脫片,宜選用膠片來(lái)保證切片完整[10]。

完整組織的三維重建要求染色清晰易區(qū)分,常規(guī)HE染色可滿足基本的三維重建需求。除此之外,某些組織或結(jié)構(gòu)可采用特殊的染色方法使其更清晰易識(shí)別;例如用CD31抗體染色顯示斑塊表面的內(nèi)皮剝脫程度[14];α-action抗體染色可以顯示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊富含平滑肌細(xì)胞[14];通過(guò)EVG染色對(duì)彈力纖維進(jìn)行染色[15];通過(guò)茜素紅S鈣染色法或馮·科薩染色法,可以對(duì)組織中的鈣化成分進(jìn)行染色識(shí)別等[1]。

2 計(jì)算機(jī)輔助下的圖片配準(zhǔn)和重建

2.1 圖片配準(zhǔn)

圖片配準(zhǔn)是組織結(jié)構(gòu)三維重建前的重要步驟。如果要使所構(gòu)建的三維模型準(zhǔn)確,需找到精準(zhǔn)且高效的定位點(diǎn),以保證相鄰組織切片吻合連貫。配準(zhǔn)采用的定位一般分為硬定位和軟定位兩種方法。

2.1.1 硬定位 指采用各種機(jī)械方法在組織連續(xù)的切片上標(biāo)記參考點(diǎn),通過(guò)連續(xù)的參考點(diǎn)對(duì)齊來(lái)達(dá)到定位效果。硬定位方法又分為內(nèi)定位法和外定位法兩種。內(nèi)定位法是根據(jù)組織的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn),在切片圖像中尋找特定的定位結(jié)構(gòu)進(jìn)行定位,存在因生物組織結(jié)構(gòu)形態(tài)復(fù)雜,導(dǎo)致定位誤差較大的缺點(diǎn)。外定位法是在目標(biāo)組織上作標(biāo)記進(jìn)行定位,通常利用細(xì)針、激光或微電極穿孔,再通過(guò)基孔的對(duì)齊來(lái)實(shí)現(xiàn)切片的對(duì)位[16]。

2.1.2 軟定位 指依據(jù)生物組織的連續(xù)性和完整性,通過(guò)一定的配準(zhǔn)算法和計(jì)算機(jī)軟件的輔助實(shí)現(xiàn)兩幅連續(xù)切片圖像間的對(duì)齊[15]。

由于軟定位法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),目前主要采用硬定位方法,基于定位誤差考慮,又以外定位法最為常用。不同于以往直接用細(xì)針或是激光穿孔等常規(guī)手段,現(xiàn)一般將女性頭發(fā)貼附于所取組織,一起用冷凍切片包埋劑包埋后冷凍切片,或?qū)㈩^發(fā)粘在針灸針末端,在周圍脂肪組織內(nèi)穿3～4根女性發(fā)絲,作為后期三維重建的定位標(biāo)識(shí)[17]。高鴿等[18]認(rèn)為,頭發(fā)會(huì)在組織切片上留下明顯刀痕,導(dǎo)致圖片的完整性受到破壞,同時(shí)在染色的過(guò)程中容易發(fā)生脫片等現(xiàn)象;對(duì)此可采用在伊紅染液中浸泡了24 h的苞米穗代替頭發(fā),以解決脫片和圖片破壞的問(wèn)題。

2.2 三維重建

染色完成的切片借助光學(xué)顯微鏡的觀察適當(dāng)描出組織邊界,以便于后續(xù)采用高清掃描儀將完整切片圖片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)內(nèi)[19]。將掃描完成的圖片導(dǎo)入Adobe Photoshop軟件內(nèi),以第1張切片圖片為基準(zhǔn),通過(guò)預(yù)先設(shè)置的定位點(diǎn),將其余圖片依次導(dǎo)入、配準(zhǔn),調(diào)節(jié)圖片透明度為50%～60%。連續(xù)切片配準(zhǔn)完成后,導(dǎo)入三維重建軟件進(jìn)行三維重建[16]。

3 應(yīng)用和展望

目前,國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者已將組織連續(xù)切片三維重建技術(shù)運(yùn)用在實(shí)踐中?，F(xiàn)有研究在HE染色下進(jìn)行組織三維重建的基礎(chǔ)上,開(kāi)始結(jié)合免疫組化、免疫熒光等技術(shù),進(jìn)一步完善和優(yōu)化組織三維重建技術(shù),探索和拓展其在臨床診斷與疾病治療等方面的應(yīng)用。

基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù),由于其準(zhǔn)確性和易于觀測(cè)等特點(diǎn),在組織的結(jié)構(gòu)性研究上有著顯著的優(yōu)勢(shì)。熊波等[17]發(fā)現(xiàn),高血壓犬腎動(dòng)脈近端的腎交感神經(jīng)數(shù)量較非高血壓犬顯著增多;Enderle等[20]結(jié)果表明,腫瘤芽主要與病變的主要腫塊有關(guān),并闡明了腫瘤間的異質(zhì)性;Kuwajima等[21]研究不僅揭示了突觸結(jié)構(gòu)之間的連接,還檢測(cè)到多泡小體分布的變化以及刺突等高度復(fù)雜的神經(jīng)纖維成分的結(jié)構(gòu)變化。三維重建技術(shù)不僅僅局限于組織病理學(xué),王博等[22]針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)切片后的三維重建,可以更全面、客觀地展示細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。

通過(guò)結(jié)合免疫組化、免疫熒光等技術(shù),基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)在腫瘤組織的研究應(yīng)用方面更為廣泛和深入。錢立宇等[23]通過(guò)對(duì)乳腺癌的前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node,SLN)進(jìn)行連續(xù)切片后三維重建,發(fā)現(xiàn)可以增加SLN微轉(zhuǎn)移的檢出率;Yagi等[24]發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞通過(guò)肺泡中的空氣傳播并且對(duì)附著的血管具有選擇性。在Fujisawa等[25]的研究中,通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比提出了組織連續(xù)切片的適宜厚度,同時(shí)也針對(duì)不同免疫組化標(biāo)記對(duì)配準(zhǔn)的影響提出了相關(guān)建議,例如Ki67對(duì)細(xì)胞核的免疫標(biāo)記不適宜作為配準(zhǔn)的參照,并在一系列對(duì)比實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)乳腺腫瘤的血管、被癌細(xì)胞包裹的腦血管以及混合性纖維瘤的主要血管分別進(jìn)行了免疫標(biāo)記后的三維重建;Wang等[26]證明了全層組織連續(xù)切片后三維重建是研究腫瘤的侵襲模式和對(duì)切緣評(píng)估的最理想方式。Ueda等[27]發(fā)現(xiàn),組織三維重建技術(shù)更有助于了解腫瘤表面的微結(jié)構(gòu)和微血管。

基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)可廣泛應(yīng)用于各類組織中[4-5,28-33]。相較于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù),基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)在揭示血管結(jié)構(gòu)、探究血管病變機(jī)理等方面可以提供更準(zhǔn)確與精細(xì)的結(jié)果(表1)。

表1 部分血管三維重建技術(shù)的應(yīng)用

4 結(jié) 語(yǔ)

基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)所得到的組織結(jié)構(gòu),可以清晰、準(zhǔn)確、完整地呈現(xiàn)各部位細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)。盡管該技術(shù)存在操作復(fù)雜、大量重復(fù)性工作等弊端,但并不影響其為病理組織復(fù)雜的結(jié)構(gòu)提供了真實(shí)還原的解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),因此,基于組織連續(xù)切片后三維重建技術(shù)成為醫(yī)務(wù)工作者及相關(guān)研究人員理解病理組織的強(qiáng)有力的工具,也為基礎(chǔ)科學(xué)和臨床科學(xué)的學(xué)生提供了一種高效的學(xué)習(xí)工具。組織三維重建技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步為未來(lái)3D生物打印技術(shù)的實(shí)用化提供了最重要的理論基礎(chǔ),為人類保障健康,延續(xù)生命帶來(lái)新的希望。