王心淼 王玉玨 鄭麗瑩 張敬軒 陳 曄

白內(nèi)障是致盲的主要原因[1]。高血糖水平的持續(xù)存在具有生理毒性,在白內(nèi)障的發(fā)展過(guò)程中最為明顯。研究表明,糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)病率遠(yuǎn)高于非糖尿病患者[2]。白內(nèi)障是由晶狀體內(nèi)的氧化應(yīng)激引起,長(zhǎng)時(shí)間的氧化應(yīng)激可引起上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生[3]。晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)參與了晶狀體纖維的分化過(guò)程,其中EMT是關(guān)鍵環(huán)節(jié),進(jìn)一步研究LEC的EMT與氧化應(yīng)激的關(guān)系,是開(kāi)發(fā)糖尿病性白內(nèi)障治療策略的必要條件[4]。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為18～23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在晶狀體、視網(wǎng)膜和其他眼組織中表達(dá)[5]。miR-34a參與LEC的EMT,并在大鼠晶狀體中表達(dá)。同時(shí),白內(nèi)障患者晶狀體中miR-34a-5p明顯上調(diào),提示miR-34a-5p可能對(duì)白內(nèi)障發(fā)生有影響[6]。因此,本研究探討miR-34a-5p在LEC的EMT中的作用和機(jī)制,為研究糖尿病性白內(nèi)障靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LEC(上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù));胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1)和DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為33.3 mmol·L-1)(美國(guó)Invitrogen公司);雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(深圳市東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)科技有限公司);miRNA陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-34a-5p抑制物和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Promega公司);四噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Amresco公司);丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所);Trizol、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司);RIPA 裂解液(武漢博士德生物工程有限公司);β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、上皮型E鈣黏蛋白(E-cadherin)、鼠雙微體4(MDM4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2)和β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Revco公司);HBS-1096B 酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);PCR擴(kuò)增儀和BD垂直電泳儀(美國(guó)Life Technologies公司)。

1.2 miR-34a-5p與MDM4結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

進(jìn)入Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.targetscan.org/vert_80/),在“Select a species ”選擇“Human”物種信息,在“Enter a microRNA name”位置輸入miR-34a-5p,在“Enter a human gene symbol”位置輸入MDM4,探索miR-34a-5p與MDM4是否存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3 LEC的轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶檢測(cè)

按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)方法,將MDM4野生型/突變型(WT/MUT)與miR-NC和miR-34a-5p抑制物轉(zhuǎn)染到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LEC中,轉(zhuǎn)染48 h后,用雙熒光素酶檢測(cè)試劑分析MDM4野生型/突變型(WT/MUT)熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞分組

在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2環(huán)境下用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC,待細(xì)胞達(dá)到80%后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組(DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC);(2)高糖組(DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC);(3)miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC后用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC);(4)miR-34a-5p抑制物組(轉(zhuǎn)染miR-34a-5p抑制物后用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,24 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法檢測(cè)LEC細(xì)胞增殖

按1.4分組處理LEC,以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中(每孔200 μL),20 h后加入MTT(每孔50 μL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入二甲基亞砜(每孔200 μL),用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定吸光度(OD),計(jì)算細(xì)胞增殖率,細(xì)胞增殖率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白孔)/(OD對(duì)照組-OD空白孔)×100%。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LEC細(xì)胞遷移

以每孔5×104個(gè)LEC接種于6孔板中(每孔2 mL),待細(xì)胞貼壁后,用100 μL滅菌槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕,用無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)基清洗,按1.4分組處理LEC 24 h后,用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度,計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)LEC中MDA和SOD水平

按1.4分組處理LEC,以1×106個(gè)·mL-1接種于6孔板中(每孔3 mL),24 h后收集細(xì)胞,離心棄上清,加入1 mL磷酸鹽緩沖液,用細(xì)胞超聲破碎儀處理30 s,離心取上清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組LEC中MDA和SOD水平。

1.8 RT-PCR檢測(cè)LEC中miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA表達(dá)

按1.4分組處理LEC,以1×106個(gè)·mL-1接種于6孔板中(每孔3 mL),24 h后收集細(xì)胞,離心棄上清,加入Trizol試劑,從LEC中提取總RNA,再將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,40個(gè)循環(huán),采集熒光(61 ℃),PCR反應(yīng)成分:一步法反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液5 μL,前置引子(10 μmol·L-1)和反置引子(10 μmol·L-1)各0.4 μL、超級(jí)酵素混合物0.2 μL、RNA模板0.6 μL、雙蒸水3.4 μL),各目標(biāo)mRNA的引物序列見(jiàn)表1,采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(以β-actin為內(nèi)參)。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測(cè)LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)

按1.4分組處理LEC,以1×106個(gè)·mL-1接種于6孔板中(每孔3 mL),24 h后收集細(xì)胞,離心棄上清,用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解20 min,離心棄上清,進(jìn)行電泳(每孔20 μg),將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上,將膜與MDM4(1：200)、TGF-β2(1：300)、β-catenin(1：300)、E-cadherin(1：400)和β-actin(1：1 000)抗體進(jìn)行孵育,4 ℃過(guò)夜,將二抗(1：10 000)在室溫下孵育30 min。進(jìn)行顯色,采集圖像進(jìn)行分析(以β-actin 為內(nèi)參)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-34a-5p對(duì)MDM4的靶向調(diào)節(jié)作用

檢索Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),miR-34a-5p對(duì)MDM4有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。與對(duì)照組和miR-NC組(1.00±0.29、1.04±0.07)相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中MDM4-MUT熒光素酶活性(0.64±0.10)均明顯降低(均為P<0.05),對(duì)照組和miR-NC組LEC中MDM4-MUT熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);對(duì)照組、miR-NC組及miR-34a-5p抑制物組LEC中MDM4-WT熒光素酶活性分別為1.00±0.15、0.97±0.12、1.05±0.10,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明miR-34a-5p與MDM4存在靶向調(diào)節(jié)作用。

圖1 miR-34a-5p與MDM4 mRNA的互補(bǔ)配對(duì)系列

2.2 miR-34a-5p對(duì)LEC細(xì)胞增殖和遷移的影響

四組LEC細(xì)胞增殖率及劃痕愈合率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.053、20.679,均為P<0.001)。與對(duì)照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC細(xì)胞增殖率和劃痕愈合率均增加(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC細(xì)胞增殖率和劃痕愈合率均降低(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組LEC細(xì)胞增殖率和劃痕愈合率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表2)。

表2 各組LEC細(xì)胞增殖率和遷移率

2.3 miR-34a-5p對(duì)LEC中MDA和SOD的影響 四組LEC中MDA及SOD比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.216、30.318,均為P<0.001)。與對(duì)照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC中MDA均增加,SOD均降低(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中MDA均降低,SOD均增加(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組LEC中MDA、SOD差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表3)。

表3 各組LEC中MDA和SOD水平

2.4 miR-34a-5p對(duì)LEC中miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA的影響

四組LEC中miR-34a-5p、MDM4及TGF-β2 mRNA比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.196、14.062、28.533,均為P<0.001)。與對(duì)照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC中miR-34a-5p和TGF-β2 mRNA均增加,MDM4 mRNA均降低(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中miR-34a-5p和TGF-β2 mRNA均降低,MDM4 mRNA均增加(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組LEC中miR-34a-5p、NDM4、TGF-β2 mRNA差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表4)。

表4 各組LEC中miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA表達(dá)

2.5 miR-34a-5p對(duì)LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白的影響

表5 各組LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)

四組LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.435、12.034、15.362、30.411,均為P<0.001)。與對(duì)照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC中TGF-β2和β-catenin蛋白均增加,MDM4和E-cadherin蛋白均降低(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中TGF-β2和β-catenin蛋白均降低,MDM4和E-cadherin蛋白均增加(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組MDM4、TGF-β2、β-catenin、E-cadherin蛋白差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表5、圖2)。

A:對(duì)照組;B:高糖組;C:miR-NC組;D:miR-34a-5p抑制物組。圖2 miR-34a-5p對(duì)LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白的影響

3 討論

目前,白內(nèi)障唯一有效的治療方法是手術(shù)干預(yù),而白內(nèi)障術(shù)后2～5年內(nèi),很多患者出現(xiàn)了晶狀體后囊膜混濁(PCO),導(dǎo)致20%～40%的患者視力下降[7]。PCO主要是白內(nèi)障術(shù)后殘余LEC發(fā)生了EMT、增殖和遷移等多種細(xì)胞病理過(guò)程[8]。EMT是PCO發(fā)展的主要原因,在EMT過(guò)程中,LEC分化為成纖維細(xì)胞,失去細(xì)胞極性和上皮細(xì)胞特性,獲得間充質(zhì)性質(zhì),如運(yùn)動(dòng)性、侵襲性和抗凋亡能力[9]。因此,抑制EMT可以防止PCO的發(fā)展,而調(diào)控PCO發(fā)展的潛在分子機(jī)制尚不清楚。

表達(dá)異常的miRNA已在眼病中被發(fā)現(xiàn),包括伴有糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC),并且miRNA參與多種眼病的發(fā)病機(jī)制已被認(rèn)識(shí),這意味著miRNA是ARC中重要的靶向治療的生物標(biāo)志物[10]。miR-34a-5p在白內(nèi)障的LEC中表達(dá)上調(diào),miR-34a-5p在TGF-β2誘導(dǎo)的原發(fā)性白內(nèi)障的LEC中表達(dá)水平上調(diào)[11]。TGF-β2被認(rèn)為是PCO中EMT相關(guān)變化的關(guān)鍵觸發(fā)因素。TGF-β2通過(guò)Smads通路、蛋白激酶B(Akt)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路等途徑在LEC中激活和促進(jìn)EMT過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[12-13]。此外,TGF-β2是房水中TGF-β家族的主要亞型[14]。因此,TGF-β2誘導(dǎo)的LEC可用于模擬PCO中EMT微環(huán)境。本研究結(jié)果顯示,高糖誘導(dǎo)后,LEC中miR-34a-5p和TGF-β2水平升高,證實(shí)了上述的研究結(jié)果,也證實(shí)了高糖誘導(dǎo)的LEC的EMT模型成功。在胰腺癌細(xì)胞和組織中發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p升高,在胰腺癌細(xì)胞系中miR-34a-5p的下調(diào)通過(guò)抑制間充質(zhì)標(biāo)志物和上調(diào)上皮標(biāo)志物來(lái)抑制EMT[15]。同時(shí),miR-34a-5p表達(dá)升高促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移和EMT[16]。本研究結(jié)果顯示,通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-34a-5p抑制劑,β-catenin表達(dá)降低,E-cadherin表達(dá)升高,證明LEC的EMT受到抑制,細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)也證實(shí)上述結(jié)論。

miRNA通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其功能。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告顯示,miR-34a-5p與MDM4之間存在結(jié)合位點(diǎn),且直接靶向MDM4。MDM4是EMT的生物標(biāo)志物,MDM4表達(dá)不足已被認(rèn)為是EMT的一個(gè)顯著特征[17]。同時(shí),miR-34a-5p在調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展過(guò)程中通過(guò)MDM4調(diào)控EMT發(fā)揮重要作用。有研究顯示,MDM4在TGF-β2誘導(dǎo)PCO附著的LEC中表達(dá)降低[18],這與本研究結(jié)果一致。因此,本研究推測(cè)miR-34a-5p/MDM4參與了LEC的EMT過(guò)程。MDM4也是一種轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)節(jié)包括γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亞基血紅素氧合酶1(HO-1)在內(nèi)的抗氧化酶的表達(dá),以防止脂質(zhì)介導(dǎo)的損傷和氧化應(yīng)激[19]。敲低MDM4導(dǎo)致轉(zhuǎn)染miR-34a-5p抑制劑的人單核/巨噬細(xì)胞1(THP-1)脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激損傷上調(diào),這表明MDM4部分抵消了miR-34a-5p對(duì)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激損傷和凋亡的抑制作用,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[20]。本研究結(jié)果也證實(shí),通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-34a-5p抑制劑,高糖誘導(dǎo)的LEC中MDA降低,SOD升高,也進(jìn)一步為氧化應(yīng)激和EMT的調(diào)控搭建了一個(gè)橋梁。

4 結(jié)論

miR-34a-5p在糖尿病性白內(nèi)障LEC細(xì)胞模型中表達(dá)上調(diào),下調(diào)miR-34a-5p可以靶向促進(jìn)MDM4的表達(dá),抑制高糖誘導(dǎo)的LEC的EMT進(jìn)程,提示miR-34a-5p/MDM4可能成為糖尿病性白內(nèi)障治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。然而,這些發(fā)現(xiàn)是基于體外有限數(shù)量的細(xì)胞,應(yīng)使用動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)論。即便如此,這項(xiàng)研究也為糖尿病性白內(nèi)障提供了一種有前景的基于miRNA的治療策略。