李桐棲 孔德平 孫曉東

脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(NVAMD)的典型病理特征[1],目前50%～60%的NVAMD患者對抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的一線治療方案反應(yīng)不完全,存在持續(xù)性疾病活動[2-4],仍需尋找新的治療靶點。巨噬細胞是組織穩(wěn)態(tài)修復(fù)與重塑的關(guān)鍵免疫細胞,在調(diào)節(jié)病理性血管新生過程中至關(guān)重要[5-6],在NVAMD患者的病灶上可觀測到巨噬細胞的顯著浸潤[7],然而研究發(fā)現(xiàn),抑制巨噬細胞的募集[8-9]或玻璃體內(nèi)注射巨噬細胞[10]均可顯著抑制CNV病灶,因此,需要進一步明確巨噬細胞的致病機制。

巨噬細胞是高可塑性細胞,在響應(yīng)局部微環(huán)境的刺激中,獲得不同功能表型,包括由脂多糖(LPS)激活的經(jīng)典激活狀態(tài)(M1) 和由白細胞介素(IL)-4等激活的替代激活狀態(tài) (M2)[11]。M2巨噬細胞被認為是促脈絡(luò)膜新生血管形成的主要功能表型,敲除IL-10[12]或抑制ROCK通路[13]進而抑制M2極化可顯著抑制CNV。然而,釋放炎性因子的M1巨噬細胞也被認為存在促血管作用[14],在NVAMD患者的眼中,房水中的炎性因子水平與CNV病灶的大小及活動程度相關(guān)[15],炎性巨噬細胞可通過δ樣蛋白4通路誘導血管芽的形成[16],表達IL-1、IL-6的炎性巨噬細胞對CNV形成至關(guān)重要[17-18]。迄今為止,驅(qū)動血管生成的巨噬細胞的確切表型及形成機制仍不明確。新近研究表明,代謝重編程是巨噬細胞效應(yīng)功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素[19-20],因此,深入了解巨噬細胞促血管新生表型的代謝變化及形成機制,有望進一步明確其致病作用,為NVAMD治療提供新靶點。

1 巨噬細胞的代謝重編程

巨噬細胞的代謝重編程,即巨噬細胞代謝改變與其免疫功能調(diào)節(jié)的關(guān)系,是免疫領(lǐng)域新近關(guān)注的重要方向。巨噬細胞具有顯著的代謝靈活性,在其活化啟動及效應(yīng)過程中,巨噬細胞改變其原有的代謝途徑,其胞內(nèi)代謝物組成顯著改變。近年代謝研究技術(shù)的進步,使得細胞內(nèi)代謝物得以量化,并得以進一步繪制細胞中激活的代謝途徑,極大地加深了我們對巨噬細胞重編程的理解。過去認為,細胞代謝僅作用于能量調(diào)節(jié),而越來越多的證據(jù)顯示,代謝調(diào)節(jié)是巨噬細胞重編程功能表型的關(guān)鍵因素[19-20]。

1.1 關(guān)鍵代謝酶與代謝物調(diào)節(jié)巨噬細胞效應(yīng)功能及活化表型

在巨噬細胞的效應(yīng)過程中,關(guān)鍵代謝酶的調(diào)節(jié)可以影響細胞功能。例如,在LPS誘導的巨噬細胞中,關(guān)鍵代謝酶M2型丙酮酸激酶(PKM)2不僅參與糖酵解調(diào)節(jié),還與缺氧誘導因子1α(HIF1α)相互作用促進炎性因子IL-1β的轉(zhuǎn)錄[21-22]。許多糖酵解酶都被證明與巨噬細胞的促炎功能有關(guān),己糖激酶1參與炎性小體激活[23],而甘油醛-3-磷酸脫氫酶控制著重要細胞因子α腫瘤壞死因子的轉(zhuǎn)錄后表達[24-25]。除了調(diào)控關(guān)鍵細胞因子的表達和效應(yīng)通路之外,調(diào)節(jié)代謝酶還可以直接改變巨噬細胞極化狀態(tài),如研究發(fā)現(xiàn),誘導PKM2進入四聚體狀態(tài),可使巨噬細胞的基因表達從M1表型重編程為M2表型[26]。

代謝物的改變是另一調(diào)節(jié)巨噬細胞的重要途徑。代謝物通常通過與代謝酶活性位點的競爭性和變構(gòu)結(jié)合,調(diào)節(jié)酶的活性以調(diào)節(jié)代謝途徑[27]。新近研究發(fā)現(xiàn),代謝物與蛋白質(zhì)(如受體)的結(jié)合會誘導特定的細胞反應(yīng),從而激活特定的信號通路。例如,琥珀酸受體(GPR)91是琥珀酸的細胞表面?zhèn)鞲衅?可增強IL-1β的產(chǎn)生[28]; GPR132可以感知乳酸并對其做出反應(yīng),促進小鼠巨噬細胞中M2表型的產(chǎn)生[29-30]。除了直接作用外,代謝物還可以作為翻譯后修飾的底物,通過調(diào)節(jié)組蛋白或功能蛋白改變下游基因的轉(zhuǎn)錄或關(guān)鍵通路。作為調(diào)節(jié)巨噬細胞功能的重要代謝物,來自糖酵解的代謝物如乳酸,來自三羧酸(TCA)循環(huán)的代謝物如乙酰輔酶A、琥珀酸、衣康酸,及脂質(zhì)和氨基酸代謝過程中衍生的棕櫚酸、谷氨酸近年來受到廣泛的關(guān)注[31]。

1.2 巨噬細胞活化表型的形成依賴特異代謝途徑

不同功能表型的巨噬細胞激活不同的關(guān)鍵代謝途徑。例如,在暴露于促炎刺激物(例如 LPS)后,炎性巨噬細胞葡萄糖攝取大量增加,糖酵解活性顯著升高,而TCA循環(huán)存在兩處特異性中斷,導致氧化磷酸化活性受到抑制。與之不同的是,IL-4活化的M2巨噬細胞保持完整的TCA循環(huán),除了氧化磷酸化及脂肪酸代謝通路高度上調(diào)外,M2極化激活特異性的谷氨酰胺分解和核苷酸糖合成代謝模塊[32]。

更重要的是,進一步研究發(fā)現(xiàn),改變代謝途徑對巨噬細胞表型調(diào)節(jié)存在特異性。例如,在M2激活中,使用N-糖基化抑制劑顯著抑制其特異標志蛋白白細胞分化抗原(CD)206、CD301的表達,但僅輕微影響M1蛋白標志及M1特異細胞因子的表達;同樣,剝奪谷氨酰胺對M2極化有著顯著影響,其特異CC類趨化因子(CCL)22分泌蛋白水平顯著下調(diào),但不改變M1標志物一氧化氮合酶(NOS)2的表達。因此,代謝途徑在不同巨噬細胞活化表型的形成中起著直接、特異和關(guān)鍵的作用。

2 促血管新生型巨噬細胞的代謝調(diào)節(jié)

巨噬細胞在血管新生的不同過程中都起著重要調(diào)節(jié)作用,包括早期發(fā)芽、吻合及晚期新血管的穩(wěn)定。在血管新生早期,暴露于促血管生成信號的內(nèi)皮細胞經(jīng)歷遷移和增殖,從預(yù)先存在的血管中形成新芽。巨噬細胞是促血管生成信號的重要來源,包括VEGF-A、TGF-β、CCL18、軸突導向蛋白(Sema)4D等多種因子[33]。除旁分泌作用外,巨噬細胞可通過直接接觸刺激介導血管芽的生長,并充當尖端細胞形成吻合的細胞伴侶,有助于血管芽的融合鏈接[34]。最后,巨噬細胞對周細胞的調(diào)控可以增強新血管的穩(wěn)定性。

代謝重編程是巨噬細胞表型形成的關(guān)鍵,但尚不明確代謝如何調(diào)節(jié)促血管生成型巨噬細胞。新的證據(jù)指出,糖酵解是促血管生成型巨噬細胞活化的關(guān)鍵[35],在病理性血管新生病灶附近的巨噬細胞糖酵解活性升高,產(chǎn)生大量乙酰輔酶A,導致組蛋白乙?；驼T導促血管形成基因表達,從而將巨噬細胞重編程為血管生成表型;與此一致的是,糖酵解代謝途徑可導致巨噬細胞分泌乳酸增加,乳酸是血管發(fā)芽公認的主要驅(qū)動代謝物[30]。然而,Willenborg等[14]提出糖酵解特征不足以支持有效的促血管生成反應(yīng),促血管生成型巨噬細胞需要利用線粒體呼吸;敲除電子傳遞鏈DARS酶后,線粒體呼吸功能異常導致線粒體介導的HIF1α穩(wěn)定性降低,最終抑制了巨噬細胞促炎和促血管新生的表型。

此外,脂質(zhì)代謝也是巨噬細胞促血管生成表型調(diào)節(jié)的關(guān)鍵途徑。臨床上,多項研究提示了脂質(zhì)及其代謝物是新生血管性眼病的有效調(diào)節(jié)劑,包括ω-3 和 ω-6等長鏈不飽和脂肪酸,改變巨噬細胞脂質(zhì)合成和輸入的平衡,顯著調(diào)節(jié)其功能[36]。CD36介導的脂質(zhì)攝取增加可導致炎癥反應(yīng)增加[37],脂肪酸的過度攝入與積累可誘導巨噬細胞的IL-1α釋放以驅(qū)動血管炎癥[38],而增加脂肪酸氧化、減少脂質(zhì)積累,可以抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生[39]。巨噬細胞的功能也與脂質(zhì)池的組成有關(guān),不同的TLR信號和細胞因子可誘導巨噬細胞獲得特異的脂質(zhì)組[40]。目前對促血管生成型巨噬細胞的脂質(zhì)池組成尚不明確,如何改變巨噬細胞的脂質(zhì)組成與攝取平衡以抑制血管新生尚需進一步探索。

3 NVAMD中促巨噬細胞代謝重編程的調(diào)節(jié)因素

在CNV的發(fā)生發(fā)展過程中,組織微環(huán)境的不同細胞進行動態(tài)交流,氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的可用性在血管形成過程中不斷變化,巨噬細胞的代謝始終處于動態(tài)的變化過程中,受到微環(huán)境及全身因素的復(fù)雜調(diào)控,包括組織缺氧、細胞互作、衰老、肥胖等重要因素的影響。微環(huán)境中的各種刺激可以改變巨噬細胞的代謝,從而調(diào)節(jié)塑造促血管生成型巨噬細胞的功能表型。

3.1 組織缺氧

組織缺氧是巨噬細胞的強激活劑[41],在NVAMD患者的病灶中,一方面,在病灶處,由于脈絡(luò)膜毛細血管缺失、眼部血流量減少和玻璃膜疣沉積,脈絡(luò)膜向視網(wǎng)膜側(cè)的氧氣供給可能受到抑制,造成局部缺氧[42];另一方面,在血管形成中,浸潤的免疫細胞和非免疫細胞局部增加可上調(diào)局部耗氧量。除了增加糖酵解代謝外,缺氧還會抑制巨噬細胞的線粒體呼吸和氧化磷酸化活性,巨噬細胞中存在缺氧敏感的受體如COMM結(jié)構(gòu)域(COMMD)1,介導整合下游炎癥信號轉(zhuǎn)導與代謝途徑[43]。事實上,缺氧巨噬細胞的條件培養(yǎng)基比暴露于常氧的巨噬細胞的條件培養(yǎng)基具有更高的血管生成能力[30],組織缺氧可能是調(diào)節(jié)巨噬細胞代謝、促進CNV發(fā)展的關(guān)鍵因素。

3.2 細胞相互作用

巨噬細胞還面臨著與組織微環(huán)境中其他細胞的營養(yǎng)競爭及相互代謝調(diào)節(jié)。在CNV中,內(nèi)皮細胞與巨噬細胞毗鄰,內(nèi)皮細胞所分泌的代謝物可顯著調(diào)節(jié)巨噬-內(nèi)皮的細胞間交流。既往報道,在肌肉再生期間,糖酵解活性增強的內(nèi)皮細胞可釋放乳酸促進鄰近巨噬細胞的M2表型[30],而在病理性血管生成的微環(huán)境中,進一步地證實了內(nèi)皮細胞可通過乳酸促進巨噬細胞糖酵解,誘導巨噬細胞促炎促血管新生相關(guān)基因的表達[35]。此外,在小鼠激光誘導的CNV模型中發(fā)現(xiàn),急性激光損傷導致的壞死視網(wǎng)膜色素上皮細胞也可能是上調(diào)巨噬細胞糖酵解的促進因素[44]。在AMD的發(fā)展中,病變的內(nèi)皮細胞及視網(wǎng)膜色素上皮細胞可能是維持巨噬細胞促血管新生表型的關(guān)鍵。

3.3 全身因素

免疫細胞受到全身因素的調(diào)節(jié),其中,衰老是NVAMD最顯著的危險因素。隨著年齡的增長,巨噬細胞的功能與代謝調(diào)節(jié)也發(fā)生變化,相對于年輕的巨噬細胞,老年巨噬細胞葡萄糖通量和線粒體呼吸減弱,同時,衰老的巨噬細胞失去使用替代燃料來源的能力,加劇了這一能量缺乏的狀態(tài)[45]。衰老也同時改變細胞的營養(yǎng)感知,引起多條代謝途徑的改變,尤其是線粒體功能和相關(guān)的氧化應(yīng)激,巨噬細胞平衡這些狀態(tài)的能力下降,可導致衰老過程中的促炎激活[46]。

作為構(gòu)成先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,NVAMD患者的巨噬細胞受到既往免疫事件的刺激影響,從而調(diào)節(jié)其重編程。Hata等[47]指出,既往的肥胖病史所導致的異常血液代謝物硬脂酸,可以重塑巨噬細胞染色質(zhì)景觀,誘導巨噬細胞的表觀遺傳重編程,促進CNV形成。因此,全身因素,如衰老、肥胖,可能對誘導巨噬細胞開啟促炎及促血管生成表型起到重要作用。

4 巨噬細胞代謝重編程在NVAMD中的作用機制

巨噬細胞代謝重編程的過程,伴隨著糖酵解、TCA循環(huán)、氧化磷酸化、脂肪酸和氨基酸代謝等多條途徑的協(xié)同改變,但對調(diào)控巨噬細胞促NVAMD發(fā)展的關(guān)鍵代謝途徑及其作用機制尚處于探索之中。

新近研究發(fā)現(xiàn),糖酵解是巨噬細胞調(diào)節(jié)NVAMD的重要代謝途徑,其一,對人類NVAMD患者的血液和小鼠CNV形成過程中的骨髓、血清及脈絡(luò)膜進行檢測,均發(fā)現(xiàn)乳酸水平的升高[48]。乳酸是糖酵解的終產(chǎn)物,乳酸水平的上調(diào)提示NVAMD中巨噬細胞存在糖酵解活性上調(diào)。其二,通過特異性敲除髓系細胞的糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3,發(fā)現(xiàn)CNV的形成顯著被抑制[44],這可能與巨噬細胞糖酵解激活后增強的下游HIF和核因子-κB信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)[44]。其三,巨噬細胞糖酵解增強導致的乙酰輔酶A累積,也可以介導組蛋白乙?；捌湔{(diào)控的促炎促血管新生的基因表達增加[35]。

此外,脂質(zhì)代謝調(diào)控也是巨噬細胞調(diào)節(jié)CNV的重要途徑。研究表明,NVAMD患者巨噬細胞的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白1(ABCA1)表達減少,從而導致膽固醇流出的抑制,其胞內(nèi)游離膽固醇水平升高可顯著改變表型,促進M2標志物如IL-10、CD163的表達,上調(diào)其促內(nèi)皮細胞增殖的能力[49]。同時,脂肪酸調(diào)節(jié)對CNV形成也有顯著影響,而抑制多不飽和脂肪酸代謝途徑的細胞色素 P450 氧化酶,可顯著抑制CNV的形成[50]。

盡管目前的研究證實了糖脂代謝在巨噬細胞調(diào)節(jié)NVAMD中的重要作用,但對其整體的代謝改變影響尚不明確。一方面,對NVAMD中巨噬細胞線粒體、氨基酸等重要代謝途徑的調(diào)節(jié)作用知之甚少;另一方面,胞內(nèi)代謝途徑之間可受到中間代謝產(chǎn)物的改變相互影響,因此,尚不明確代謝途徑之間如何平衡調(diào)節(jié)。另外,巨噬細胞受到復(fù)雜的組織微環(huán)境及全身因素的調(diào)節(jié),其代謝物的可用性、關(guān)鍵代謝酶的調(diào)節(jié)也隨之發(fā)生改變,這使得代謝途徑的改變更為復(fù)雜,還需綜合考慮多因素調(diào)節(jié),以明確巨噬細胞形成功能表型過程中的關(guān)鍵代謝酶及關(guān)鍵代謝物。

5 結(jié)束語

對于理解巨噬細胞促血管生成表型形成及效應(yīng)功能,代謝重編程提供了新的視角,引起了領(lǐng)域內(nèi)的廣泛關(guān)注,但年齡相關(guān)性黃斑變性中巨噬細胞免疫代謝相關(guān)的許多問題尚未得到解答。一方面,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)揭示了小鼠和人類眼部巨噬細胞群的復(fù)雜性[51-52],需要新的方法來評估巨噬細胞不同亞群、不同階段的代謝通量,然而,許多代謝物的壽命非常短暫,這使得分離保留病變巨噬細胞具有挑戰(zhàn)性,空間分辨代謝組學[53]和單細胞代謝組學[54]技術(shù)的興起可能會有所助益。另一方面,代謝途徑相互作用復(fù)雜,不同的代謝途徑由于共享燃料的輸入與合成而相互影響,精確的代謝流標記可能有助于闡釋代謝途徑間的補償機制,進而明確代謝途徑的特異作用,有助于治療靶點的篩選。在腫瘤、心血管疾病中,代謝途徑已成為新近免疫治療藥物研究的熱門靶點[55],因此,闡明巨噬細胞在NVAMD中的代謝重編程機制,有利于進一步開發(fā)新靶點,滿足當前臨床的治療需求。