陳詩宇 茶光輝 李吉琴 梅會友 展麗梅 鮑國櫻 徐 樂 曹振輝

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201)

我國是畜牧業(yè)大國,肉蛋產(chǎn)量已連續(xù)多年位居世界第一。但我國飼料配方以玉米-豆粕型為主,隨著畜牧業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展,人畜爭糧矛盾日益突出[1]。為緩解飼料原料缺口,保障我國糧食安全,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年3月推出《飼料中玉米豆粕減量替代工作方案》,以期廣辟飼料原料來源,減少玉米、大豆的供應(yīng)壓力。同時我國非常規(guī)飼料資源豐富,但因其具有適口性差、營養(yǎng)價值低和含有抗?fàn)I養(yǎng)因子等特點,非常規(guī)飼料資源利用率較低。因此,加大對非常規(guī)飼料資源的開發(fā)及利用,是保證養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。大豆皮是大豆加工的副產(chǎn)物,屬于非常規(guī)飼料資源,其富含膳食纖維,可替代部分能量飼料,但含有胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白和β-伴大豆球白等抗?fàn)I養(yǎng)因子,易引起動物過敏和腹瀉[2-3]。菜籽餅必需氨基酸較為平衡,是目前常用的飼料資源[4],但其含有硫代葡萄糖苷、植酸和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子[5],易降低飼料適口性,損害畜禽肝臟和腎臟功能[6]。上述因素限制了大豆皮和菜籽餅在畜禽飼糧中的應(yīng)用。

近年來,利用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)提高非常規(guī)飼料資源利用價值的研究逐漸引起人們的關(guān)注。微生物固態(tài)發(fā)酵是指在沒有自由水或自由水含量很低的條件下在固體原料中接入微生物菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的過程,其能通過有益微生物產(chǎn)生的一系列酶降解飼料原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子和生物大分子物質(zhì),提高飼料原料營養(yǎng)價值[7]。此外,有益微生物定殖于腸道后能顯著提高動物免疫功能,抑制病原微生物增殖,從而維護(hù)動物健康[8-9]。利用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)發(fā)酵飼料具有能耗低、成本低和污染物排放低等優(yōu)點。但微生物固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)效率受溫度、料液比、時間等多因素制約,每個因素對于最優(yōu)工藝的開發(fā)和經(jīng)濟(jì)可行性都至關(guān)重要[10]。因此,為提高大豆皮和菜籽餅的營養(yǎng)價值,本試驗擬先利用黑曲霉(Aspergillusniger)對大豆皮和菜籽餅進(jìn)行有氧發(fā)酵,在此基礎(chǔ)上再利用發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)進(jìn)行二段厭氧發(fā)酵,通過單因素試驗與正交試驗探究最優(yōu)二段固態(tài)發(fā)酵工藝,并對比發(fā)酵前后營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化,其最優(yōu)發(fā)酵工藝可為非常規(guī)飼料原料的開發(fā)提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與菌種

大豆皮和菜籽餅:均從市場購得,65 ℃烘干制成風(fēng)干樣并粉碎過40目篩。

無菌水:蒸餾水分裝,121 ℃滅菌20 min。

黑曲霉、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌:均為本實驗室分離所得。

1.2 主要試劑與儀器

沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,葡萄糖40 g,加入蒸餾水1 000 mL,121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母膏粉4 g,無水乙酸納5 g,吐溫80 1 mL,硫酸鎂0.2 g,牛肉膏粉5 g,葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g,硫酸錳0.05 g,加入蒸餾水1 000 mL,121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司;瓊脂購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司;結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)培養(yǎng)基購自Solarbio公司;志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司;大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、硫代葡萄糖苷檢測酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

主要儀器:凱氏定氮儀(UDK-159)、分光光度計(UV-5100)、高速低溫離心機(jī)(ThermoFisher ST-16R)、渦旋混合器(SCILOGEX MX-S)等。

1.3 試驗設(shè)計和方法

1.3.1 種子液的制備

取100 μL凍存的黑曲霉孢子液接種到50 mL SDA液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、100 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)好的菌絲接種到SDA斜面培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h,使用無菌生理鹽水沖刷孢子,并收集菌液,制得黑曲霉孢子液。

取100 μL凍存的植物乳桿菌菌液接種到10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃復(fù)蘇8 h后,移取100 μL復(fù)蘇后菌液于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃活化16 h,再移取100 μL活化后菌液于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)8 h后,5 000 r/min離心10 min,倒掉上層培養(yǎng)基,加入無菌生理鹽水后混勻,制得植物乳桿菌菌液。發(fā)酵乳桿菌菌液制備方法同上。用無菌水調(diào)整以上菌液濃度,備用。

1.3.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗

以大豆皮和菜籽餅原料比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3)、料液比(1.0∶1.2、1.0∶1.6、1.0∶2.0、1.0∶2.4和1.0∶2.8 g/mL)、接種量(5×104、5×105、5×106、5×107和5×108CFU/g)、發(fā)酵時間(24、36、48、60和72 h)和發(fā)酵溫度(33、35、37、39和41 ℃)5個因素為研究對象,進(jìn)行單因素試驗,以發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量為指標(biāo),研究單個因素對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅還原糖含量的影響。

1.3.2.2 正交試驗

為確定黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅的最佳工藝,在確定最佳發(fā)酵溫度為35 ℃的條件下,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以還原糖含量為指標(biāo)設(shè)計四因素三水平(L934)正交試驗。每個水平設(shè)計3個重復(fù)。正交試驗設(shè)計見表1。

1.3.3 乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

在黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅的最佳工藝基礎(chǔ)上,以尿素添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、接種量(5×104、5×105、5×106、5×107和5×108CFU/g)、發(fā)酵溫度(33、35、37、39和41 ℃)、發(fā)酵時間(24、36、48、60和72 h)4個因素為研究對象,分別對植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌進(jìn)行單因素試驗,以發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸桿菌活菌數(shù)為指標(biāo),研究單個因素對乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅乳酸桿菌活菌數(shù)的影響。

1.3.3.2 正交試驗

在黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅的最佳工藝基礎(chǔ)上,將植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等比例混合,并在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以乳酸桿菌活菌數(shù)為指標(biāo)設(shè)計四因素三水平(L934)正交試驗。每個水平設(shè)計3個重復(fù)。正交試驗設(shè)計見表2。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 還原糖含量、乳酸桿菌活菌數(shù)及常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)含量的測定

還原糖含量的測定參照劉建玲[11]的方法;乳酸桿菌活菌數(shù)的測定參照史燕[12]的方法;水分含量測定參照《飼料中的水分測定》(GB/T 6435—2014);粗蛋白質(zhì)含量測定參照《飼料中粗蛋白的測定-凱氏定氮法》(GB/T 6432—2018);粗脂肪含量測定參照《飼料中粗脂肪的測定》(GB/T 6433—2006);粗纖維含量測定參照《飼料中粗纖維的測定》(GB/T 6434—2006);粗灰分含量測定參照《飼料中粗灰分的測定》(GB/T 6438—2007);鈣含量測定參照《飼料中鈣的測定》(GB/T 6436—2018);總磷含量測定參照《飼料中總磷的測定-分光光度法》(GB/T 6437—2018)。

1.4.2 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測定

大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子和硫代葡萄糖苷含量測定參照ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書;植酸含量的測定參照溫舒元等[13]的方法;單寧含量的測定參照于新穎等[14]的方法。

1.4.3 發(fā)酵飼料感官與質(zhì)量評測

根據(jù)德國農(nóng)業(yè)協(xié)會評分法[15]對經(jīng)黑曲霉、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌混合發(fā)酵后的飼料進(jìn)行感官評定,發(fā)酵飼料感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示,得分≥16分為1級,10～15分為2級,5～9分為3級,0～4分為4級。

表3 發(fā)酵飼料感官評分標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量評測:稱取10 g發(fā)酵樣品,加入裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中振蕩混勻,吸取1 mL該液體加入到9 mL的無菌生理鹽水中逐步進(jìn)行10倍梯度稀釋,吸取100 μL稀釋液分別加入到大腸桿菌(VRBGA)、沙門氏菌(XLD)、志賀氏菌(志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素)、霉菌(PDA)和乳酸桿菌(MRS)的選擇性分離培養(yǎng)基中涂布均勻,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,比較多個組之間的數(shù)據(jù)差異性采用Duncan氏法,比較2組之間的數(shù)據(jù)差異性采用Student獨立樣本t檢驗,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅單因素試驗結(jié)果

2.1.1 大豆皮和菜籽餅原料比例對還原糖含量的影響

由圖1-A可知,在料液比為1.0∶1.6 g/mL、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著菜籽餅原料比例的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量呈先升高后下降的趨勢,大豆皮和菜籽餅原料比例為1∶1時還原糖含量達(dá)到最高,顯著高于大豆皮和菜籽餅原料比例為3∶1、2∶1、1∶2和1∶3時(P<0.05)。

2.1.2 料液比對還原糖含量的影響

由圖1-B可知,在大豆皮和菜籽餅原料比例為1∶1、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著料液比的降低,發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量呈先升高后下降的趨勢,料液比為1.0∶2.4 g/mL時還原糖含量達(dá)到最高,顯著高于料液比為1.0∶1.2、1.0∶1.6和1.0∶2.0 g/mL時(P<0.05)。

2.1.3 接種量對還原糖含量的影響

由圖1-C可知,在大豆皮和菜籽餅原料比例為1∶1、料液比為1.0∶1.6 g/mL、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著接種量的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量呈先升高后下降的趨勢,接種量為5×107CFU/g時還原糖含量達(dá)到最高,顯著高于接種量為5×104、5×105、5×106和5×108CFU/g時(P<0.05)。

2.1.4 發(fā)酵時間對還原糖含量的影響

由圖1-D可知,在原料比例為1∶1、料液比為1.0∶1.6 g/mL、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵溫度為37 ℃的條件下,隨著發(fā)酵時間的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量呈先升高下降的趨勢,發(fā)酵時間為48 h時還原糖含量達(dá)到最高,顯著高于發(fā)酵時間為24、36、60和72 h時(P<0.05)。

2.1.5 發(fā)酵溫度對還原糖含量的影響

由圖1-E可知,在原料比例為1∶1、料液比為1.0∶1.6 g/mL、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量呈逐漸下降的趨勢,發(fā)酵溫度為35 ℃時還原糖含量達(dá)到最高,顯著高于發(fā)酵溫度為37、39和41 ℃時(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05),ns表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅正交試驗結(jié)果

由表4中正交結(jié)果R值可知,對發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量的影響程度為B>D>A>C,即料液比>發(fā)酵時間>原料比例>接種量;由K值可得最優(yōu)組合為A1B3C2D3,即原料比例為2∶1,料液比為1.0∶2.8 g/mL,接種量為5×107CFU/g,發(fā)酵時間為60 h。

表4 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅正交試驗結(jié)果

2.3 植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅單因素試驗結(jié)果

2.3.1 尿素添加量對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖2-A可知,在接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著尿素添加量的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中植物乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢,尿素添加量為1.0%時植物乳桿菌活菌數(shù)最高,顯著高于尿素添加量為0、0.5%、1.5%和2.0%時(P<0.05)。

2.3.2 接種量對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖2-B可知,在尿素添加量為1.0%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著接種量的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中植物乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后不變的趨勢,接種量為5×104CFU/g時植物乳桿菌活菌數(shù)顯著低于接種量為5×105、5×106、5×107和5×108CFU/g時(P<0.05),接種量為5×106CFU/g時植物乳桿菌活菌數(shù)最高。

2.3.3 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖2-C可知,在尿素添加量為1.0%、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵產(chǎn)物中植物乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢,發(fā)酵溫度為33、35和37 ℃時植物乳桿菌活菌數(shù)顯著高于發(fā)酵溫度為39和41 ℃時(P<0.05),發(fā)酵溫度為37 ℃時植物乳桿菌活菌數(shù)最高。

2.3.4 發(fā)酵時間對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖2-D可知,在尿素添加量為1.0%、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵溫度為37 ℃的條件下,隨著發(fā)酵時間的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中植物乳桿菌活菌呈先升高后下降的趨勢,發(fā)酵時間為48和60 h時植物乳桿菌活菌數(shù)顯著高于發(fā)酵時間為24、36和72 h時(P<0.05),發(fā)酵時間為60 h時植物乳桿菌活菌數(shù)最高。

圖2 單因素條件對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

2.4 發(fā)酵乳桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅單因素試驗結(jié)果

2.4.1 尿素添加量對發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖3-A可知,在接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著尿素添加量的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢,尿素添加量為1.5%時發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)最高,顯著高于尿素添加量為0、0.5%、1.0%和2.0%時(P<0.05)。

2.4.2 接種量對發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖3-B可知,在尿素添加量為1.0%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著接種量的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后不變的趨勢,接種量為5×104和5×105CFU/g時發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)顯著低于接種量為5×106、5×107和5×108CFU/g時(P<0.05),接種量為5×106CFU/g時發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)最高。

2.4.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖3-C可知,在尿素添加量為1.0%、接種量為5×106CFU/g、發(fā)酵時間為48 h的條件下,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢,發(fā)酵溫度為35 ℃時發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)最高,顯著高于發(fā)酵溫度為33、37、39和41 ℃時(P<0.05)。

2.4.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖3-D可知,在尿素添加量為1.0%,接種量為5×106CFU/g,發(fā)酵溫度為37 ℃的條件下,隨著發(fā)酵時間的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢,發(fā)酵時間為36 h發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)最高,顯著高于發(fā)酵時間為24、48、60和72 h時(P<0.05)。

圖3 單因素條件對發(fā)酵乳桿菌活菌數(shù)的影響

2.5 乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅正交試驗結(jié)果

由表5正交試驗結(jié)果R值可知,對發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸桿菌活菌數(shù)的影響程度為D>C>B>A,即發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量>尿素添加量;由K值可得最優(yōu)組合為A2B2C2D3,即尿素添加量為1.0%,乳酸桿菌接種量為5×106CFU/g,發(fā)酵溫度為35 ℃,發(fā)酵時間為60 h。

表5 乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅正交試驗結(jié)果

續(xù)表5試驗號Test No.因素 Factors尿素添加量Amount of urea/% (A)接種量Inoculation quantity/(CFU/g)(B)發(fā)酵溫度Fermentation temperature/℃ (C)發(fā)酵時間Fermentation time/h (D)乳酸桿菌活菌數(shù)Lactobacillusviable count/[lg(CFU/g)]81.5 (3)5×106 (2)33 (1)60 (3)9.1891.5 (3)5×107 (3)35 (2)36 (1)8.81K18.758.728.738.66K28.868.958.968.69K38.858.788.769.10R0.110.220.230.44主次因素 Primary and secondary factorsD>C>B>A最優(yōu)組合 Optimal combinationA2B2C2D3

2.6 最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵工藝對大豆皮和菜籽餅營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

由表6可知,發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、鈣和磷含量較發(fā)酵前均顯著提高(P<0.05),粗纖維含量較發(fā)酵前顯著降低(P<0.05);其中,粗蛋白質(zhì)含量提高了69.86%,粗脂肪含量提高了40.83%,粗灰分含量提高了14.73%,鈣含量提高了11.43%,磷含量提高了4.44%,粗纖維含量降低了41.41%。

表6 大豆皮和菜籽餅發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)含量變化(風(fēng)干基礎(chǔ))

2.7 最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵工藝對大豆皮和菜籽餅抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響

由表7可知,發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、硫代葡萄糖苷和單寧含量較發(fā)酵前均顯著降低(P<0.05);其中,大豆球蛋白含量降低了12.17%,β-伴大豆球蛋白含量降低了15.95%,硫代葡萄糖苷含量降低了14.89%,單寧含量降低了28.64%。發(fā)酵前后發(fā)酵產(chǎn)物中胰蛋白酶抑制因子和植酸含量差異不顯著(P<0.05)。

2.8 發(fā)酵飼料感官與質(zhì)量評測

由表8可知,大豆皮和菜籽餅經(jīng)過黑曲霉和乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵后,有明顯的酸香味,且無腐爛或污染,顏色也與原料相似,從氣味、質(zhì)地和色澤進(jìn)行綜合評分,得分為16分,達(dá)到優(yōu)良等級。

由表9可知,大豆皮和菜籽餅經(jīng)過黑曲霉和乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵后,乳酸桿菌總數(shù)達(dá)1.53×109CFU/g,pH降至4.62,大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霉菌等致病菌均未檢出,表明飼料未發(fā)生霉變或污染。

3 討 論

3.1 固態(tài)發(fā)酵菌種的選擇

黑曲霉、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌是公認(rèn)安全的微生物,于2013年被列入我國《飼料添加劑品種目錄》中。黑曲霉是好氧型微生物,其產(chǎn)酶豐富、活性高,發(fā)酵過程中分泌的葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等胞外水解酶多達(dá)15種,能夠有效破壞植物纖維素所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),釋放嵌于其中的蛋白質(zhì)、脂肪和多糖,并降解生物大分子,改善飼料營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[16-17]。乳酸桿菌是動物腸道中土著菌種,是最常見的兼性厭氧益生菌種類,其分解代謝碳水化合物的主要終產(chǎn)物為乳酸,并能夠分泌具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌素抑制有害菌的生長[18-19]。植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌均屬于乳酸桿菌,研究表明植物乳桿菌能降低飼料中β-伴大豆球蛋白、硫代葡萄糖苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子,從而提高飼料飼用價值,其還能夠維持腸道菌群穩(wěn)態(tài),抑制有害菌生長,提高畜禽生長性能與繁殖性能[20-22]。發(fā)酵乳桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌肽,可作為食品防腐劑或抗生素的替代品,研究表明其能增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)并預(yù)防胃腸道和上呼吸道感染[23]。此外,植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌之間可能存在協(xié)同共生效應(yīng),李玉彤[24]研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌等比例混菌發(fā)酵胡柚汁中所含的活菌數(shù)、總酚含量和總黃酮含量高于單菌發(fā)酵。據(jù)統(tǒng)計,大豆皮粗纖維含量高達(dá)38.04%,菜籽餅中含有硫代葡萄糖苷、植酸和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子[3-4]。為達(dá)到降解大豆皮和菜籽餅中粗纖維與抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高其飼用價值的目的,本研究采用黑曲霉、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌對大豆皮和菜籽餅進(jìn)行二段固態(tài)發(fā)酵。

表7 大豆皮和菜籽餅發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化(風(fēng)干基礎(chǔ))

表8 發(fā)酵飼料感官評定表

表9 發(fā)酵飼料pH和微生物衛(wèi)生指標(biāo)

3.2 大豆皮和菜籽餅二段固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

本研究采用二段固態(tài)發(fā)酵工藝,其中第一段使用黑曲霉進(jìn)行有氧固態(tài)發(fā)酵,第二段使用植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌進(jìn)行混菌厭氧固態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵是一種三相非均相過程,包括固相、液相和氣相,是傳遞質(zhì)量與熱量的體系,微生物生長和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與溫度和傳熱過程相關(guān),因此固態(tài)發(fā)酵的效率高度依賴于溫度[25]。黑曲霉在6～47 ℃均能生長,但處于不同溫度時其生長速度與代謝產(chǎn)物也有所差異[26],本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為35 ℃時發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量最高,表明此溫度下黑曲霉代謝旺盛,纖維素酶產(chǎn)量高,與Tsao等[27]和劉傳都[28]的最適溫度條件一致。

黑曲霉有氧固態(tài)發(fā)酵階段正交試驗結(jié)果R值顯示,料液比對發(fā)酵結(jié)果影響最大,發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果影響較大,大豆皮和菜籽餅原料比例和接種量對發(fā)酵結(jié)果影響較小。固態(tài)發(fā)酵體系中水分含量直接影響微生物的生長,水分含量過低會導(dǎo)致底物營養(yǎng)物質(zhì)溶解度降低,微生物生長與產(chǎn)酶能力受到限制;水分含量過高會導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)顆粒易團(tuán)聚,體系氣體傳輸與散熱性能受到影響[25]。本研究確定的適宜料液比為1.0∶2.8 g/mL。分析原因可能是大豆皮質(zhì)地蓬松、孔間隙大,因此對水分含量需求較高。Jamal等[29]通過響應(yīng)面法對白腐真菌固態(tài)發(fā)酵木薯皮進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)水分含量對發(fā)酵效果影響最大。Yang等[30]使用米曲霉、里氏木霉、金孢霉對大豆子葉纖維和酒糟進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)料液比為1.0∶3.0 g/mL時發(fā)酵效果最好。本研究適宜料液比結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。發(fā)酵時間是影響發(fā)酵基質(zhì)營養(yǎng)成分改善的重要因素,發(fā)酵時間過短體系內(nèi)酶活性較低,對生物大分子物質(zhì)降解不充分;發(fā)酵時間過長微生物會過度消耗基質(zhì)養(yǎng)分,副產(chǎn)物累積過多并導(dǎo)致菌體自溶[25]。本研究中適宜發(fā)酵時間為60 h,與Heidary等[31]研究結(jié)果相近,即較短的發(fā)酵時間有利于提高時間效率并降低成本。

混菌厭氧固態(tài)發(fā)酵階段正交試驗結(jié)果R值顯示,發(fā)酵時間對發(fā)酵效果影響最大,發(fā)酵溫度與接種量對發(fā)酵效果的影響相當(dāng),而尿素添加量對發(fā)酵效果影響最小。混菌厭氧固態(tài)發(fā)酵階段適宜發(fā)酵時間為60 h。吳偉偉[32]使用乳酸桿菌發(fā)酵棉籽餅粕制備生物活性飼料,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間為60 h時發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸桿菌活菌數(shù)最高。Sakai等[33]使用乳酸桿菌對廚余垃圾進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間為60 h時發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸含量達(dá)到最高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。本研究中適宜發(fā)酵溫度為35 ℃,與張倩茹等[34]研究結(jié)果相近。

3.3 最優(yōu)工藝發(fā)酵前后大豆皮和菜籽餅營養(yǎng)物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化

大豆皮和菜籽餅經(jīng)二段固態(tài)發(fā)酵后,大豆皮和菜籽餅營養(yǎng)物質(zhì)含量得到較大提高,部分抗?fàn)I養(yǎng)因子被有效降解,發(fā)酵產(chǎn)物酸香味明顯,綜合評分16分,達(dá)到優(yōu)良等級。發(fā)酵后,粗蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前提升了69.86%,粗脂肪含量提升了40.83%,粗纖維含量降低了41.41%,乳酸桿菌總數(shù)達(dá)1.53×109CFU/g。歐榮娣等[35]使用二段固態(tài)發(fā)酵工藝處理紅薯渣,有氧發(fā)酵階段接種黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母,厭氧發(fā)酵階段接種產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌,發(fā)酵后粗蛋白含量較發(fā)酵前提升了85.99%,粗纖維含量下降了3.8%。Su等[36]使用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌對玉米、豆粕混合飼料進(jìn)行二段固態(tài)發(fā)酵,粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量較發(fā)酵前分別提升了14.20%、42.11%,粗纖維含量下降了39.55%,乳酸桿菌總數(shù)達(dá)9.21×108CFU/g。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。黑曲霉、乳酸桿菌均能夠?qū)⒌孜镏蟹堑鞍椎D(zhuǎn)化為菌體蛋白[37]。同時黑曲霉分泌的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶能夠?qū)⒗w維素降解為小分子糖類物質(zhì),二段固態(tài)發(fā)酵中乳酸桿菌能利用其迅速生長,活菌數(shù)和菌體蛋白含量也相應(yīng)增加[16]。因此,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量升高,而粗纖維含量下降。最優(yōu)工藝發(fā)酵后pH降至4.62,黑曲霉和乳酸桿菌發(fā)酵過程中均能分泌大量有機(jī)酸,黑曲霉主要分泌草酸和檸檬酸[38],乳酸桿菌主要分泌乳酸[22],上述產(chǎn)物均能被乙醚浸提,粗脂肪含量提高可能與此有關(guān)。此外,固態(tài)發(fā)酵過程中微生物利用底物進(jìn)行新陳代謝,體系干物質(zhì)出現(xiàn)損失,也會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量相對提升[39]。

大豆皮和菜籽餅經(jīng)二段固態(tài)發(fā)酵后,大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、單寧、硫代葡萄糖苷含量較發(fā)酵前分別下降12.17%、15.95%、28.64%、14.89%。抗?fàn)I養(yǎng)因子變化趨勢與李英英等[40]、Shi等[41]研究結(jié)果一致。黑曲霉產(chǎn)酶能力強(qiáng),具有分泌單寧酶與天冬氨酸蛋白酶的能力[16,42]。天冬氨酸蛋白酶在酸性或中性條件下具有活性,現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于大豆蛋白的降解[43]。黑曲霉和乳酸桿菌均具有降解硫代葡萄糖苷的作用[27,44]。研究表明,曲霉屬具有分泌黑芥子酶的能力[45]。Mullaney等[21]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能夠?qū)⒘虼咸烟擒辙D(zhuǎn)化為芥酸腈、蘿卜硫腈和其他未鑒定代謝物。蛋白酶與纖維素酶也被發(fā)現(xiàn)能夠降低菜籽餅中硫代葡萄糖苷含量,黑曲霉可能通過分泌上述酶將硫代葡萄糖苷降解[46]。

4 結(jié) 論

① 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)工藝為:大豆皮和菜籽餅原料比例2.0∶1.0,料液比1.0∶2.8 g/mL,黑曲霉接種量5×107CFU/g,發(fā)酵溫度35 ℃,發(fā)酵時間60 h。

② 植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等比例混菌固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)工藝為:尿素添加量1.0%,乳酸菌接種量5×106CFU/g,發(fā)酵溫度35 ℃,發(fā)酵時間60 h。

③ 大豆皮和菜籽餅經(jīng)最優(yōu)二段固態(tài)發(fā)酵后,大豆皮和菜籽餅中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量提高,粗纖維、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、單寧、硫代葡萄糖苷含量降低,且富含乳酸桿菌,飼用價值得到有效改善。