王毓甜 米金秋 全浩瑋 王慶鳳 李澤昆 李天天 馬秋剛 黃世猛*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室,北京 100193;2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院,北京 100037)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)因可引起豬產(chǎn)生嘔吐現(xiàn)象,又稱為嘔吐毒素,主要由禾谷鐮刀菌、梨孢鐮刀菌等多種鐮孢菌屬真菌產(chǎn)生,屬于單端孢霉菌素類毒素,是畜禽飼料生產(chǎn)中最常見的真菌毒素之一,也是當(dāng)前全球范圍內(nèi)飼料中污染最為嚴(yán)重的霉菌毒素之一[1]。畜禽采食DON污染的飼糧或飼料原料后,會出現(xiàn)采食量減少、生長性能降低、嘔吐、腹瀉等癥狀,甚至死亡,給我國畜禽養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),從吉林、湖南、安徽等區(qū)域采集了1 304份飼料原料進(jìn)行檢測,DON檢出率為93.56%,超標(biāo)率為51.76%,其中玉米、玉米副產(chǎn)品和小麥及麩皮的檢出率分別高達(dá)96.49%、96.59%和100%[5]。侯楠楠等[6]收集我國山東、江蘇、東北等地區(qū)的飼糧和飼料原料,對DON污染情況進(jìn)行監(jiān)測,結(jié)果顯示DON的污染率達(dá)97.22%,超標(biāo)率為27.42%。最新調(diào)研結(jié)果表明,2021年調(diào)查的我國1 025份飼糧和飼料原料樣品中DON檢出率均達(dá)到88%以上[7]。由此可見,我國飼糧和飼料原料的DON檢出率和超標(biāo)率維持在較高水平。攝入DON污染的飼糧和飼料原料,容易引起畜禽不同程度的中毒情況,其中DON的毒性作用主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性、多器官組織病理毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、消化道毒性、肝臟毒性和致畸致癌等[8-11]。肝臟作為DON主要作用的靶器官之一,可以導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性及肝細(xì)胞癌,DON可增加肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性,破壞機體氧化/抗氧化酶系統(tǒng),導(dǎo)致氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)肝臟組織發(fā)生病理損傷[12]。DON對肝臟的影響鮮有系統(tǒng)研究[12],肝臟作為機體主要的合成代謝和分解代謝器官,參與能量代謝、異種生物解毒、營養(yǎng)物質(zhì)代謝和吸收、蛋白質(zhì)合成和膽汁的產(chǎn)生[13]。研究表明,肝臟是DON主要靶器官之一,DON可改變肝臟組織形態(tài),誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),增加細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[14-16]。已有研究證實,添加具有抗炎、抗氧化的功能活性物質(zhì),可以改善機體的氧化還原狀態(tài),進(jìn)而緩解炎癥和氧化損傷。

褐藻寡糖(alginate oligosaccharides,AOS)也稱褐藻膠低聚糖,包括低聚甘露糖醛酸和低聚古羅糖醛酸,是由褐藻膠經(jīng)過降解得到聚合度為2～25的功能性寡糖[17]。AOS具有非免疫、無毒性、生物可降解的低聚合度特性[17-19],其分子質(zhì)量小、溶解度高,容易被機體吸收和利用,已有大量研究證實了AOS具有多種活性功能,例如抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗菌、抗腫瘤和調(diào)節(jié)腸道菌群等[20-23]。雖然AOS的各種生物學(xué)功能得到廣泛關(guān)注,但對于AOS是否具有改善DON誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的研究鮮有報道。因此,本試驗旨在研究AOS對DON誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的緩解效果,旨在為AOS在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

無特異性病原體(SPF)級7周齡雌性C57BL/6J小鼠購自斯貝福(北京)生物科技有限公司。經(jīng)過1周適應(yīng)后,將32只8周齡小鼠根據(jù)體重隨機分為4個組,即對照組(CON組)、褐藻寡糖組(AOS組)、嘔吐毒素組(DON組)和褐藻寡糖+嘔吐毒素組(AOS+DON組),每組8只小鼠。每籠飼養(yǎng)4只小鼠。本試驗共計28 d,分為DON處理前(前21 d)和處理后(后7 d)2個階段。前21 d,AOS組和AOS+DON組小鼠每天灌胃200 μL(200 mg/kg BW)AOS,CON組和DON組小鼠每天灌胃等體積無菌生理鹽水;后7 d,DON組和AOS+DON組小鼠每天灌胃100 μL(4.8 mg/kg BW)DON,CON和DON組小鼠每天灌胃等體積無菌生理鹽水。小鼠自由飲水和采食,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～22 ℃,相對濕度為35%～44%,12 h光照12 h黑暗。所有涉及小鼠的試驗過程均遵循中國農(nóng)業(yè)動物護(hù)理和使用倫理委員會的指導(dǎo)方針進(jìn)行。試驗期間每周記錄小鼠體重,觀察小鼠整體健康狀況?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.91粗蛋白質(zhì) CP18.80粗脂肪 EE5.26粗纖維 CF3.06鈣 Ca1.12總磷 TP0.72賴氨酸 Lys1.40蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys1.15

1.2 樣品收集

試驗結(jié)束后,眼球采血法采集小鼠血液,置于無抗凝劑的離心管中,在4 ℃、3 000 r/min離心10 min,分離血清并于-80 ℃保存。隨后脫頸處死小鼠,無機械損傷分離肝臟組織,稱量肝臟重量并記錄,用無菌生理鹽水沖洗后,取一份肝臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定保存,用于制備切片;另一份肝臟組織凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)分析。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 體重和體增重

每周對小鼠稱重并記錄數(shù)據(jù),統(tǒng)計各組小鼠的8、9、10、11、12周齡的體重和8～11周體增重。

1.3.2 肝臟指數(shù)

分離完整肝臟并用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗,用濾紙吸去水分后稱重,計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=[肝臟重量(g)/體重(g)]×100。

1.3.3 肝臟組織蘇木精-伊紅染色和免疫熒光分析

剪取各小鼠肝臟組織,用無菌磷酸鹽緩沖液清洗后,固定在4%多聚甲醛溶液中,對其進(jìn)行脫水、石蠟包埋樣品切片,通過蘇木精-伊紅染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察并分析肝臟組織病理學(xué)變化。在武漢塞維爾生物科技有限公司完成肝臟組織F4/80免疫熒光分析,觀察肝臟組織巨噬細(xì)胞浸潤情況,通過熒光強度平均值反映巨噬細(xì)胞含量,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4 血清和肝臟炎癥細(xì)胞因子和氧化/抗氧化指標(biāo)

使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析試劑盒檢測小鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。取肝臟組織樣品,冰上解凍后,制備小鼠肝臟組織勻漿樣品,取上清測定肝臟炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10)含量;同時,取上清使用比色法測定肝臟丙二醛(MDA)含量和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。以上指標(biāo)均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.5 肝臟功能指標(biāo)

收集小鼠血清樣品,使用全自動血液生化分析系統(tǒng)(AU5400,Beckman Coulter,美國)測定小鼠血清中反映肝臟功能的指標(biāo),包括血清AST、AST、乳酸脫氫酶(LDH)活性及甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量,均使用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏多重比較檢驗分析組間差異顯著性,并分析AOS和DON對小鼠的交互作用。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 9.0軟件制作數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

由表2可知,各組小鼠初始體重(8周齡體重)無顯著差異(P>0.05)。給小鼠灌胃AOS后,與CON組相比,AOS組的10和11周齡體重顯著增加(P<0.05);且AOS組的8～11周齡體增重顯著高于對照組(P<0.05)。DON誘導(dǎo)后,與CON組相比,DON組的12周齡體重顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的12周齡體重顯著增加(P<0.05)。與CON組相比,DON組的肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。12周齡體重、肝臟指數(shù)、11～12周齡體重變化存在AOS與DON的顯著交互作用(P<0.05)。

表2 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

2.2 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠血清和肝臟炎癥細(xì)胞因子和氧化/抗氧化指標(biāo)的影響

如圖1可知,與CON組相比,DON組的血清和肝臟IL-1β、IL-68和TNF-α含量顯著增加(P<0.05),血清IL-8含量顯著增加(P<0.05),提示DON可引起小鼠機體和肝臟組織中促炎細(xì)胞因子含量的增加,造成機體出現(xiàn)明顯的炎癥損傷。與DON組相比,AOS+DON組的血清和肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05),血清IL-8含量顯著降低(P<0.05);與CON組相比,DON和AOS+DON組的肝臟IL-10含量顯著降低(P<0.05)。

與CON組相比,DON組的肝臟MDA含量顯著增加(P<0.05),肝臟T-SOD活性顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05),肝臟T-SOD活性顯著增加(P<0.05)。與CON組相比,AOS組的肝臟T-SOD活性顯著增加(P<0.05)。同時,除肝臟IL-10和T-SOD指標(biāo)外,其余指標(biāo)均存在AOS與DON的顯著交互作用(PAOS×DON<0.05)。上述結(jié)果提示,AOS通過調(diào)控多種細(xì)胞因子分泌和氧化/抗氧化酶活性緩解DON誘導(dǎo)的小鼠機體和肝臟損傷。

2.3 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

如圖2所示,CON組和AOS組小鼠肝臟組織病理學(xué)切片中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常,未見明顯肝細(xì)胞病理損傷、炎癥浸潤或脂質(zhì)沉積;DON組小鼠肝臟組織病理學(xué)切片中出現(xiàn)肝細(xì)胞點狀壞死,且變形、腫脹,存在明顯炎癥浸潤、脂質(zhì)沉積或細(xì)胞瘤樣病變,呈特征性放射纖維狀;AOS+DON組病變程度明顯減輕,肝細(xì)胞形態(tài)明顯改善,且脂肪空泡數(shù)量減少。

F4/80免疫熒光染色后,與CON組相比,DON組的肝臟巨噬細(xì)胞含量顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的肝臟巨噬細(xì)胞含量顯著減少(P<0.05)。

CON:對照組;AOS:褐藻寡糖組;DON:嘔吐毒素組;AOS+DON:褐藻寡糖+嘔吐毒素組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.4 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠血清AST、ALT、LDH活性及TG、TC含量的影響

如圖3所示,與CON組相比,DON組的血清AST、ALT和LDH活性均顯著增加(P<0.05),AOS組的血清AST活性顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的血清AST、ALT和LDH活性均顯著降低(P<0.05)。與CON組相比,DON組的血清TG和TC含量均顯著增加(P<0.05),AOS組的血清TG含量顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的血清TG和TC含量均顯著降低(P<0.05)。同時,除血清AST和TG指標(biāo)外,其余指標(biāo)均存在AOS與DON的顯著交互作用(PAOS×DON<0.05)。上述結(jié)果提示,AOS對DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷有顯著緩解效果,尤其在改善小鼠血清中肝臟功能標(biāo)志性指標(biāo)方面。

DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 4’,6-diamidino-2-phenylindole;H&E:蘇木精-伊紅 hematoxylin eosin。

圖3 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠血清AST、ALT、LDH活性及TG、TC含量的影響

3 討 論

3.1 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

研究表明,與對照組相比,小鼠采食DON飼糧后,食糜中DON含量升高,造成小鼠胃腸道損傷,進(jìn)而降低其平均日增重和平均日采食量[24]。與前人研究結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn)DON可導(dǎo)致小鼠體重降低,阻礙其生長;與CON組相比,灌胃3周的AOS可顯著增加小鼠體重和體增重;與DON組相比,AOS可緩解DON誘導(dǎo)的小鼠體重降低。張麗等[25]研究表明,飼糧中添加20、40或80 mg/kg AOS顯著提升斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量,改善仔豬生長性能。劉萍等[26]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加褐藻糖膠可顯著降低1～14天仔豬料重比,但對試驗全期仔豬平均日增重和平均日采食量無顯著影響。

研究發(fā)現(xiàn),給小鼠灌胃放射性同位素示蹤標(biāo)記的DON,血漿和組織的吸收峰值在30 min;小鼠口服DON(25 mg/kg BW),5 min后檢測不同組織中DON濃度為:肝臟(19.5±1.9) μg/kg,血漿12.1 μg/mL,腎臟(7.6±0.5) μg/kg,脾臟(7.3±0.8) μg/kg,心臟(6.8±0.9) μg/kg和大腦(0.8±0.1) μg/kg[27]。由此可見,肝臟是機體代謝DON的重要解毒器官之一。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與CON組相比,DON灌胃小鼠可顯著增加肝臟指數(shù),表明DON對肝細(xì)胞系和實體肝臟組織具有明顯的毒性作用[13]。然而,AOS可顯著減少DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟指數(shù)增加。這可能是因為AOS能下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá),上調(diào)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌,發(fā)揮抗炎和抗氧化損傷功能,進(jìn)而緩解組織器官的炎癥損傷[27]。因此,AOS通過調(diào)控小鼠的生長性能和肝臟功能緩解DON誘導(dǎo)的肝臟損傷。

3.2 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠血清和肝臟炎癥細(xì)胞因子和氧化/抗氧化指標(biāo)的影響

炎癥細(xì)胞因子含量是反映機體炎癥損傷和免疫失調(diào)的重要生物標(biāo)志物[28]。研究發(fā)現(xiàn),DON暴露上調(diào)機體炎癥反應(yīng),并選擇性促進(jìn)機體促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)上調(diào),例如DON誘導(dǎo)的仔豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)的細(xì)胞損傷是通過促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生,顯著上調(diào)與凋亡、炎癥相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)[29],而通過外源補充杜仲黃酮能顯著緩解DON誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子含量的增加[30]。同時,氧化應(yīng)激是DON誘導(dǎo)的重要毒性機制之一,研究發(fā)現(xiàn),DON可導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激,增加肝臟組織中MDA含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性,降低過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性[31]。且隨著DON濃度的增強,對動物的毒性作用加強,導(dǎo)致氧化應(yīng)激現(xiàn)象加劇,并伴隨肝臟組織損傷、免疫失調(diào)等現(xiàn)象[32]。大量研究證明,海藻多糖的水解產(chǎn)物寡糖對小鼠肝臟損傷具有一定保護(hù)作用。例如,殼寡糖具有良好的抗氧化活性,能夠增強體內(nèi)抗氧化酶活性,在肝臟損傷中起到保護(hù)作用,多種植物或海藻來源的多糖或寡糖能不同程度地降低機體促炎細(xì)胞因子的合成和分泌[33]。與前人研究結(jié)果一致,本試驗中DON組的小鼠肝臟MDA含量較CON組顯著增加,而AOS可以抑制MDA含量的升高,并提高肝臟T-SOD活性。因此,AOS能夠通過降低DON導(dǎo)致的炎癥因子分泌,緩解機體炎癥損傷,同時中和DON的氧化應(yīng)激毒性,促進(jìn)小鼠體內(nèi)氧化還原代謝平衡。

3.3 AOS對DON誘導(dǎo)小鼠肝臟組織病理學(xué)和肝臟功能指標(biāo)的影響

在本研究中,與健康小鼠相比,DON組肝臟組織出現(xiàn)明顯病理變化,出現(xiàn)細(xì)胞點狀壞死、細(xì)胞間界限模糊,且凋亡增多,存在明顯脂質(zhì)沉積,提示了DON導(dǎo)致小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯病理損傷,然而,添加AOS可顯著緩解上述肝臟病理損傷癥狀。肝臟和胃腸道是霉菌毒素代謝的主要部位[34],依據(jù)最新綜述文章,霉菌毒素顯著破壞機體的腸道屏障、免疫機能、抗氧化功能、微生態(tài)平衡和營養(yǎng)物質(zhì)代謝等,其中DON造成腸道屏障功能障礙、免疫失調(diào)以及細(xì)胞死亡等毒性作用較為強烈[35],而且大量研究證實了不同濃度DON可導(dǎo)致機體出現(xiàn)急性或慢性肝臟組織損傷[36],同時,DON能影響動物肝臟組織結(jié)構(gòu)完整性和功能[37]。Peng等[38]研究發(fā)現(xiàn),小鼠攝入DON(25 μg/kg BW)30和90 d會導(dǎo)致肝臟中央靜脈周圍輕度炎癥浸潤,IL-1β、IL-6和TNF-α含量升高,ALT活性升高,提示肝臟功能損傷。此外,已有研究證實了DON可引起肝細(xì)胞破裂、空泡化和巨噬細(xì)胞增殖[14]。與本試驗結(jié)果一致,均提示了DON可破壞肝臟形態(tài)和功能,導(dǎo)致肝臟毒性和炎癥。

研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加AOS可激活脂肪酸代謝相關(guān)途徑,減少肝臟組織脂肪積累,增加抗氧化活性,從而使機體免受氧化損傷[39]。Hao等[33]研究發(fā)現(xiàn),添加AOS 10 mg/kg可改善與免疫和抗腫瘤作用相關(guān)的血液代謝產(chǎn)物,從而改善小鼠的肝臟組織損傷,上述結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。這提示AOS能夠通過減少某些脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,激活小鼠機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng),緩解DON誘導(dǎo)的肝臟損傷。AST、ALT和LDH活性是反映肝臟功能損傷的重要指標(biāo),肝細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重壞死時,上述酶活性顯著升高。同時,TC和TG作為血脂的重要組分,如果肝臟發(fā)生病變,其含量會有所增加,且其含量升高可促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生與發(fā)展,一定程度上反映肝臟損傷程度。有研究表明,海藻酸寡糖顯著緩解高脂飼糧誘導(dǎo)小鼠血清中肝臟功能損傷指標(biāo)(AST、ALT和LDH)和血脂代謝指標(biāo)(TG和TC)異常[40]。與上述結(jié)果類似,本試驗表明AOS可緩解DON誘導(dǎo)的小鼠臟肝功能紊亂和脂類代謝異常,減少機體脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生和肝臟脂質(zhì)沉積,進(jìn)而緩解DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷。

4 結(jié) 論

AOS能夠改善肝臟病理學(xué)損傷、機體炎癥和氧化應(yīng)激,維護(hù)肝臟功能,進(jìn)而緩解DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷。