全浩瑋 王慶鳳 王毓甜 李澤昆 米金秋 李天天 馬秋剛 黃世猛*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院,北京 100037)

霉菌毒素污染是畜禽養(yǎng)殖面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)之一,不僅會(huì)造成飼料資源浪費(fèi),而且當(dāng)飼糧中霉菌毒素含量超標(biāo)時(shí),容易造成畜禽肝臟、腎臟以及免疫器官的損傷,從而影響畜禽生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)[1-3]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又稱嘔吐毒素,是污染農(nóng)作物和畜禽飼料最嚴(yán)重的真菌毒素之一,主要由黃色鐮刀菌和禾谷鐮刀菌代謝產(chǎn)生[4]。2021年我國飼糧和飼料原料中霉菌毒素污染狀況調(diào)查顯示,調(diào)查的1 025份樣品中DON檢出率均達(dá)到88%以上,除雜粕未見超標(biāo)外,其他樣品均有超標(biāo)[5]。畜禽采食DON污染的飼糧后,會(huì)出現(xiàn)采食量下降、營養(yǎng)不良、增重降低、嘔吐腹瀉等癥狀,從而導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降和代謝紊亂,給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí),動(dòng)物產(chǎn)品中殘留的DON可能通過食物鏈對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[6-7]。

畜禽采食DON污染的飼糧后,不僅會(huì)造成腸道損傷,還會(huì)引起肝臟等臟器毒性。肝臟是機(jī)體重要的解毒器官,也是DON在畜禽機(jī)體內(nèi)最重要的靶器官,因此,DON造成的肝臟損傷機(jī)制是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[8]。研究表明,低濃度和高濃度的DON均可引起肝臟不同程度的組織損傷和細(xì)胞損傷,例如肝臟纖維化和細(xì)胞毒性,其潛在機(jī)制可能與DON抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成,促進(jìn)核糖體應(yīng)激、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,破壞線粒體和細(xì)胞膜,最后通過不同途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡有關(guān)[9-11]。DON在肝臟組織中降解成DON-葡糖苷酸,并且通過改變不同細(xì)胞系中腫瘤抑制蛋白53(p53)、半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-7(Caspase-7)、半胱天冬蛋白酶-8(Caspase-8)、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá),誘導(dǎo)肝臟損傷[12-13]。同時(shí),DON可誘導(dǎo)糖原減少,增加鐵血黃素顆粒,使光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和干細(xì)胞內(nèi)核糖體丟失,高濃度的DON可導(dǎo)致肝小葉-門靜脈局部壞死和肝臟損傷[14-16]。當(dāng)前,DON污染和防治問題引起了人們的強(qiáng)烈關(guān)注。因此,尋找有效緩解DON誘導(dǎo)肝臟損傷的技術(shù)方案對(duì)畜禽生產(chǎn)至關(guān)重要。

瓊膠寡糖(agaro-oligosaccharide,AO)作為來源于紅藻的一種低分子質(zhì)量糖,聚合度為2～20,是經(jīng)由海藻多糖降解后保留的功能活性成分,易于被機(jī)體吸收,生物利用度高,是一種具有益生活性以及抗氧化、抗炎和保肝作用的新型海洋功能性低聚合度寡糖分子[17-21]。研究發(fā)現(xiàn),瓊膠寡糖可提高脂多糖(LPS)刺激后RAW264.7的細(xì)胞活力,劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞上清中一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和活性氧(ROS)的生產(chǎn),減輕炎癥反應(yīng),從而預(yù)防細(xì)胞炎癥的發(fā)生[17]。瓊膠寡糖能否緩解DON誘導(dǎo)的肝臟損傷目前尚未報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷為研究對(duì)象,探究瓊膠寡糖緩解DON誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的作用效果與機(jī)制,為瓊膠寡糖作為飼料添加劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用7周齡、初始體重為(20.04±0.80) g的無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)C57BL/6J雌性小鼠32只,適應(yīng)期為1周,小鼠飼養(yǎng)在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)SPF標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中,所有動(dòng)物試驗(yàn)均按照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物福利與動(dòng)物試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的規(guī)程進(jìn)行。32只小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為4組,每組8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1只。試驗(yàn)共28 d,分為毒素處理前和毒素處理2個(gè)階段。毒素處理前階段,對(duì)照組(CON組)和嘔吐毒素組(DON組)小鼠每天灌胃200 μL(200 mg/kg BW)無菌生理鹽水,瓊膠寡糖組(AO組)和瓊膠寡糖+嘔吐毒素組(AO+DON組)小鼠每天灌胃200 μL瓊膠寡糖,連續(xù)處理21 d。毒素處理階段,DON組和AO+DON組小鼠每天灌胃100 μL(4.8 mg/kg BW)DON,CON組和AO組小鼠每天灌胃100 μL無菌生理鹽水,連續(xù)處理7 d。

飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～22 ℃,相對(duì)濕度為35%～44%,晝夜光照交替時(shí)間為12 h/12 h,自由采食和飲水,每周記錄小鼠的采食量和體重?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content豆粕 Soybean meal16.00豆油 Soybean oil2.30魚粉 Fish meal3.00石粉 Limestone1.50磷酸氫鈣 CaHPO44.00復(fù)合維生素預(yù)混料 Multi-vitamin premix1)1.00復(fù)合礦物質(zhì)預(yù)混料 Multi-mineral premix1)1.00L-半胱氨酸 L-Cys (98%)0.18膽堿 Choline0.05合計(jì) Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.91粗蛋白質(zhì) CP18.80粗脂肪 EE5.26粗纖維 CF3.06鈣 Ca1.12總磷 TP0.72賴氨酸 Lys1.40蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys1.15

1.2 樣品采集

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),采用眼球采血,收集小鼠血液樣品。小鼠斷頸、脫臼處死,剖開腹部,收集肝臟組織,稱重并記錄數(shù)據(jù);無機(jī)械損傷收集肝臟組織,一部分用滅菌生理鹽水沖洗干凈后,置于4%多聚甲醛固定液保存,用于制備切片分析肝臟組織病理學(xué);另一部分液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 體重

以組為單位每周對(duì)小鼠稱重,記錄數(shù)據(jù),計(jì)算8、9、10、11、12周齡的體重。

1.3.2 肝臟指數(shù)

每只小鼠稱重后,完整取下肝臟組織,用滅菌生理鹽水沖洗干凈,然后用濾紙將血水擦拭干凈后稱重,計(jì)算肝臟指數(shù):

肝臟指數(shù)(%)=[肝臟重量(g)/體重(g)]×100。

1.3.3 血清細(xì)胞因子含量

將采集的血液置于無抗凝劑的離心管,在4 ℃、3 000 r/min離心15 min后收集血清,采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α含量,試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。

1.3.4 肝臟細(xì)胞因子含量和抗氧化指標(biāo)

取肝臟組織樣品,置于冰上解凍,經(jīng)勻漿、離心后,取上清液,測定肝臟IL-1β、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和TNF-α含量;同時(shí)測定肝臟丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)及過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。

1.3.5 肝臟組織形態(tài)

每組隨機(jī)選取3個(gè)重復(fù),小心剪取各組小鼠約1 cm3的肝臟組織,用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,用4%多聚甲醛固定液保存。經(jīng)脫水、包埋、切片制作5 μm的肝臟組織切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)。

肝臟組織免疫熒光(IF)試驗(yàn)操作均在武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行,具體的試驗(yàn)步驟如下:將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水、抗原修復(fù)處理。按照試劑盒的操作說明滴加3%過氧化氫室溫孵育抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性;用PBS洗滌后加試劑A(封閉液)室溫封閉30 min,甩掉試劑A,滴加一抗F4/80(1∶500)4 ℃過夜,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。PBS洗滌后滴加二抗37 ℃孵育30 min,玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5 min。加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液,避光室溫孵育10 min。玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上洗滌3次,每次5 min。加自發(fā)熒光淬滅劑B液5 min,流水沖洗10 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?然后鏡檢照相,采集圖像。

1.3.6 肝臟生化指標(biāo)

使用全自動(dòng)血液生化分析系統(tǒng)(AU5400,Beckman Coulter,美國)測定肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量,采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.7 肝臟炎癥損傷相關(guān)基因表達(dá)

采用RNA提取試劑盒抽提小鼠肝臟組織總RNA,根據(jù)說明書要求進(jìn)行操作,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,得到的cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟炎癥損傷相關(guān)基因表達(dá),引物序列見表2。反應(yīng)體系為:0.25 μL上游引物,0.25 μL下游引物,6.5 μL無核酸水,3 μL cDNA和10 μL SYBR Green Master Mix,混合成20 μL的反應(yīng)體系。使用熒光定量PCR儀通過其特異性引物擴(kuò)增目的基因[TNF-α、IL-1β、IL-6、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-3和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β(LC3B)]mRNA。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,35個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

表2 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)分析組間差異顯著性。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 9.0軟件制作數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響

如表3所示,4組小鼠8、9、10、11、12周齡的體重均無顯著差異(P>0.05)。DON組和AO+DON組小鼠肝臟指數(shù)顯著高于CON組和AO組(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組小鼠肝臟指數(shù)有所降低,但差異不顯著(P>0.05)。

表3 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響

2.2 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠血清和肝臟細(xì)胞因子含量及肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如圖1所示,在血清中(圖1-A和圖1-B),與CON組相比,DON組IL-1β和TNF-α含量顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組IL-1β和TNF-α含量顯著減少(P<0.05)。在肝臟中(圖1-C～圖1-J),與CON組相比,DON組IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量顯著增加(P<0.05),T-AOC及CAT、T-SOD和GSH-Px活性顯著減少(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量顯著減少(P<0.05),T-AOC及CAT、T-SOD和GSH-Px活性顯著增加(P<0.005)。

以上結(jié)果表明,DON誘導(dǎo)會(huì)增加小鼠血清和肝臟中促炎細(xì)胞因子的含量,而添加AO通過降低小鼠血清和肝臟組織中促炎細(xì)胞因子含量,增加抗炎細(xì)胞因子含量緩解DON誘導(dǎo)的小鼠炎癥損傷。

CON:對(duì)照組;AO:瓊膠寡糖組;DON:嘔吐毒素組;AO+DON:瓊膠寡糖+嘔吐毒素組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

如圖2所示(如箭頭所示),CON組和AO組小鼠肝臟組織病理學(xué)切片中肝細(xì)胞形態(tài)正常,排列規(guī)則,細(xì)胞核位于肝細(xì)胞中央,大靜脈附近無明顯炎性浸潤。DON組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞瘤樣病變,大靜脈附近出現(xiàn)明顯的炎性浸潤,肝細(xì)胞排列呈現(xiàn)不規(guī)則結(jié)節(jié)狀,有特征性放射纖維狀。與DON組相比,AO+DON組肝臟組織呈現(xiàn)明顯改善。F4/80免疫熒光染色結(jié)果表明,與CON組相比,DON組肝臟巨噬細(xì)胞浸潤顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組肝臟巨噬細(xì)胞浸潤顯著降低(P<0.05)。

以上結(jié)果表明,瓊膠寡糖可緩解DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷。

DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 4’,6-diamidino-2-phenylindole;H&E:蘇木精-伊紅 hematoxylin eosin。

2.4 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

如圖3所示,與CON組相比,AO組肝臟AST、ALT活性和TG、TC含量顯著降低(P<0.05),而DON組肝臟AST、ALT活性和TG、TC含量顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組肝臟AST、ALT活性和TC含量顯著降低(P<0.05)。

圖3 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

以上結(jié)果表明,DON可導(dǎo)致小鼠肝臟組織功能紊亂,AO可通過調(diào)節(jié)AST、ALT活性和TG、TC含量改善肝臟組織功能,緩解DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟功能損傷。

2.5 瓊膠寡糖對(duì)DON誘導(dǎo)小鼠肝臟炎癥損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示,與CON組相比,DON組的肝臟IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-3、LC3B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組的肝臟IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-3、LC3B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

以上結(jié)果表明,AO對(duì)DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥和氧化損傷具有改善作用。

3 討 論

DON作為全球范圍內(nèi)普遍存在的一種霉菌毒素,全世界每年70%的農(nóng)作物產(chǎn)品受到霉菌毒素的污染,不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也危害動(dòng)物和人類的健康,例如攝入DON污染的食物會(huì)導(dǎo)致急性毒性、胃腸道毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性等[5-6]。近些年研究表明,肝臟是DON的主要靶器官,是體內(nèi)DON解毒和代謝的主要器官,DON在體內(nèi)和體外均可引發(fā)急性或慢性肝臟損傷(肝臟毒性)[22]。大量研究表明,較高濃度的DON可導(dǎo)致機(jī)體肝臟損傷,例如肝臟重量減少、門靜脈和門靜脈周纖維化、腫瘤病變和干細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的改變[23],低濃度的DON會(huì)導(dǎo)致肝臟組織中度病變。肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官,廣泛參與許多生物過程,包括新陳代謝、免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、解毒和抗菌防御等[24]。因此,本研究致力于明晰DON對(duì)小鼠肝臟功能的影響,尋找和篩選能有效緩解DON誘導(dǎo)肝臟損傷的益生元。瓊膠寡糖作為海洋紅藻植物細(xì)胞壁中的多糖成分,其分子質(zhì)量小、水溶性好且易被人體吸收,生物活性和應(yīng)用價(jià)值得到顯著提高,瓊膠寡糖的生物學(xué)功能受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注,但瓊膠寡糖與緩解肝臟損傷相關(guān)聯(lián)的報(bào)道卻很少,本研究探討了瓊膠寡糖緩解DON誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的效果和作用機(jī)制。

臟器指數(shù)是重要的生物學(xué)特性指標(biāo),是指受試動(dòng)物實(shí)質(zhì)器官重量與體重的比值,在一定程度上反映動(dòng)物機(jī)體內(nèi)各器官發(fā)育程度。在一般情況下,臟器重量與機(jī)體重量呈正相關(guān),但是臟器重量受到多種因素的影響,如自身因素的影響和環(huán)境因素的影響[25],動(dòng)物機(jī)體受到損傷后,其體內(nèi)臟器重量會(huì)發(fā)生變化,臟器指數(shù)變大,可能表明該臟器發(fā)生充血、水腫、增生、肥大等病變;臟器指數(shù)變小,可能表明該臟器已經(jīng)萎縮或發(fā)生其他損傷現(xiàn)象。小鼠肝臟指數(shù)是反映其肝臟功能是否正常的指標(biāo)之一[26]。在本研究中,DON導(dǎo)致小鼠的肝臟指數(shù)顯著增加,表明肝臟在DON作用下發(fā)生充血、增生和肥大等病變,相比DON組,AO+DON組的小鼠肝臟指數(shù)無顯著差異,但有降低的趨勢。同時(shí),與DON組相比,添加瓊膠寡糖可明顯改善DON引起的肝臟組織病理性損傷。F4/80免疫熒光染色結(jié)果表明,添加瓊膠寡糖可顯著改善肝臟組織巨噬細(xì)胞浸潤,提示了瓊膠寡糖可緩解DON誘導(dǎo)的肝臟損傷。Hong等[27]研究了新瓊寡糖對(duì)小鼠高脂飼糧所致肥胖和血糖的影響,結(jié)果表明飼喂新瓊寡糖可顯著降低體重,緩解肝臟組織脂肪堆積和囊泡性脂肪變性;同時(shí),新瓊寡糖可顯著降低血清TC、TG、游離脂肪酸含量,可以通過誘導(dǎo)脂聯(lián)素的產(chǎn)生來有效抑制肥胖和與肥胖有關(guān)的代謝綜合征[28]。由此可見,新瓊寡糖可調(diào)節(jié)肝臟組織功能,發(fā)揮抗肥胖和抗糖尿病作用。

抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px被認(rèn)為是防止氧化損傷的主要防御系統(tǒng),前人研究表明,瓊膠寡糖能提高SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量和AST、ALT活性;瓊膠寡糖添加劑量在400 mg/kg時(shí),肝臟中MDA含量降低了44%,肝臟和血清中SOD和GSH-Px活性升高,血清中ALT活性下降了22.16%[29]。由此可見,瓊脂寡糖不僅通過自身的自由基清除活性發(fā)揮抗氧化作用,而且通過增強(qiáng)宿主抗氧化酶系統(tǒng)來清除ROS,從而緩解氧化損傷,保護(hù)肝臟。機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶主要包括CAT、SOD、T-AOC和GSH-Px,可從不同角度協(xié)助機(jī)體清除體內(nèi)的ROS,在抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用,其含量與機(jī)體抗氧化能力呈正相關(guān),通常以上述抗氧化酶活性來評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力。與前人研究結(jié)果較為一致,本試驗(yàn)結(jié)果提示了DON可導(dǎo)致小鼠肝臟組織中抗氧化酶活性降低和氧化損傷標(biāo)志物MDA含量增加,而添加瓊膠寡糖可增加抗氧化酶(CAT、T-SOD、T-AOC和GSH-Px)活性。林福娣[30]研究發(fā)現(xiàn),新瓊寡糖可緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,增加HepG2肝臟細(xì)胞系GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶活性,抑制細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,從而提升細(xì)胞活性。本試驗(yàn)中,DON顯著增加了小鼠血清AST、ALT活性和TG、TC含量,而添加瓊膠寡糖后,可顯著降低血清AST、ALT活性和TC含量。ALT與AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi),如果肝臟受損,肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶便進(jìn)入血液,血清AST、ALT活性便會(huì)升高,ALT和AST活性升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致。因此,DON可導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞損傷,而添加瓊膠寡糖可以在一定程度上緩解DON對(duì)小鼠肝臟的氧化損傷。

同時(shí),在本研究中,DON顯著增加了小鼠血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α含量,也顯著增加了肝臟中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量,添加瓊膠寡糖后可顯著降低血清和肝臟中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)含量,緩解DON誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)。通過對(duì)肝臟mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測,DON可顯著增加肝臟IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平量,而添加瓊膠寡糖后可顯著降低肝臟IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。通過分析前人研究,例如鄭雅君等[17]研究發(fā)現(xiàn),瓊膠寡糖對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中NO的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用,且呈劑量依賴,對(duì)NO的作用主要源于自身抗炎活性作用,可以顯著抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生和釋放。瓊膠寡糖抑制細(xì)胞炎癥主要通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路。Lu等[31]發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖預(yù)處理后,添加LPS誘導(dǎo)細(xì)胞的MAPK家族激酶c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular signals regulate protein kinases,ERK)、p38的磷酸化水平顯著降低,瓊膠寡糖通過阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo),進(jìn)而降低細(xì)胞的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子分泌,減輕細(xì)胞炎癥損傷。與大多數(shù)研究一致,多糖或寡糖對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的抗炎作用與MAPK信號(hào)通路傳導(dǎo)的阻斷密切相關(guān)。Lu等[31]研究發(fā)現(xiàn),茯苓多糖通過MAPK信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥,阻斷其中促炎介質(zhì)ERK和JNK信號(hào)通路,抑制促炎因子的基因表達(dá)和分泌。Ma等[32]研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖抑制了LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中p38、ERK和JNK磷酸化,降低巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。在本研究中,通過分析肝臟中NLRP3、Caspase-3和LC3B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與DON組相比,添加瓊膠寡糖可顯著降低上述基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,這在一定程度上解釋了瓊膠寡糖可緩解DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷。針對(duì)瓊膠寡糖通過何種途徑抑制DON誘導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng),緩解肝臟損傷,還需后續(xù)試驗(yàn)的深入探索。

4 結(jié) 論

瓊膠寡糖可改善小鼠機(jī)體代謝功能,提高小鼠肝臟功能,緩解DON誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織的病理損傷、代謝功能損傷、炎癥和氧化損傷,增強(qiáng)機(jī)體抗病能力。