羅鑫宇 葛超悅,2 呂雨杰,2 吳瀲池 胡兆瑩 郭燕姍,2 曹久愛 劉 兵* 余東游,2*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,杭州 310058;2.浙江大學(xué)海南研究院,三亞 572025)

博落回屬于罌粟科博落回屬,在我國分布廣泛,主要集中在長江中下游地區(qū)。早在《本草拾遺》中便有關(guān)于博落回的記載[1],在我國自古便應(yīng)用于消毒、緩解肌肉疼痛等癥狀[2]。博落回的主要生物學(xué)成分是血根堿、白屈菜紅堿等生物堿,其在動物體內(nèi)不容易被消化吸收,大部分都通過消化道直接排泄出來,僅有少部分在體內(nèi)發(fā)揮作用[3],因此動物產(chǎn)品中也不易有殘留,不會危害到人體健康[4]。

我國自2020年7月1日起全面禁止在飼糧中添加促生長類抗生素來提高動物生長性能,各種替抗產(chǎn)品層出不窮,其中,博落回提取物具有促生長、抗氧化和抗炎特性,可提高動物的抗氧化能力和免疫性能,是一種理想的抗生素替代產(chǎn)品。鄒朋[5]發(fā)現(xiàn),飼糧中添加博落回提取物可提高蛋雞的抗氧化能力和產(chǎn)蛋率;夏超篤等[6]發(fā)現(xiàn),飼糧中添加博落回提取物可顯著提高斷奶仔豬血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,降低血清丙二醛(MDA)含量;曾澤等[7]發(fā)現(xiàn),博落回提取物可以降低副豬嗜血桿菌誘導(dǎo)的豬肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子的mRNA表達(dá)量下調(diào)。目前,博落回提取物在雞、豬上的研究較為常見,但在番鴨上鮮有報(bào)道。博落回散為博落回提取物經(jīng)加工制成的散劑,是國家批準(zhǔn)的二類替抗中獸藥及藥物飼料添加劑,已列入《藥物飼料添加劑品種目錄》。在肉雞上的研究顯示,博落回散可提高肉雞的生長性能,改善腸道黏膜發(fā)育,提高機(jī)體抗氧化能力,在肉雞生長中可以替代飼用促生長抗生素使用[8]。本試驗(yàn)在番鴨飼糧中添加不同水平的博落回散,擬探究對番鴨生長性能、肉品質(zhì)、免疫器官指數(shù)、血清抗氧化指標(biāo)和回腸促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響,旨在為博落回在番鴨上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

博落回散(主要有效成分為白屈菜紅堿和血根堿)由湖南某生物資源股份有限公司提供,總堿含量為3.75%,其中白屈菜紅堿含量為1.25%,血根堿含量為2.50%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用1日齡健康雄性番鴨360羽,預(yù)飼7 d后[體重(147.58±9) g]隨機(jī)分為6組,每組6個重復(fù),每個重復(fù)10羽。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧,抗生素組(ANT組)在基礎(chǔ)飼糧中添加25 mg/kg金霉素,試驗(yàn)組(T1～T4組)分別在基礎(chǔ)飼糧中添加10、20、40和80 mg/kg的博落回散,正式試驗(yàn)期為49 d。試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼糧參考NRC(1994)鴨營養(yǎng)需要和《肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 2122—2012)配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

飼養(yǎng)試驗(yàn)在浙江省湖州市南潯區(qū)海冠農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司養(yǎng)殖基地開展,采用網(wǎng)上平養(yǎng)模式,按照常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行。0～3周齡控制室內(nèi)地面溫度維持在25 ℃左右,之后維持在22 ℃左右。試驗(yàn)期間保證番鴨自由飲食和飲水,定期進(jìn)行鴨舍消毒和通風(fēng)換氣。

1.3 樣品采集與制備

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束(56日齡)時,從每個重復(fù)中隨機(jī)選取1羽番鴨(體重接近組均重),禁食12 h后采血5 mL置于促凝管中,37 ℃水浴5 min,3 500 r/min離心10 min分離出血清,分裝到1.5 mL Eppendorf管后,放入-80 ℃冰箱中保存;采血后將所選番鴨屠宰,統(tǒng)一采集左側(cè)胸肌和回腸段,用液氮預(yù)冷后干冰運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室,-80 ℃冰箱保存。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能

飼養(yǎng)試驗(yàn)開始(7日齡)時稱取雛鴨體重,以重復(fù)為單位記錄每周的采食量,并在56日齡空腹稱重,計(jì)算出各組番鴨的7日齡體重、56日齡體重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。

1.4.2 肉品質(zhì)

胸肌肉品質(zhì)檢測方法參考NY/T 1333—2007。左側(cè)胸肌冷藏24 h后,采用便攜式pH計(jì)測定3個不同位點(diǎn)pH,結(jié)果取平均值(記為pH24 h);采用SP60系列肉色儀(x-rite,美國)測定胸肌3個不同位點(diǎn)顏色[亮度(L*)值、紅度(a*)值和黃度(b*)值]。另取5 cm×3 cm×2 cm的左側(cè)胸肌,拭去表面水分后稱量其初始重(記為m1),將其在4 ℃懸掛24 h后,用濾紙吸干表面水分,稱量所得的重量(記為m2);然后將其包在自封袋中蒸煮至中心溫度約75 ℃,取出并用濾紙拭去表面水分,稱取重量(記為m3)。根據(jù)上述記錄的重量計(jì)算滴水損失和蒸煮損失,計(jì)算公式如下:

滴水損失(%)=[(m1-m2)/m1]×100;蒸煮損失(%)=[(m1-m3)/m1]×100。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)

血清中總抗氧化能力(T-AOC)與超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及MDA含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測定,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 回腸黏膜中促炎細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量

采用實(shí)時熒光定量PCR測定回腸黏膜中炎癥相關(guān)基因白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表2。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,各目的基因的mRNA相對表達(dá)量采用2-ΔΔct法計(jì)算。

表2 引物序列

1.4.5 免疫器官指數(shù)

番鴨屠宰后,完整取出胸腺、脾臟和法氏囊,濾紙擦凈上面的血漬,剔除附著在組織上的脂肪后,稱重并計(jì)算相應(yīng)的免疫器官指數(shù),計(jì)算公式如下:

某免疫器官指數(shù)=(該免疫器官鮮重/

宰前活重)×100。

1.4.6 免疫器官組織結(jié)構(gòu)

切取脾臟及法氏囊組織固定于多聚甲醛溶液,并經(jīng)脫水、包埋后制備切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;利用線性和二次方程擬合博落回散添加量(0～80 mg/kg)的影響。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 博落回散對番鴨生長性能的影響

由表3可知,隨著博落回散添加量的增加,番鴨的56日齡體重、平均日增重呈一次線性增加(P<0.001)。T3組番鴨56日齡體重、平均日增重較CON組顯著升高(P<0.05),且與ANT組無顯著差異(P>0.05)。飼糧中添加博落回散對番鴨平均日采食量和料重比無顯著影響(P>0.05)。上述結(jié)果表明,飼糧中添加40 mg/kg博落回散可顯著提高番鴨平均日增重。

2.2 博落回散對番鴨肉品質(zhì)的影響

由表4可知,隨博落回散添加量的增加,番鴨滴水損失(P<0.001)、蒸煮損失(P=0.030)呈二次曲線變化。T3組胸肌滴水損失、蒸煮損失顯著低于CON組(P<0.05),且蒸煮損失還顯著低于ANT組(P<0.05)。飼糧中添加博落回散對番鴨胸肌肉色(L*值、a*值、b*值)和pH24 h無顯著影響(P>0.05)。上述結(jié)果表明,飼糧中添加40 mg/kg的博落回散可顯著降低番鴨胸肌滴水損失和蒸煮損失,提高胸肌的持水能力。

2.3 博落回散對番鴨血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知,隨博落回散添加量的增加,番鴨血清T-AOC(P=0.009)、SOD(P=0.002)與GSH-Px活性(P=0.002)及MDA含量(P<0.001)呈二次曲線變化。與CON相比,T1、T2和T3組血清T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性均不同程度提高,MDA含量均有不同程度降低,其中T3組血清T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性較CON組顯著提高(P<0.05),MDA含量較CON組顯著降低(P<0.05);除T-SOD活性外,T3組血清其他抗氧化指標(biāo)與ANT組無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明,飼糧中添加40 mg/kg博落回散可提高番鴨的抗氧化能力。

2.4 博落回散對番鴨免疫器官指數(shù)的影響

由表6可知,隨博落回散添加量的增加,脾臟指數(shù)(P=0.031)和法氏囊指數(shù)(P=0.006)呈二次曲線變化。T2和T3組脾臟指數(shù)顯著高于CON組(P<0.05),且與ANT組無顯著差異(P>0.05)。

2.5 博落回散對番鴨免疫器官組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示,各組番鴨脾臟結(jié)構(gòu)正常,紅髓和白髓界限清楚,結(jié)構(gòu)完整;脾小結(jié)結(jié)構(gòu)清晰,邊界清楚;脾小結(jié)及動脈周圍淋巴鞘內(nèi)淋巴細(xì)胞形態(tài)正常且排列緊密有序。與CON組相比,T2和T3組番鴨脾臟脾小結(jié)直徑增大,動脈周圍淋巴鞘增厚,內(nèi)部淋巴細(xì)胞排列更加密集,但與ANT組無明顯差異。上述結(jié)果表明,飼糧中添加20～40 mg/kg博落回散可有效促進(jìn)番鴨脾臟發(fā)育。如圖2所示,各組番鴨法氏囊發(fā)育良好,黏膜皺襞內(nèi)淋巴濾泡排列整齊,淋巴濾泡中皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰。與CON組相比,T2、T3組法氏囊中的淋巴濾泡數(shù)明顯增加,淋巴濾泡排列更加緊密,皮質(zhì)層厚度增加,但與ANT組無明顯差異。

2.6 博落回散對番鴨回腸黏膜中促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

由表7可知,番鴨回腸黏膜中IL-2(線性P<0.001;二次P=0.024)、IL-6(線性P=0.039;二次P<0.001)、TNF-αmRNA相對表達(dá)量(線性P=0.005;二次P=0.001)隨博落回散添加量的增加呈一次線性降低或二次曲線變化,其中T2和T3組回腸黏膜中IL-2、IL-6、TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著低于CON組(P<0.05)。上述結(jié)果表明,飼糧中添加20～40 mg/kg博落回散可顯著降低回腸黏膜中促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-6和TNF-α基因的表達(dá)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加博落回散對番鴨生長性能的影響

博落回的主要活性物質(zhì)為血根堿和白屈菜紅堿等異喹啉類生物堿,可通過提高抗氧化、抗炎、抑菌起到促生長的效果[9-10]。李長虹等[11]報(bào)道,博落回散可顯著提高肉鴨的平均日采食量。劉夢婷等[12]發(fā)現(xiàn),飼糧中添加推薦劑量的博落回散能顯著促進(jìn)肉雞1～21日齡的平均日增重、平均日采食量,并顯著降低其料重比。Liu等[13]報(bào)道,博落回提取物中的活性成分血根堿可顯著增加1～28日齡肉雞的平均日增重和平均日采食量,顯著降低肉雞的料重比,但對1～56日齡肉雞的生長性能無顯著影響,說明博落回散對肉雞生長性能的作用受日齡影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼糧中添加40 mg/kg博落回散可顯著提高番鴨的平均日增重,與上述前人的結(jié)果基本一致,其原因可能是博落回散提高了番鴨機(jī)體的抗氧化能力和免疫水平,降低了機(jī)體炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),從而使機(jī)體處于一個相對健康的狀態(tài),更有利于生長;同時,本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)博落回散有促進(jìn)番鴨平均日采食量提高的趨勢,推測與博落回散中的血根堿可降低腸道芳香氨基酸的脫羧作用,通過調(diào)節(jié)腸道pH和通過色氨酸(Trp)-5-羥色胺(5-HT)途徑來增加飼糧攝入量相關(guān)[13-14]。但是,本試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)博落回散能顯著影響番鴨的料重比,與前人研究結(jié)果不一致的原因可能與試驗(yàn)動物品種、試驗(yàn)條件及養(yǎng)殖周期等諸多因素有關(guān),有待進(jìn)一步探究。

表3 博落回散對番鴨生長性能的影響

表4 博落回散對番鴨肉品質(zhì)的影響

A:小動脈; RP:紅髓; SN:脾小結(jié); PALS: 動脈周圍淋巴鞘。

★:皮質(zhì);▲:髓質(zhì);←:中間層上皮網(wǎng)狀細(xì)胞。

3.2 飼糧中添加博落回散對番鴨血清抗氧化指標(biāo)的影響

動物機(jī)體在日?；顒又袝a(chǎn)生大量的氧自由基,體內(nèi)相應(yīng)地有一套抗氧化系統(tǒng),可以清除自由基。當(dāng)氧化和抗氧化處于平衡狀態(tài)時,機(jī)體則處于一個健康狀態(tài),體內(nèi)低水平的活性氧還能作為信號傳遞分子,促進(jìn)機(jī)體基因轉(zhuǎn)錄以及組織的生長發(fā)育;當(dāng)機(jī)體抗氧化水平不夠或者產(chǎn)生過多氧自由基時,則平衡被打破,機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過度的氧化應(yīng)激往往伴隨著炎癥,影響動物的生長。血根堿能有效地清除自由基,保護(hù)脂質(zhì)和DNA的完整[15]。黃亞明等[16]發(fā)現(xiàn),博落回可顯著增加羅非魚肝臟CAT和T-SOD活性。邱全優(yōu)等[17]發(fā)現(xiàn),母源性博落回提取物能顯著提高發(fā)育遲緩的斷奶仔豬血清T-SOD和GSH-Px活性,降低血清MDA含量。鄒朋[5]發(fā)現(xiàn),博落回提取物可顯著提高蛋雞肝臟中CAT、GSH-Px、T-SOD等抗氧化酶的活性及mRNA相對量。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究報(bào)道基本一致,飼糧中添加40 mg/kg博落回散顯著提高了番鴨血清T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性,顯著降低了血清MDA含量。

表7 博落回散對番鴨回腸黏膜促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

3.3 飼糧中添加博落回散對番鴨肉品質(zhì)的影響

較高的持水能力可維持肌肉的嫩度,滴水損失和蒸煮損失是反映肌肉持水能力的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加博落回可不同程度降低肉雞肌肉的滴水損失和失水率[18],飼糧中添加博落回散可降低育肥豬肌肉的滴水損失和失水率[19]。王波等[20]報(bào)道,肌肉的滴水損失與機(jī)體抗氧化能力呈正相關(guān)。大量的氧化反應(yīng)易造成肌肉pH升高,進(jìn)而蛋白質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn),降低其靜電作用,產(chǎn)生肌肉的凝集效應(yīng),肌纖維收縮,空間中的水分被擠壓,水分流失加速。此外,氧化損傷、環(huán)境改變等其他因素造成細(xì)胞磷脂雙分子層的破壞也會導(dǎo)致細(xì)胞水分的流失。本研究中,飼糧中添加40 mg/kg博落回散顯著降低了番鴨胸肌滴水損失和蒸煮損失,這可能與博落回散顯著改善了機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

3.4 飼糧中添加博落回散對番鴨免疫器官指數(shù)和組織結(jié)構(gòu)的影響

家禽最主要的免疫器官有胸腺、脾臟和法氏囊。胸腺和法氏囊是家禽的中樞免疫器官,是機(jī)體T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化和成熟的主要場所;脾臟是機(jī)體最大的外周淋巴免疫器官,也是淋巴細(xì)胞定居和對抗原刺激進(jìn)行免疫應(yīng)答的場所[21]。免疫器官指數(shù)的增加通常代表免疫器官發(fā)育良好且有更多免疫細(xì)胞的聚集,從而提升機(jī)體的免疫機(jī)能[22],因此,一般認(rèn)為免疫器官指數(shù)可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[23]。研究發(fā)現(xiàn),博落回及其提取物可提高的動物的免疫器官指數(shù),顯著提高機(jī)體免疫機(jī)能。例如,王曼等[24]發(fā)現(xiàn),博落回提取物可顯著提高蛋雛雞的法氏囊指數(shù),并有提高脾臟指數(shù)的趨勢;祝凱[25]發(fā)現(xiàn)博落回提取物可提高6周齡蛋雞的法氏囊指數(shù)和12周齡蛋雞的胸腺指數(shù)。本試驗(yàn)中,飼糧中添加博落回散顯著提高了番鴨的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù),表明博落回散對脾臟和法氏囊的免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用。一般認(rèn)為,動物免疫器官重量的增加是由其自身細(xì)胞生長發(fā)育和分裂增殖所致,進(jìn)一步對脾臟和法氏囊組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)飼糧中添加20或40 mg/kg博落回散可促進(jìn)番鴨脾臟和法氏囊的發(fā)育。脾小結(jié)和動脈周圍淋巴鞘存在著大量淋巴細(xì)胞,脾小結(jié)和動脈周圍淋巴鞘的大小可反應(yīng)脾臟的發(fā)育情況[26]。歐淑琦等[27]研究發(fā)現(xiàn),博落回中的活性成分血根堿可有效增加肉雞脾小結(jié)直徑和動脈周圍淋巴鞘面積。本試驗(yàn)中,飼糧中添加20或40 mg/kg博落回散增加了番鴨脾小結(jié)直徑和動脈周圍淋巴鞘面積,與前人研究結(jié)果一致。法氏囊淋巴濾泡的大小、數(shù)量及排列緊密程度均與番鴨機(jī)體的免疫功能相關(guān)[26]。法氏囊小結(jié)結(jié)構(gòu)排列緊密可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞輸出,使法氏囊的免疫功能提高。本試驗(yàn)中,飼糧中添加20或40 mg/kg博落回散可改善法氏囊小結(jié)結(jié)構(gòu)排列,增加了法氏囊淋巴濾泡數(shù)量,表明博落回可促進(jìn)番鴨法氏囊發(fā)育,提高番鴨法氏囊的免疫應(yīng)答能力。

3.5 飼糧中添加博落回散對回腸黏膜促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對抗外界病原體等因素造成組織損傷所進(jìn)行的一個正常生理反應(yīng),促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等的含量可反映機(jī)體炎癥水平[28]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)控因子[29],可有效調(diào)控IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。研究顯示,博落回中的活性成分白屈菜紅堿可通過影響CC趨化因子配體-2(CCL-2)、IL-6基因的表達(dá)來對抗炎癥[30]。鄒朋[5]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加博落回提取物可顯著降低蛋雞腸道組織中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-6、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、干擾素-γ(IFN-γ)等促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平,同時發(fā)現(xiàn)腸道NF-κB的轉(zhuǎn)錄水平相應(yīng)降低。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼糧中添加博落回散可顯著降低番鴨回腸黏膜中促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-αmRNA的相對表達(dá)量,推測可能是基于腸道炎癥調(diào)控NF-κB表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其降低回腸黏膜炎癥水平的作用。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下,飼糧中添加40 mg/kg博落回散可提高番鴨的生長性能和肉品質(zhì),促進(jìn)脾臟和法氏囊發(fā)育,改善機(jī)體免疫性能和抗氧化能力。