蘇燕燕 楊 翀 張宗祥 葉 宇 應佳可

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的癌癥之一，約占全球新癌癥病例的10%，病死率約為50%，嚴重威脅人類健康[1]。近年來，免疫檢查點抑制劑治療惡性腫瘤在臨床上展現(xiàn)出了不錯的療效和巨大的前景。靶向程序性細胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）的免疫檢查點抑制劑已被用于具有DNA 錯配修復缺陷及高水平的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的CRC 患者，但腫瘤中存在的多種免疫抑制嚴重限制了其治療效果[2]。聯(lián)合應用具有免疫抑制微環(huán)境調(diào)節(jié)功能的藥物有望提高免疫檢查點抑制劑在CRC 中的療效。瑞戈非尼（Regorafenib，Reg）作為CRC 多激酶小分子抑制劑，具有和PD-1 抗體（PD-1 antibody，anti-PD-1）聯(lián)合應用的可能性，但其療效以及作用機制鮮有報道。因此，本研究主要探討Reg 對anti-PD-1 在CRC 中療效的影響及機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 SPF 級雄性BALB/c 小鼠（8 周齡）24 只，體質(zhì)量（27±3）g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2019-0011。在溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%，12 h 光照系統(tǒng)下進行飼養(yǎng)，自由進食和飲水。本研究動物實驗已通過浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會批準，倫理批號：ZJCLAIACUC-20010174。

小鼠結(jié)腸癌細胞CT26（批號：CL-0071）購自普諾賽生命科技有限公司（武漢），使用RPMI-1640 培養(yǎng)基（10% FBS、1%P/S）進行培養(yǎng)，細胞置于37 ℃、5% CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 試 劑 Reg（批號HY-10331）、抗小鼠PD-1抗體（批號HY-132192）購自MedChemExpress（New Jersey）公司，巨噬細胞集落刺激因子1 受體（CSF1-R）抗體（批號ab254357）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，磷酸化巨噬細胞集落刺激因子1 受體（p-CSF1-R） 抗體（批號3155S） 購自Cell Signaling Technology（Boston）公司，成熟小鼠巨噬細胞標志物F4/80（批號MF48000）、巨噬細胞甘露糖受體CD206（批號17-2061-82）、重組人分化抗原80 CD80（批號12-0801-82）抗體購自Thermo Fisher Scientific（Massachusetts）公司、本實驗所需引物都由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列詳見表1。Evo M -MLV RT Premix for qPCR（批號AG11706）購于艾科瑞生物科技（淄博）有限公司，HieffqPCR SYBRGreen Master Mix（No Rox）（批號11201ES08）購于翊圣生物科技（上海）有限公司。

1.3 結(jié)腸癌移植瘤模型構(gòu)建及分組 取對數(shù)生長期的CT26 小鼠結(jié)腸癌細胞，制成1×107/mL 單細胞懸液，取0.2 mL 細胞懸液接種于BALB/c 小鼠右側(cè)腋下，7 d 后觀察小鼠腋下成瘤情況，注射部位出現(xiàn)質(zhì)感堅韌的球形團塊即為成瘤成功。將成瘤后的小鼠采用隨機數(shù)字表法分為4 組：CT26 組、CT26+Reg組、CT26+anti-PD-1 組和CT26+Reg+anti-PD-1 組，每組6 只。CT26+Reg 組：每只小鼠給予10 mg/（kg·d）Reg，灌胃，持續(xù)2 周；CT26+anti-PD-1 組：每只小鼠給200 μg 抗小鼠PD-1 抗體，腹腔給藥，每周1 次；CT26+Reg+anti-PD-1 組：每只小鼠給10 mg/（kg·d）Reg，灌胃，持續(xù)2 周，同時給200 μg 抗小鼠PD-1 抗體，腹腔給藥，每周1 次；CT26 組根據(jù)小鼠體質(zhì)量，分別每天灌胃等量生理鹽水、每周1 次腹腔注射等量生理鹽水。2 周后脫頸處死小鼠，解剖取皮下瘤，稱重后進行后續(xù)實驗。用卡尺測量瘤徑，按公式a×b2/2（a 為腫瘤的長徑，b 為腫瘤的短徑），計算瘤體平均體積（mm3）。

1.4 免疫組織化學檢測 取腫瘤組織石蠟切片，60 ℃恒溫烤箱中烤片60 min，梯度脫蠟后蒸餾水浸泡5 min，PBS 清洗3 次；用3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。使用檸檬酸緩沖液進行熱修復。使用1% BSA 室溫封閉30 min；p-CSF1-R 一抗4 ℃孵育過夜。洗滌后加入通用型二抗，37 ℃孵育1 h；DAB 顯色，同時鏡下觀察，自來水浸泡10～15 min。蘇木素復染，同時顯微鏡下觀察樣品細胞核著色變化。將蘇木素復染后的組織切片置于1%鹽酸乙醇分化液分化3～5 s，自來水沖洗20 min后脫水透明，梯度脫水后封片，風干后顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5 流式細胞術(shù)分選 取腫瘤組織，用剪刀剪碎后加入組織消化液中（膠原酶Ⅳ（0.0025 g）、脫氧核糖核酸酶I DNaseI（1 mg）溶解于50 mL 1640 培養(yǎng)基），于37 ℃搖床中震蕩1 h。完成后，使用70 μm 濾網(wǎng)過濾，收集單細胞懸液。300×g 離心5 min 后收集細胞沉淀。固定通透后進行流式細胞術(shù)分析。使用F4/80、CD206、CD86 抗體標記腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）并區(qū)分M1、M2 表型。

1.6 巨噬細胞誘導極化 提取的BMDMs 細胞分為M1 組、M1+Reg 組、M2 組、M2+Reg 組進行培養(yǎng)，干預方法[4]為：用Reg 預處理1 h，然后分別用IFN-γ+脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導M1 型巨噬細胞，白介素-4（interleukin-4，IL-4）誘導M2 型巨噬細胞，誘導24 h。

1.7 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（qRTPCR） 利用Trizol 試劑提取巨噬細胞RNA，-80 ℃保存。使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后用熒光DNA 結(jié)合染料（SYBR Green Master）配置實時熒光定量PCR 體系，應用Realtime PCR 儀進行對目的基因?qū)崟r定量檢測。

1.8 小鼠骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的提取 取小鼠完整的股骨和脛骨，浸入含有1%青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，用剪刀剪斷股骨、脛骨的兩端，并用吸滿骨髓來源巨噬細胞培養(yǎng)基的1 mL 注射器沖出骨髓，并收集在小皿中反復吹吸直至將骨髓吹散，制備骨髓源性細胞（bone marrow derived cells，BMs）。將BMs 用巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（20 ng/mL）誘導形成BMDMs。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot） 使用RIPA裂解液提取腫瘤組織或巨噬細胞總蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，然后在室溫下用含有Tween-20 的Tris 緩沖鹽水（TBST）中的5%脫脂奶粉封閉2 h。然后將膜與單克隆抗體4 ℃孵育過夜，用TBST 洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗一起孵育。使用增強的化學發(fā)光試劑盒使免疫印跡可視化。

1.10 統(tǒng)計學方法 應用Graphpad prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)表示為平均值（average，AVG）±標準差（Standard deviation，SD），兩組之間比較采用t 檢驗，使用雙向ANOVA 分析不同組間數(shù)據(jù)差異，P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Reg 對anti-PD-1 在CRC 中的影響 接種CT26 細胞于BALB/c 小鼠，建立結(jié)直腸癌移植瘤模型，并進行藥物治療，給藥后觀察荷瘤小鼠移植瘤的生長情況，并記錄荷瘤小鼠移植瘤的體積、質(zhì)量。結(jié)果顯示，與CT26 組移植瘤小鼠比較，藥物處理使得腫瘤體積和質(zhì)量均顯著減?。ㄒ妶D1）。與單獨使用Reg 或者anti-PD-1 比較，Reg 和anti-PD-1 聯(lián)合用藥使移植瘤的體積和質(zhì)量進一步減小（見表2）。

圖1 小鼠CRC 移植瘤模型構(gòu)建后各組腫瘤組織圖

表2 四組小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量比較（±s）

表2 四組小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量比較（±s）

注：CT26 為小鼠結(jié)腸癌細胞；CT26+Reg 組每只小鼠給10 mg/（kg·d），灌胃，持續(xù)2 周；CT26+anti-PD-1 組每只小鼠給200 μg 抗小鼠PD-1抗體，腹腔給藥，每周1 次；CT26+Reg+anti-PD-1 組每只小鼠給10 mg/（kg·d），灌胃，持續(xù)2 周，同時給200 μg 抗小鼠PD-1 抗體，腹腔給藥，每周1 次；CT26 組根據(jù)小鼠體質(zhì)量，分別每天灌胃等量生理鹽水、每周1 次腹腔注射等量生理鹽水；與CT26 組比較，aP＜0.05；與CT26+Reg 組和CT26+anti-PD-1 組比較，bP＜0.05

組別CT26 組CT26+Reg 組CT26+anti-PD-1 組CT26+Reg+anti-PD-1 組鼠數(shù)6 6 6 6腫瘤體積（mm3）1451.00±43.10 1174.33±56.84a 1221.00±42.42a 949.50±15.92b腫瘤質(zhì)量（g）3.04±0.06 2.32±0.08a 2.40±0.10a 1.73±0.08b

2.2 Reg 對瘤內(nèi)CSF1-R 信號通路的影響 為了研究Reg 對瘤內(nèi)CSF1-R 信號通路的影響，提取腫瘤組織蛋白，Western Blot 檢測腫瘤組織中CSF1-R 信號通路相關(guān)蛋白p-CSF1-R 和CSF1-R 的表達，結(jié)果顯示，相較于CT26 組，CT26+Reg 組瘤內(nèi)p-CSF1-R蛋白表達水平降低；相較于單獨用藥組，CT26+Reg+anti-PD-1 組p-CSF1-R 水平顯著降低，而各組間CSF1-R 水平無顯著性差異（見圖2A）。對腫瘤組織切片進行免疫組織化學染色（p-CSF1-R），結(jié)果表明，Reg 處理使得p-CSF1-R 表達顯著下調(diào)，而與anti-PD-1 聯(lián)合用藥后，p-CSF1-R 表達水平進一步下調(diào)（見圖2B）。

圖2 Reg 對瘤內(nèi)CSF1-R 信號通路的影響

2.3 Reg 對瘤內(nèi)巨噬細胞的影響 為了研究Reg 對瘤內(nèi)M1、M2 型巨噬細胞的影響，取部分腫瘤組織單細胞懸液進行流式檢測，使用F4/80、CD206、CD80抗體標記TAMs 并區(qū)分M1、M2 表型。結(jié)果表明，Reg處理，M2 型巨噬細胞（F4/80、CD206 陽性）比例顯著下降，M1 型巨噬細胞（F4/80、CD80 陽性）比例顯著增加（見圖3），并且與anti-PD-1 聯(lián)合用藥后，這種變化更顯著（見表3）。

圖3 Reg 對瘤內(nèi)M1、M2 型巨噬細胞的影響

表3 四組M1、M2 型巨噬細胞百分比（流式細胞術(shù)）比較（%，±s）

表3 四組M1、M2 型巨噬細胞百分比（流式細胞術(shù)）比較（%，±s）

注：CT26+Reg 組每只小鼠給10 mg/（kg·d），灌胃，持續(xù)2 周；CT26+anti-PD-1 組每只小鼠給200 μg 抗小鼠PD-1 抗體，腹腔給藥，每周1 次；CT26+Reg+anti-PD-1 組每只小鼠給10 mg/（kg·d），灌胃，持續(xù)2周，同時給200μg 抗小鼠PD-1 抗體，腹腔給藥，每周1 次；CT26 組根據(jù)小鼠體質(zhì)量，每天灌胃等量生理鹽水、每周1 次腹腔注射等量生理鹽水；流式細胞術(shù)檢測M1、M2 型巨噬細胞比例，與CT26 組比較，aP＜0.05；與CT26+Reg 組和CT26+anti-PD-1 組比較，bP＜0.05

組別CT26 組CT26+Reg 組CT26+anti-PD-1 組CT26+Reg+anti-PD-1 組孔數(shù)6 6 6 6 M1 型巨噬細胞5.50±0.96 12.50±1.71a 8.00±0.82a 19.00±2.00b M2 型巨噬細胞35.33±2.21 21.33±2.36a 28.67±1.89a 13.67±1.80b

2.4 Reg 對腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化的影響 提取的BMDMs 細胞分為M1 組、M1+Reg 組、M2 組、M2+Reg組進行培養(yǎng)，提取細胞RNA，進行qRT-PCR 檢測。結(jié)果表明，Reg 處理后，下調(diào)了M2 型巨噬細胞極化（Arg1，CD206，CD163）（見表4），增加了M1 型巨噬細胞極化（IL-23，IL-12，CD86）（見表5），表明Reg能調(diào)節(jié)TAMs 極化方向。

表4 兩組M2 型巨噬細胞極化指標檢測（mRNA）比較（±s）

表4 兩組M2 型巨噬細胞極化指標檢測（mRNA）比較（±s）

注：Arg1 為精氨酸酶1；CD206 為巨噬細胞甘露糖受體；CD163 為受體蛋白；與M2 組比較，aP＜0.05

組別M2 組M2+Reg 組孔數(shù)6 6 Arg1 1.00±0.09 0.57±0.04a CD206 1.00±0.15 0.73±0.08a CD163 1.00±0.20 0.81±0.07a

表5 兩組M1 型巨噬細胞極化指標檢測（mRNA）比較（±s）

表5 兩組M1 型巨噬細胞極化指標檢測（mRNA）比較（±s）

注：IL-23 為白細胞介素-23；IL-12 為白細胞介素-12；CD86 為白細胞分化抗原86；與M1 組比較，aP＜0.05

組別M2 組M2+Reg 組孔數(shù)6 6 IL-23 1.00±0.05 1.98±0.08a IL-12 1.00±0.10 3.10±0.12a CD86 1.00±0.10 2.56±0.13a

2.5 Reg 與CSF1-R 信號通路對腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化的影響 將誘導極化得到的M2 型巨噬細胞分為M2 組、M2+Reg 組進行培養(yǎng)，提取細胞總蛋白，通過Western blot 檢測Reg 對M2 型巨噬細胞表面CSF1-R 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果表明，Reg 處理使M2 型巨噬細胞表面CSF1-R 磷酸化水平顯著下調(diào)（見圖5），提示Reg 通過抑制p-CSF1-R表達，調(diào)控CSF1-R 通路進而調(diào)節(jié)TAMs 極化。

圖5 Reg 通過CSF1-R 信號通路調(diào)節(jié)TAMs 極化

3 討 論

靶向PD-1 的治療性抗體在CRC 治療中取得了重大突破。然而，僅有少部分微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stabilization，MSS）患者的抗PD-1 免疫治療有效果，大多數(shù)MSS 病例不響應基于抗PD-1 的免疫療法。因此聯(lián)合治療將成為克服這一限制的理想戰(zhàn)略[5]。生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展使人類對癌細胞和免疫系統(tǒng)之間復雜的相互作用有了更好的認識，導致新的免疫療法的產(chǎn)生。Reg 是應用于晚期轉(zhuǎn)移性的CRC 的小分子抑制劑，能夠靶向細胞中參與細胞正常功能和病理過程的多種激酶，抑制腫瘤發(fā)生、腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。作為一種多目標激酶抑制劑，Reg 可通過改善腫瘤微環(huán)境，用于治療轉(zhuǎn)移性CRC[7]，提示Reg 具有和anti-PD-1 聯(lián)合應用的希望。本研究結(jié)果證實，在CT26 移植瘤小鼠中，Reg 和anti-PD-1 單獨用藥都能對CRC 產(chǎn)生療效，但Reg 和anti-PD-1 聯(lián)合用藥后對CRC 產(chǎn)生的療效更為顯著，這反映在藥物治療后移植瘤的體積和質(zhì)量都顯著降低。

TAMs 是腫瘤免疫微環(huán)境中重要的組成部分，也是腫瘤抗免疫應答中的主要參與者，能夠促進瘤內(nèi)血管新生，腫瘤細胞的局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移，并且與多種腫瘤的預后相關(guān)[8-9]。M2 型巨噬細胞在腫瘤組織中的生長分化高度依賴巨噬細胞集落刺激因子-1/巨噬細胞集落刺激因子-1 受體（colony-stimulating factor 1，CSF1/CSF1 receptor，CSF1-R）信號通路。通過阻斷CSF1-R 信號能夠選擇性抑制腫瘤組織中M2 型巨噬細胞，而對M1 型巨噬細胞影響較小[10]。通過CSF1-R 信號阻斷有望通過抑制M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細胞改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，進而提高免疫檢查點抑制劑在惡性腫瘤中的療效[11]。本研究結(jié)果顯示，Reg 能影響瘤內(nèi)CSF1-R 信號通路，Reg 和anti-PD-1 聯(lián)合用藥后顯著下調(diào)瘤內(nèi)p-CSF1-R 的表達，并且Reg 處理能有效減少小鼠CRC 移植瘤內(nèi)M2 型巨噬細胞的比例。

研究表明，有多種方法能影響anti-PD-1 在CRC 中的療效，如低劑量地西他濱可通過重新調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強anti-PD-1 在CRC 中的作用[11]；具核梭桿菌能增強anti-PD-1 對CRC 小鼠的抗腫瘤作用，并延長了生存期，將具核梭桿菌與免疫治療相結(jié)合，可增強anti-PD-1 的治療效果[12]；白介素17A 可通過p65/NRF1/miR-15b-5p 軸增加anti-PD-1 的表達，提高anti-PD-1 治療在CRC 小鼠模型中的療效[13]。而在本研究中，Reg 可通過有效抑制巨噬細胞中CSF1-R 的磷酸化水平，對TAMs 極化產(chǎn)生影響，下調(diào)M2 型巨噬細胞極化，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，同時證實了Reg 能夠有效增強anti-PD-1 在荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性，協(xié)同抑制小鼠皮下瘤的生長。

綜上，本研究通過CRC 移植瘤小鼠模型發(fā)現(xiàn)，Reg 可通過CSF1-R 信號通路調(diào)控TAMs，增強anti-PD-1 在CRC 中的療效。本研究明確了Reg 對TAMs的作用效果及信號分子機制，驗證了聯(lián)合應用anti-PD-1 和Reg 在CRC 小鼠模型中的治療效果及協(xié)同機制，為其臨床應用提供了理論參考。