竺東杰 鄒 杰 余史丹 陳 瀟 李紅霞

腎癌是較常見的泌尿系惡性腫瘤，每年新確診病例超過40 萬，由于早期癥狀不典型致使約30%的患者確診時已發(fā)展為中晚期[1-2]。目前，化療仍是臨床治療中晚期腎癌的首選方案，但化療藥物副作用廣泛且易誘發(fā)癌細胞耐藥，是導致患者不能耐受和療效不佳的主要原因[3]。腎癌屬中醫(yī)學“腰痛”“血尿”“積聚”等范疇，其病機在于虛實夾雜、正氣不足、陰陽氣血逆亂[4]。葛根具有解肌退熱、升陽止瀉、通經(jīng)活絡、透疹等功效。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，研究證實，葛根素通過誘導細胞凋亡對非小細胞肺癌[5]、前列腺癌[6]、甲狀腺癌[7]等具有抑制作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信號通路對腫瘤細胞凋亡具有重要調(diào)控作用[8]。本實驗以人腎癌786-O 細胞為受試細胞，研究葛根素對腎癌細胞凋亡的影響，并基于PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路探討其機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細 胞 人腎癌786-O 細胞株購自中國科學院典型培養(yǎng)物保存委員會細胞庫（批號SCSP-5059）。

1.2 藥物與試劑 葛根素、胰蛋白酶消化液、CCK-8試劑盒、ECL 發(fā)光液（上海葉源生物科技有限公司，批號S20446、R40001、R22305、R30199）；PI3K 抑制劑LY294002（美國Sigma 公司，批號L9762）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號2022G0609007）；鏈青霉素雙抗、胎牛血清（美國Gibco 公司，批號15237-109、24118-031）；Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒（北京索萊寶生物科技公司，批號CA1020）；PI3K、磷酸化PI3K（Tyr317）[p-PI3K（Tyr317）]、Akt、磷酸化Akt（Ser473）[p-Akt（Ser473）]、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（Ser21）[p-GSK-3β（Ser21）]、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）和IgG 二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bs-2067R、bs-5570R、bs-6951R、bs -0876R、bs -0023R、bs -5368R、bs -5241R、bs -0081R、bs-20352R、bs-4564R、bs-0294P）。

1.3 主要儀器 240i CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；MR4100 型酶標儀（美國Dynatech 公司）；E1100 型電泳儀、Tetra 型轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；CyFlow Counter 型流式細胞儀（德國Partec 公司）；B30142 型低溫高速離心機（美國Beckman 公司）。

1.4 細胞培養(yǎng)、分組與給藥 復蘇后的人腎癌786-O 細胞株以RPMI1640 培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清和1%鏈青霉素雙抗）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞融合至約85%時，按1∶3 傳代培養(yǎng)。取第4代對數(shù)生長期786-O 細胞，給予DMSO（空白對照組）、終濃度10、20、40 mg/L 的葛根素溶液[9]和終濃度15 mg/L 的LY294002 溶液[10]。LY294002 為PI3K 特異性抑制劑，設置LY294002 組以對照分析PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路在葛根素誘導786-O 細胞凋亡中的作用。

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率 藥物干預48 h后，經(jīng)胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×104個/L，按100 μL/孔轉(zhuǎn)移至96 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，按10 μL/孔加10% CCK-8 溶液后培養(yǎng)2 h，胰蛋白酶消化后離心收集細胞，按照CCK-8 試劑盒操作說明，通過酶標儀檢測吸光度值（A450 nm）并計算細胞增殖抑制率[（1-藥物組A450 nm/空白對照組A450 nm）×100%]。獨立重復3 次實驗。

1.6 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率 藥物干預48 h 后，應用不含乙二胺四乙酸二鈉的胰蛋白酶進行消化，離心取細胞，按試劑盒說明，195 μL/孔加入結(jié)合液制備單細胞懸液，依次5 μL/孔加入AnnexinV-FITC 染色液和10 μL/孔加入PI 染色液，輕輕混勻后37 ℃避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。獨立重復3 次實驗。

1.7 Western blot 法檢測蛋白表達 藥物干預48 h后，應用胰蛋白酶消化，離心取細胞，加入RIPA 裂解液，冰上靜置30 min 后4 ℃、12000 r/min 離心（離心半徑8 cm）30 min 提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度并配平后，以30 μg 蛋白量上樣，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜、5%血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗稀釋液PI3K（1∶1000）、p-PI3K（Tyr317）（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（Ser473）（1∶1000）、GSK-3β（1∶800）、p-GSK-3β（Ser21）（1∶800）、Caspase-9（1∶1000）、Cleaved Caspase-3（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、βactin（1∶2000）4 ℃孵育過夜，洗膜后IgG 二抗稀釋液（1∶3000）室溫孵育1 h，洗膜后ECL 顯色，通過ImageProPlus 軟件分析條帶灰度值，然后以β-actin 為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。獨立重復3 次實驗。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料經(jīng)檢驗均符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標準差（±s） 描述，多組間比較采用單因素χ2分析，方差齊用LSD-t 檢驗進行兩兩比較，方差不齊用Dunnett's T3 檢驗進行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 葛根素對人腎癌786-O 細胞增殖抑制率的影響 與空白對照組比較，葛根素10、20、40 mg/L 組和LY294002 15 mg/L 組786-O 細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.01）；葛根素40 mg/L 組細胞增殖抑制率顯著高于LY294002 15 mg/L 組（P＜0.05）。見表1。

表1 葛根素對人腎癌786-O 細胞增殖抑制率和凋亡率的影響（%，±s）

表1 葛根素對人腎癌786-O 細胞增殖抑制率和凋亡率的影響（%，±s）

注：LY294002 為磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑；與空白對照組比較，aP＜0.01；與LY294002 15 mg/L 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別空白對照組葛根素10 mg/L 組葛根素20 mg/L 組葛根素40 mg/L 組LY294002 15 mg/L 組F 值P 值實驗次數(shù)3 3 3 3 3細胞增殖抑制率3.47±0.53 17.04±2.92a 26.48±4.77a 42.79±6.81ab 35.73±6.12a 63.762＜0.001細胞凋亡率2.64±0.51 13.72±2.38a 30.41±4.05a 55.39±6.72ac 36.08±4.32a 117.935＜0.001

2.2 葛根素對人腎癌786-O 細胞凋亡的影響 與空白對照組比較，葛根素10、20、40 mg/L 組和LY294002 15 mg/L 組786-O 細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；葛根素40 mg/L 組細胞凋亡率顯著高于LY294002 15 mg/L 組（P＜0.01）。見圖1、表1。

圖1 葛根素對人腎癌786-O 細胞凋亡的影響

2.3 葛根素對人腎癌786-O 細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路蛋白表達的影響 與空白對照組比較，葛根素20、40 mg/L 組和LY294002 15 mg/L 組786-O細胞p-PI3K（Tyr317）、p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser21）相對表達量顯著降低（P＜0.01），PI3K、Akt、GSK-3β 相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），p-PI3K（Tyr317）/PI3K、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK-3β（Ser21）/GSK-3β 比值顯著降低（P＜0.01）。而葛根素40 mg/L 組與LY294002 15 mg/L 組比較，各指標間差異均無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

表2 葛根素對人腎癌786-O 細胞PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路蛋白相對表達量的影響（±s）

表2 葛根素對人腎癌786-O 細胞PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路蛋白相對表達量的影響（±s）

注：PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K（Tyr317）為Tyr317 位點磷酸化PI3K；Akt 為蛋白激酶B；p-Akt（Ser473）為Ser473 位點磷酸化Akt；GSK-3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK-3β（Ser21）為Ser21 位點磷酸化GSK-3β；LY294002 為PI3K 抑制劑；與空白對照組比較，aP＜0.01

組別空白對照組葛根素10 mg/L 組葛根素20 mg/L 組葛根素40 mg/L 組LY294002 15 mg/L 組F 值P 值實驗次數(shù)3 3 3 3 3 PI3K 1.12±0.27 1.09±0.29 1.06±0.25 1.10±0.28 1.08±0.29 0.065 0.992 p-PI3K（Tyr317）1.03±0.24 0.89±0.22 0.58±0.13a 0.32±0.07a 0.38±0.08a 36.159＜0.001 p-PI3K（Tyr317）/PI3K 0.92±0.28 0.81±0.24 0.55±0.15a 0.29±0.08a 0.34±0.09a 22.477＜0.001 Akt 0.96±0.22 0.95±0.24 1.03±0.24 1.01±0.25 0.97±0.23 0.211 0.931 p-Akt（Ser473）0.51±0.12 0.43±0.09 0.25±0.06a 0.09±0.03a 0.11±0.03a 43.297＜0.001組別空白對照組葛根素10 mg/L 組葛根素20 mg/L 組葛根素40 mg/L 組LY294002 15 mg/L 組F 值P 值實驗次數(shù)3 3 3 3 3 p-Akt（Ser473）/Akt 0.53±0.14 0.45±0.12 0.24±0.07a 0.09±0.03a 0.11±0.04a 42.635＜0.001 GSK-3β 0.93±0.26 0.89±0.20 0.90±0.19 0.88±0.20 0.91±0.21 0.081 0.988 p-GSK-3β（Ser21）0.58±0.13 0.49±0.12 0.12±0.03a 0.07±0.02a 0.09±0.03a 69.328＜0.001 p-GSK-3β（Ser21）/GSK-3β 0.62±0.15 0.54±0.13 0.14±0.04a 0.08±0.03a 0.10±0.04a 58.713＜0.001

圖2 葛根素對人腎癌786-O 細胞PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路蛋白表達的影響

2.4 葛根素對人腎癌786-O 細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響 與空白對照組比較，葛根素20、40 mg/L 組和LY294002 15 mg/L 組786-O 細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax 相對表達量顯著升高而Bcl-2 相對表達量顯著降低（P＜0.01），Bax/Bcl-2 比值顯著升高（P＜0.01）；葛根素40 mg/L 組Cleaved Caspase-3、Bax 相對表達量和Bax/Bcl-2 比值顯著高于LY294002 15 mg/L 組（P＜0.01），兩組間Caspase-9、Bcl-2 表達差異均無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。見圖3、表3。

表3 葛根素對人腎癌786-O 細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2 比值的影響（±s）

表3 葛根素對人腎癌786-O 細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2 比值的影響（±s）

注：Caspase-9 為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；Cleaved Caspase-3 為激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bcl-2 為B 淋巴細胞瘤-2；Bax 為Bcl-2 相關(guān)X 蛋白；LY294002 為磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑；與空白對照組比較，aP＜0.01；與LY294002 15 mg/L 組比較，bP＜0.01

組別空白對照組葛根素10 mg/L 組葛根素20 mg/L 組葛根素40 mg/L 組LY294002 15 mg/L 組F 值P 值實驗次數(shù)3 3 3 3 3 Caspase-9 0.17±0.04 0.20±0.05 0.37±0.08a 0.66±0.13a 0.58±0.11a 40.286＜0.001 Cleaved Caspase-3 0.11±0.03 0.14±0.05 0.25±0.06a 0.72±0.16ab 0.43±0.12a 46.287＜0.001 Bcl-2 0.48±0.12 0.40±0.10 0.31±0.08a 0.18±0.05a 0.21±0.07a 20.851＜0.001 Bax 0.08±0.02 0.22±0.06a 0.36±0.08a 0.62±0.12ab 0.20±0.05a 51.692＜0.001 Bax/Bcl-2 0.17±0.04 0.54±0.12a 1.16±0.27a 3.41±0.65ab 0.95±0.22a 73.754＜0.001

圖3 葛根素對人腎癌786-O 細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響

3 討 論

葛根素是中藥葛根的主要活性成分，目前主要用于冠心病、心絞痛、小兒病毒性心肌炎、缺血性腦血管病、糖尿病等輔助治療。隨著藥理學研究的深入，葛根素抗腫瘤活性逐漸得到關(guān)注，其中促進腫瘤細胞凋亡是其關(guān)鍵作用機制之一，但既往葛根素對腎癌細胞凋亡的影響及相關(guān)機制仍無定論。LY294002 為PI3K 特異性抑制劑，He 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過LY294002 抑制PI3K/Akt 信號通過能夠明顯促進人腎癌786-O 細胞和ACHN 細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素或LY294002 干預48 h 能夠顯著提高人腎癌786-O 細胞增殖抑制率和凋亡率，并且葛根素40 mg/L 組效果優(yōu)于LY294002 15 mg/L 組，提示葛根素具有抑制786-O 細胞增殖并促進其凋亡的作用。

細胞凋亡受阻是癌細胞惡性生長的重要因素，是抗癌新藥研究的重要靶點。Bcl-2 家族蛋白（Bcl-2、Bax 等）在細胞凋亡過程中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，癌細胞惡性快速增殖導致局部缺氧引發(fā)氧化應激、Ca2+超載，將病理性刺激Bax 表達上調(diào)并誘導其線粒體膜轉(zhuǎn)移，進而使線粒體膜通透性升高，導致具有促凋亡作用的細胞色素C（Cyt C）釋放進入細胞質(zhì)，Cyt C切割活化Caspase-3，并且Caspase-9 也能夠剪切活化Caspase-3，Cleaved Caspase-3 參與細胞凋亡的啟動與執(zhí)行[12-13]。Bcl-2 主要于線粒體膜表達，對線粒體膜通透性具有保護作用，并且能夠與Bax 形成二聚體而抑制其活性。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素或LY294002干預48 h 能夠顯著上調(diào)人腎癌786-O 細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax 表達并下調(diào)Bcl-2表達，顯著提高Bax/Bcl-2 比值，葛根素40 mg/L 組對Cleaved Caspase-3、Bax 表達和Bax/Bcl-2 比值的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于LY294002 15 mg/L 組，這可能是葛根素促進786-O 細胞凋亡的重要機制。

Akt 為PI3K 的下游效應分子，p-PI3K（Tyr317）能夠誘導其Ser473 位點磷酸化[p-Akt（Ser473）]而被活化。GSK-3β 是一種多效應功能激酶，能夠誘導線粒體Cyt C 釋放、激活Caspase-3 而促進細胞凋亡；GSK-3β 為Akt 下游效應分子，p-Akt（Ser473）由細胞膜位移至細胞內(nèi)而誘導GSK-3β 的Ser21 位點磷酸化[p-GSK-3β（Ser21）]而失去活性，因此，PI3K/Akt/GSK-3β 通路在細胞增殖與凋亡過程中具有重要調(diào)控作用[14-15]。此外，既往有研究發(fā)現(xiàn)，p-Akt（Ser473）能夠誘導Caspase-9 磷酸化失活而間接抑制Caspase-3 活化，并且p-Akt（Ser473）能夠抑制Bax 表達[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素或LY294002 干預48 h 能夠顯著下調(diào)786-O 細胞p-PI3K（Tyr317）、p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser21）表達，降低p-PI3K（Tyr317）/PI3K、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK-3β（Ser21）/GSK-3β 比值；葛根素40 mg/L 組各指標與LY294002 15 mg/L 組差異無統(tǒng)計學意義。提示葛根素具有抑制人腎癌786-O 細胞PI3K/Akt/GSK3β 信號通路的作用，這可能是其促進786-O 細胞凋亡的重要分子機制。

綜上所述，葛根素具有誘導人腎癌786-O 細胞凋亡并抑制其增殖的作用，其機制可能與抑制PI3K/Akt/GSK3β 信號通路有關(guān)。本研究為葛根素用于腎癌的防治提供了實驗依據(jù)，但其作用機制還有待于進一步研究。