曾小飛 楊鈺歡 柳嘉瑋 魯 陳

1 贛南醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院,江西省贛州市 341000; 2 江蘇省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部; 3 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心

螨蟲是最常見的致敏物質(zhì)之一,全球約有6 500萬～1.3億對其過敏的患者,在哮喘患者中螨蟲的過敏率高達(dá)50%[1-2]。迄今為止,已有40種不同組別的螨蟲過敏原,被鑒定且收錄在過敏原命名委員會數(shù)據(jù)庫中。粉塵螨Der f 38是在2021年被鑒定具有Toll樣受體4結(jié)合活性的溶菌酶樣蛋白,其在螨蟲過敏患者中的致敏率為60%～75%[3],是一個(gè)重要的過敏原分子。過敏原特異性免疫療法(AIT)有別于其他治療方法,其療效被多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)[4]。傳統(tǒng)免疫治療中使用的螨蟲過敏原疫苗,是從螨蟲中提取的混合物質(zhì),成分變異大、標(biāo)準(zhǔn)控制難、容易出現(xiàn)不良反應(yīng)[5]。重組過敏原及其低致敏活性的衍生物,展現(xiàn)出更有前景、更安全和有效的優(yōu)勢[6],此類治療藥物或疫苗的開發(fā),需要對過敏原的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和免疫優(yōu)勢表位有充分的了解。本研究通過綜合生物信息學(xué)工具,對螨蟲過敏原Der f 38進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、優(yōu)勢B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的預(yù)測分析,為進(jìn)一步針對該過敏原的個(gè)體化免疫治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 Der f 38蛋白的序列檢索以及理化性質(zhì)分析 從世界衛(wèi)生組織/國際免疫學(xué)會聯(lián)合會過敏原命名數(shù)據(jù)庫(http://www.allergen.org/)中檢索獲取Der f 38的氨基酸序列,該序列在GenBank中的登記號為QHQ72282.1。根據(jù)所獲得的Der f 38氨基酸序列信息,通過SignalP-5.0預(yù)測其信號肽序列(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0),使用ProtParam分析除去信號肽后的序列,獲取成熟蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸組成、正負(fù)電荷殘基、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2 Der f 38蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)分析 Der f 38蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測主要通過DNAStar軟件完成。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過同源建模的SWISS-MODEL[7]和人工智能深度學(xué)習(xí)的AlphaFold2[8]兩種方法來實(shí)現(xiàn)。在SWISS-MODEL中 (https://swissmodel.expasy.org/),提交成熟Der f 38蛋白的氨基酸序列進(jìn)行模型構(gòu)建,在結(jié)果中選取序列覆蓋率最廣、序列一致性最強(qiáng)、全局模型質(zhì)量評估(GMQE)最高的模型進(jìn)行下一步分析。在AlphaFold2中,提交氨基酸序列后,選擇系統(tǒng)評分最佳的模型進(jìn)行后續(xù)分析。

利用SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)對不同方法構(gòu)建的Der f 38模型進(jìn)行準(zhǔn)確性和有效性測試:通過PROCHECK評估模型結(jié)構(gòu)的立體化參數(shù)[9],Verify3D評估蛋白結(jié)構(gòu)的三維輪廓,與其自身氨基酸序列的匹配性[10],ERRAT評估特征原子間相互作用的分布方式[11]。根據(jù)評分結(jié)果,選擇最佳的模型,進(jìn)一步利用GalaxyRefne服務(wù)器(http://galaxy.seoklab.org/)對模型進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的模型用上述評分系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證,最終將優(yōu)化后的模型用Pymol(https://pymol.org/2/)展示,并分析Der f 38的結(jié)構(gòu)特征。

1.3 Der f 38蛋白的優(yōu)勢B表位預(yù)測分析 B細(xì)胞表位分為線性表位和構(gòu)象表位,線性表位又稱連續(xù)性表位,一般由抗原表面幾個(gè)連續(xù)的氨基酸組成[12]。Der f 38蛋白的線性表位預(yù)測通過綜合3種不同的免疫信息學(xué)工具進(jìn)行,即Bepipred 2.0、ElliPro、DNAStar protean。在Bepipred 2.0(http://tools.iedb.org/bcell/)、ElliPro(http://tools.iedb.org/ellipro/)中對蛋白進(jìn)行線性表位預(yù)測,在得分中選取高于0.5的結(jié)果作為線性表位。在DNAStar Protean中,選擇同時(shí)滿足親水性、柔性、抗原性、可及性序列區(qū)域作為線性表位,綜合這三種工具篩選出的線性表位結(jié)果。

構(gòu)象表位是由序列上不相連的氨基酸殘基通過折疊形成的空間結(jié)構(gòu)。構(gòu)象表位可通過DiscoTope 2.0線上網(wǎng)站預(yù)測,在DiscoTope 2.0 server (http://tools.iedb.org/discotope/)中,選擇結(jié)果>-3.7的氨基酸作為參與形成B細(xì)胞構(gòu)象表位的關(guān)鍵性殘基。

1.4 Der f 38蛋白的T表位預(yù)測 Der f 38蛋白的T細(xì)胞表位預(yù)測主要通過TepiTool(http://tools.iedb.org/tepitool/)進(jìn)行,選擇IDEB推薦的預(yù)測方法[13],從預(yù)測的結(jié)果中選擇具有活性的表位作為最終的MHC-Ⅱ表位。

2 結(jié)果

2.1 Der f 38蛋白的序列和理化性質(zhì) 根據(jù)螨蟲過敏原Der f 38的氨基酸序列信息,利用SignalP-5.0分析,顯示Der f 38在20位和21位氨基酸之間存在切割位點(diǎn),信號肽的可能性為99.88%。對Der f 38蛋白序列理化性質(zhì)分析,其分子量為13.99kDa,分子式為C622H935N187O177S4,理論等電點(diǎn)(pI)為9.08,氨基酸中帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)有7個(gè),帶正電荷的殘基有11個(gè)(Arg+Lys)。不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為31.79,親水性指數(shù)(GRAVY)為-0.337,表明該蛋白具有一定的穩(wěn)定性及親水性。

2.2 Der f 38蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)優(yōu)化 在SWISS-MODEL同源預(yù)測中,RipA蛋白(編號為3ne0.1.A)與Der f 38蛋白的序列一致性為40%,且序列覆蓋率高達(dá)83%,因此,以RipA蛋白為模板構(gòu)建Der f 38蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型(見圖1a)。在AlphaFold2預(yù)測中,選擇置信度PLDDT最高的模型作為Der f 38蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型(見圖1b)。通過SAVES v6.0服務(wù)器對兩種方法預(yù)測出Der f 38的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)評分,SWISS-MODEL所得模型評分為96.85%,AlphaFold2所得模型評分為100%,即兩種模型中都有超過80%的氨基酸殘基,擁有>0.2的3D/1D值。ERRAT評分中SWISS-MODEL模型得分(92.308,見圖1d)較AlphaFold2模型(82.645,見圖1e)更佳。在PROCHECK的評分中,拉氏圖提示SWISS-MODEL模型在不被允許的區(qū)域內(nèi)存在氨基酸殘基(見圖1g),而AlphaFold2模型的所有氨基酸殘基都落在優(yōu)勢區(qū)域或允許區(qū)域內(nèi)(見圖1h)。綜合評分結(jié)果,應(yīng)選擇AlphaFold2模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。優(yōu)化后的模型(見圖1c)再次通過SAVES v6.0進(jìn)行評分,相較于未優(yōu)化模型各評分均有提升,ERRAT提示優(yōu)化后模型的評分為100(見圖1f),拉氏圖結(jié)果(見圖1i)提示優(yōu)化后模型的所有氨基酸殘基均在允許區(qū)域內(nèi),且在最佳區(qū)域的氨基酸殘基增加,最終得到Der f 38蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)和6個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)。

圖1 Der f 38蛋白的模型與評分

2.3 Der f 38蛋白的B表位 過敏原蛋白的B細(xì)胞表位鑒定是針對該蛋白進(jìn)行治療、疫苗設(shè)計(jì)與開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)用ElliPro、Bepipred 2.0、DNAStar protean三種方法預(yù)測線性B表位,DiscoTope 2.0預(yù)測構(gòu)象B表位。通過輸入Der f 38的三級結(jié)構(gòu),ElliPro預(yù)測出6個(gè)線性表位,其氨基酸位置處于43-59、71-78、83-101、107-113、127-133、135-144。輸入Der f 38的氨基酸序列后,Bepipred 2.0輸出4個(gè)線性表位,分別為:40-59、75-78、85-100、132-142,在DNAStar protean中,綜合蛋白的親水性、抗原性、表面可及性、柔韌性(見圖2),預(yù)測出2個(gè)線性表位:98-101和126-136。將上述三種方法預(yù)測出的B表位取交集,收集至少兩種方法預(yù)測出的氨基酸序列作為Der f 38最終的線性B表位,其位置分別為43-59、75-78、85-101、127-142(見表1)。DiscoTope 2.0預(yù)測出該蛋白中含有8個(gè)參與構(gòu)象表位的氨基酸殘基(見表2),在這8殘基中,除了第34位氨基酸,剩余7個(gè)殘基同時(shí)位于線性B表位區(qū)域,B表位在Der f 38蛋白的模型中的位置見圖3。

表1 Der f 38線性B表位的氨基酸序列

表2 Der f 38參與形成構(gòu)象B表位的關(guān)鍵氨基酸序列

圖2 DNAStar分析的Der f 38蛋白的四種性質(zhì)

圖3 B細(xì)胞表位在Der f 38蛋白空間結(jié)構(gòu)中的位置

2.4 Der f 38蛋白的T表位 在TepiTool中,選擇DP、DR、DQ位點(diǎn)中最常見的26個(gè)等位基因與Der f 38蛋白的多肽進(jìn)行結(jié)合,得出11個(gè)符合設(shè)定閾值的肽鏈,其中有8個(gè)與至少2條等位基因相結(jié)合,其氨基酸序列為21-35、66-80、72-86、77-91、103-117、108-122、113-127、136-150,具體的氨基酸序列以及與其結(jié)合的等位基因信息見表3。

表3 Der f 38的T表位篩選結(jié)果

3 討論

螨蟲是主要的致敏物質(zhì)之一,可誘發(fā)敏感患者產(chǎn)生一系列的過敏癥狀[14]。重組過敏原的發(fā)現(xiàn),促進(jìn)了基于分子水平免疫治療方法的發(fā)展,相較于傳統(tǒng)的螨蟲浸提物形式的治療策略,基于過敏原單體及其衍生物進(jìn)行個(gè)體化的給藥,具有更好的安全性[15]。例如基于B細(xì)胞表位融合大分子的Der p 23低致敏疫苗表現(xiàn)出顯著降低的致敏活性,并具有較好的免疫調(diào)節(jié)能力[16];使用B表位或T表位多肽片段是一種新的多肽免疫治療策略[17]。因此,對過敏原的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和表位的分析,在新型脫敏治療疫苗的開發(fā)中尤為必要。

螨蟲中Der f 38是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有Toll樣受體4結(jié)合活性的重要過敏原,其過敏率可達(dá)到60%[3]。在本研究中,首先根據(jù)螨蟲Der f 38過敏原氨基酸序列分析其理化性質(zhì),表明該Der f 38屬于親水且穩(wěn)定的堿性蛋白。為了進(jìn)一步分析Der f 38的B細(xì)胞表位,使用經(jīng)典SWISS-MODEL進(jìn)行Der f 38三維結(jié)構(gòu)的同源構(gòu)建,同時(shí)也利用新型基于人工智能工具AlphaFold2進(jìn)行同步比較[18],最終構(gòu)建和評價(jià)結(jié)果也表明AlphaFold2更具有優(yōu)勢,該策略也為其他過敏原疫苗構(gòu)建過程提供了新的基于人工智能方法的啟發(fā)。Der f 38自身具有的Toll樣受體4結(jié)合活性使其具有促炎癥細(xì)胞浸潤的作用[3],因此預(yù)測并分析Der f 38的表位有助于構(gòu)建低不良反應(yīng)的過敏原疫苗。根據(jù)Der f 38的氨基酸序列和AlphaFold2構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)模型,綜合預(yù)測工具結(jié)果得到了4條位于Der f 38蛋白表面的B表位,同時(shí)預(yù)測得到的8個(gè)參與形成構(gòu)象表位的關(guān)鍵殘基,其中7個(gè)殘基位于線性表位當(dāng)中,這些結(jié)果為進(jìn)一步組合構(gòu)建Der f 38提供了重要的依據(jù)。為了避免過敏原疫苗中T細(xì)胞表位可能引起過敏原特異性T細(xì)胞活化的遲發(fā)性不良反應(yīng)[19],T細(xì)胞的預(yù)測分析尤為重要。在TepiTool中分析得到8條候選T細(xì)胞表位,可幫助在設(shè)計(jì)B細(xì)胞表位疫苗時(shí)選擇合適的多肽區(qū)域,達(dá)到進(jìn)一步降低不良反應(yīng)的目的。

綜上所述,本研究通過對塵螨過敏原Der f 38的理化性質(zhì)、B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的分析,為其表位、多肽或融合蛋白疫苗的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)和設(shè)計(jì)方向,用于達(dá)到提高免疫治療療效、降低疫苗不良反應(yīng)目的。