羅雨佳，雷 杰，祝 煒，段剛峰

（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430022）

據(jù)2020 年《中國心血管健康與疾病報告》顯示，自2002 年以來中國心肌梗死患病率與病死率呈持續(xù)增長趨勢［1］。心肌梗死是指在嚴(yán)重冠狀動脈狹窄的情況下，出現(xiàn)供血區(qū)心肌嚴(yán)重且持續(xù)缺血，導(dǎo)致左心室功能障礙［2］。臨床上常予以冠脈介入等方法快速有效地恢復(fù)心肌血供，避免心肌梗死的進(jìn)一步嚴(yán)重發(fā)展。而若患者為冠狀動脈遠(yuǎn)端彌漫性病變、缺血梗死病變范圍廣泛或不能耐受手術(shù)等情況，介入等傳統(tǒng)血管重建手術(shù)治療在此時出現(xiàn)一定的局限性［3］。所以在發(fā)生心肌梗死后，通過促進(jìn)相應(yīng)部位血管新生建立側(cè)支循環(huán)代償或許能達(dá)到更好的治療效果，“治療性血管新生”的觀念應(yīng)運(yùn)而生［4］。

本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，以蔥白為代表的益氣溫陽治法能改善心肌缺血情況，減小心肌梗死區(qū)域面積，減輕心肌梗死后再灌注損傷［5-6］。本次試驗擬探討蔥白提取物（fistulan onion bulb，F(xiàn)OB）促進(jìn)血管新生的具體機(jī)制，行左冠狀動脈結(jié)扎構(gòu)建心肌梗死大鼠模型，通過CD34 免疫組化染色觀察新生血管情況，并研究蔥白提取物對TGF-β 及MEK/ERK 通路的調(diào)控作用，發(fā)掘蔥白提取物對于心肌梗死后相應(yīng)區(qū)域新生血管的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SPF 級SD 大鼠40 只，雄性，3～ 4 月齡，體重（200 ± 20）g，購于湖北省實驗動物研究中心（42000600004917）。

1.1.2 藥物 蔥白提取物（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供，批號2081205）配成濃度300 mg/mL 混懸液；麝香保心丸（上海和黃藥業(yè)有限公司，批號：Z31020068），配成濃度7.5%混懸液。

1.1.3 試劑 TGF-β 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），RIPA 裂解液、50*cooktail、PMSF、磷酸化蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、ECL、顯影定影試劑（武漢谷歌生物科技有限公司），三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、二甲苯、H2O2（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒（丹麥Agilent Dako 公司），BSA（羅氏制藥公司）。

1.1.4 主要儀器 分光光度儀、高精度加液器（美國GeneRay 公司，UV-photomete 型），TGL-16c 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），熒光定量PCR 儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），純水儀（青島富勒姆科技有限公司，F(xiàn)BZ2001-up-p 標(biāo)準(zhǔn)試劑型），WD-9405A 脫色搖床、DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠），AX-Ⅱ暗匣（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司），感光膠片（美國Eastman Kodak 公司），V300 掃描儀（日本EPSON 公司），alphaEaseFC 灰度分析軟件（Alpha Innotech 公司），HX200 動物人工呼吸機(jī)（成都春盟科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌梗死造模 將大鼠于SPF 級動物房分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，再行造模。首先將大鼠經(jīng)腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，3 mL/kg），再取仰臥位固定大鼠四肢于無菌操作臺上，頸、胸部備皮及消毒處理，連接心電圖記錄儀，記錄術(shù)前正常心電圖。用小型動物呼吸機(jī)行有創(chuàng)呼吸支持，而后打開胸腔，充分暴露心臟術(shù)野，4 號線結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支。根據(jù)心電圖記錄儀Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST 段上抬，同時左室心肌組織顏色變淺為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)［7］。術(shù)畢將心臟回納，縫合胸腔。假手術(shù)組操作步驟同上，但只放置手術(shù)線不結(jié)扎冠脈（造模后死亡3 只大鼠，當(dāng)即予以補(bǔ)充，步驟同前）。

1.2.2 分組、給藥 將造模成功大鼠編號，通過隨機(jī)數(shù)字表分成模型組、蔥白提取物組、麝香保心丸組、假手術(shù)組，每組10 只。于造模后給藥，蔥白提取物組及麝香保心丸組各以2 mL/kg 的劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組予同體積生理鹽水灌胃，每日1 次，持續(xù)28 d。

1.2.3 標(biāo)本采集、指標(biāo)檢測 持續(xù)給藥28 d 后，次日清晨開始行腹腔麻醉（方法同上），麻醉完全后，從腹主動脈處采血3 mL，立即置于離心機(jī)離心15 min（3 000 r/min），用移液槍取上層血清于EP 管，采用ELISA 法快速檢測大鼠血清TNF-β 含量，具體步驟依照TGF-β 試劑盒說明書進(jìn)行。剪取心臟左心室組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后，放入4%多聚甲醛溶液浸沒固定24 h，再依次行多梯度酒精脫水、二甲苯透明處理、石蠟包埋，切片，烤片，存儲。

1.2.4 CD34 染色并檢測微血管數(shù)量及密度 以ELPS（Enhance Labeled Polymer System）［8］法將預(yù)處理好的心肌切片先行TBS 處理、蒸餾水漂洗，再依次置入一抗、EnVision、色源底物溶液孵育30 min，蒸餾水漂洗封片。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)選取200 倍3 處視野進(jìn)行拍照記錄，運(yùn)用Image 6.0圖像分析軟件分析出每張照片心肌組織面積和相應(yīng)微血管計數(shù)數(shù)量（MVQ），平均微血管計數(shù)數(shù)量比上心肌面積就能得到微血管密度（MVD）。

1.2.5 Western Blot 法檢測MEK、ERK 蛋白含量 取凍存心肌組織常溫解凍，剪碎成小塊置于組織液中進(jìn)行勻漿，取1.5 mL 勻漿液離心，收集上清液，即為總蛋白溶液。采用Bradford 法測定蛋白濃度，計算上樣量值。隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，100 V 上樣電泳60 min，200 mA 轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂牛奶封閉60 min，加入一抗（稀釋1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入二抗（稀釋1∶3 000）孵育30 min，再次TBST 清洗3 次。行化學(xué)發(fā)光顯影，樣本灰度值用AlphaEase FC 軟件分析。

1.2.6 RT-PCR 法檢測MEK mRNA、ERK mRNA 擴(kuò)增倍數(shù) 取100 mg 心肌組織加入勻漿器研磨至無小塊狀組織，加入250 μL 三氯甲烷顛倒混勻隨后平放3 min，在4 ℃下離心8 min（13 000 r/min），用移液槍移取上清液，再加異丙醇繼續(xù)顛倒混勻，-20 ℃平放15 min 后離心10 min（13 000 r/min），吸去液體，繼續(xù)加入75%乙醇1.5 mL 洗滌，再次4 ℃、13 000 r/min 離心5 min，去除液體，即能得到總RNA。然后于PCR 機(jī)上，使RNA 溶液與10 mmol/L dNTPs、RNA inhibitor、反轉(zhuǎn)錄酶混合反應(yīng)30 min，結(jié)束時滅活反轉(zhuǎn)錄酶（80 ℃保溫5 min）得到cDNA。取20 μLPCR 管配置PCR 反應(yīng)體系（2 × qPCR Mix 12.5 μL、7.5 μmol/L 基因引物2.0 μL、cDNA 2.5 μL、ddH2O 8.0 μL），95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，循環(huán)40 次，60 ℃延伸5 min，將得到的擴(kuò)增結(jié)果以2-ΔΔCT 法進(jìn)行處理并整理呈圖表。各引物信息見表1。

表1 各PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗中使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，使用單因素方差分析比較多組間的均值，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度及CD34 免疫組化染色

結(jié)果見表2 和圖1。由表2 結(jié)果可知，與假手術(shù)組相比，心梗模型大鼠心肌微血管密度升高（P<0.01）；且與模型組相比，應(yīng)用蔥白、麝香保心丸治療的大鼠MVD 數(shù)值均進(jìn)一步升高（P<0.01）。

圖1 四組大鼠心梗邊緣區(qū)心肌組織CD34 染色結(jié)果（×200）Fig.1 CD34 staining results of myocardial tissue in the marginal zone of myocardial infarction in four groups of rats (× 200)

表2 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管密度Tab.2 MVD in the marginal area of myocardial infarction in rats of each group（xˉ± s）（n=10）

2.2 各組大鼠血清TGF-β 水平比較

結(jié)果如表3 所示。模型組大鼠血清TGF-β 水平較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，麝香保心丸組、蔥白組大鼠血清TGF-β 水平均升高（P<0.05，P<0.01），且蔥白組血清TGF-β 與麝香保心丸組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

表3 各組大鼠血清TGF-β 含量比較Tab.3 Serum TGF-β content comparison of rats in each group（xˉ± s）（n=10）

2.3 各組大鼠心肌邊緣區(qū)MEK、ERK 灰度比值比較

結(jié)果見圖2。由圖2 可知與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌ERK/actin 比值下降（P<0.01），MEK/actin 比值無明顯差別（P>0.05）。與模型組比較，麝香保心丸組、蔥白組心肌MEK/actin、ERK/actin 比值均明顯上升（P<0.01）；與麝香保心丸組比較，蔥白組心肌MEK/actin 比值無明顯差異（P>0.05），ERK/actin 比值有所降低（P<0.01）。

圖2 各組大鼠心梗邊緣區(qū)MEK、ERK 蛋白表達(dá)（n=10）Fig.2 Expression of MEK and ERK proteins in the marginal zone of myocardial infarction in rats of each group（n=10）

2.4 各組大鼠心梗邊緣區(qū)MEK mRNA、ERK mRNA 表達(dá)比較

結(jié)果見圖3。由圖3 可知，以假手術(shù)組為參照對比，記錄其余各組大鼠心梗邊緣區(qū)MEK mRNA、ERK mRNA 擴(kuò)增倍數(shù)。蔥白組和麝香保心丸組較模型組而言，上述指標(biāo)均極顯著增加（P<0.01）；與麝香保心丸組比較，蔥白組MEK mRNA、ERK mRNA 擴(kuò)增倍數(shù)均明顯降低（P<0.01，P<0.05）。

圖3 各組大鼠心梗邊緣區(qū)MEK mRNA、ERK mRNA 表達(dá)情況Fig.3 Expression of MEK mRNA and ERK mRNA in the marginal zone of myocardial infarction in rats of each group

3 討論

中醫(yī)藥在心血管系統(tǒng)疾病治療方面有著悠久的歷史，如《金匱要略》所言：“夫脈當(dāng)取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛”指出胸痹主要病機(jī)為上焦心陽虛衰，治當(dāng)以溫陽通脈［9］。蔥白為辛溫通陽藥，具有溫通心脈，宣通胸陽的作用。且蔥白提取物能抗氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)，對心肌缺血損傷大鼠心肌有保護(hù)作用［10］。

當(dāng)冠狀動脈的血供急劇減少或中斷時，冠脈微循環(huán)也遭受巨大損傷，梗死區(qū)發(fā)生微血管解體和毛細(xì)血管狹窄，相應(yīng)供血區(qū)域心肌組織能量和氧氣都會急劇減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子被激活，靜止的內(nèi)皮細(xì)胞重新調(diào)整血管形狀來優(yōu)化血流［11］。但僅靠自發(fā)性代償性血流調(diào)節(jié)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，目前臨床常見的治療手段如血管介入和冠脈搭橋手術(shù)均旨在盡快改善心肌組織缺血情況，若為冠狀動脈遠(yuǎn)端彌漫性病變或不能耐受手術(shù)，采用促血管新生治療建立側(cè)支循環(huán)也不妨是一種更合適的治療手段。

血管新生是一個復(fù)雜的過程。首先是血管活化階段，血管基底膜降解、通透性增加，使血管內(nèi)皮細(xì)胞可以遷移到缺血區(qū)，以出芽的方式形成新的毛細(xì)血管，其次是血管穩(wěn)定階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌TGF-β 將間充質(zhì)細(xì)胞召集到血管周圍，并分化為周細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，緊密保護(hù)新生血管［12］。TGF-β1 可以啟動周細(xì)胞祖細(xì)胞的分化，也能推動神經(jīng)嵴或間充質(zhì)來源的祖細(xì)胞分化為平滑肌樣細(xì)胞［13］。內(nèi)皮素敲除小鼠的實驗證實了TGF-β1 在這一過程中的功能意義，這些小鼠由于血管重構(gòu)缺陷和平滑肌細(xì)胞分化而無法存活［14］。內(nèi)皮素是一種TGF-β 結(jié)合蛋白，也被稱為TGF-β III 型受體。也有研究［15］發(fā)現(xiàn)，麝香通心滴丸可促進(jìn)心梗大鼠的心肌梗死區(qū)血管新生，減小梗死面積，上調(diào)心肌TGF-β1 蛋白表達(dá)。

TGF-β 的下游信號通路，除了經(jīng)典的Smad 通路外，還有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路［16］。MAPK 通路是由Ras、Raf、MEK 和ERK 組成的一系列蛋白激酶，在所有真核細(xì)胞中都具有高度保守特性［17］。ERK 是介導(dǎo)血管生成的重要信號蛋白，可被細(xì)胞外生長因子刺激，然后通過其下游細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的信號分子調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、遷移、凋亡和血管生成［18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液可通過激活ERK 信號通路，上調(diào)ERK、MEK 磷酸化水平，減小心肌梗死模型小鼠的心梗面積、增加心梗邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度、提高心臟射血分?jǐn)?shù)。

本試驗通過CD34 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，蔥白提取物能增加心肌梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù)量，有促血管新生作用，同時其也能明顯提升血清TGF-β 及心肌組織中MEK、ERK 表達(dá)含量。綜上所述，蔥白提取物促血管新生改善心肌缺血情況有正向作用，其作用機(jī)制可能通過上調(diào)TGF-β及MEK/ERK 信號通路水平有關(guān)，最終實現(xiàn)促血管新生促進(jìn)心肌梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)血管建立。