吳巧鈴,姜 山,2**,陳雨微,孫 陽(yáng)***

(1.福建省腫瘤醫(yī)院婦科 福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤臨床醫(yī)學(xué)院,福州 350014;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州 350122)

卵巢癌死亡率居于婦科惡性腫瘤首位,由于臨床表現(xiàn)隱匿、早期癥狀不典型且缺乏有效的篩查手段,大多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期[1-2]。卵巢癌亞型復(fù)雜,具有不同的分子生物學(xué)特征,即使采用外科手術(shù)輔以全身化療這一首選治療方案,幾乎所有患者都會(huì)復(fù)發(fā)[3-4]。進(jìn)一步深入研究卵巢癌轉(zhuǎn)移機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。PXN作為一種蛋白質(zhì)編碼基因,編碼細(xì)胞骨架蛋白——樁蛋白(paxillin),該蛋白聯(lián)合VCL(vinculin)和ZYX(zyxin)蛋白通過(guò)LC3參與細(xì)胞和黏著斑(FAs)位點(diǎn)的黏附過(guò)程,影響癌細(xì)胞的遷移和侵襲[5-7]。本研究挖掘卵巢癌中高表達(dá)的遷移侵襲相關(guān)基因PXN并驗(yàn)證其生物學(xué)功能,以期為晚期卵巢癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的理論依據(jù)和治療新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與試劑 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞由福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送。McCoy's 5A培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技公司;新生胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司;兔抗人PXN單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;兔抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔第二抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自大連美侖生物公司;RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司;Transwell透明小室及Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司;PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。

1.2 篩選、分析卵巢上皮性癌(卵巢癌)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因

1.2.1 卵巢癌公共測(cè)序數(shù)據(jù)獲取及處理 通過(guò)UCSC Xena(University Of Cingifornia Sisha Cruz,加州大學(xué)圣克魯茲分校)門戶下載來(lái)自于TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)數(shù)據(jù)庫(kù)的卵巢癌組織測(cè)序數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集,以及來(lái)自GTEx(Genotype-Tissue Expression Project,基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù))的正常卵巢組織測(cè)序數(shù)據(jù),并通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充訓(xùn)練集缺失的臨床信息[8]。通過(guò)GEO(Gene Expression Omnibus,基因表達(dá)綜合)數(shù)據(jù)庫(kù)下載卵巢癌基因芯片數(shù)據(jù)及臨床信息GSE26712作為驗(yàn)證集[9]。所有數(shù)據(jù)利用軟件R進(jìn)行基因注釋,并處理為log2(TPM+1)進(jìn)行后續(xù)分析,刪除缺失值,相同基因取平均值去重。

1.2.2 遷移侵襲能力相關(guān)基因的獲取 在GeneCards(人類基因數(shù)據(jù)庫(kù),https://www.genecards.org/)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中分別輸入搜索詞“migration”和“invasion”,從該數(shù)據(jù)庫(kù)下載遷移侵襲相關(guān)基因,以相關(guān)分?jǐn)?shù)“Relevance score”>7為條件,篩選出與細(xì)胞遷移侵襲能力相關(guān)性較高的基因。

1.2.3 差異表達(dá)分析 利用R 4.2.2及l(fā)imma算法聯(lián)合TCGA與GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)分析,對(duì)比遷移侵襲相關(guān)基因在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達(dá)水平。以差異表達(dá)倍數(shù)logFC>1和adj.P<0.001為篩選條件,尋找在卵巢癌組織中高表達(dá)的遷移侵襲相關(guān)基因。應(yīng)用“ggplot2”R包繪制火山圖對(duì)差異表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.4 生存分析 根據(jù)遷移侵襲相關(guān)基因表達(dá)中位值將全部卵巢癌樣本分為高低表達(dá)兩組,應(yīng)用“survival”R包計(jì)算高低表達(dá)兩組之間生存差異。通過(guò)交集獲取在訓(xùn)練集TCGA隊(duì)列及驗(yàn)證集GSE26712隊(duì)列都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的遷移侵襲相關(guān)基因,應(yīng)用“survminer”R包進(jìn)行生存曲線可視化。

1.2.5 GO/KEGG功能富集分析 基于TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)集以“cortest”函數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,以|R|>0.7及P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得與遷移侵襲基因顯著相關(guān)的基因群,應(yīng)用“clusterProfiler”R包對(duì)基因群進(jìn)行功能富集分析,“GOplot”R包進(jìn)行富集結(jié)果可視化,富集分析結(jié)果以adjP<0.05為標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾。

1.3 藥物IC50值預(yù)測(cè) 依據(jù)TCGA-OV隊(duì)列相應(yīng)的臨床信息,利用GDSC(癌癥藥物敏感性基因組學(xué))數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了每個(gè)樣本的化療反應(yīng)。預(yù)測(cè)過(guò)程由R包pRRophetic實(shí)現(xiàn),其中樣品的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)通過(guò)嶺回歸估計(jì),所有參數(shù)均按默認(rèn)值設(shè)置,使用“combat”的批次效應(yīng)和“all”的組織類型,并將重復(fù)基因表達(dá)總結(jié)為平均值。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SKOV3細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的McCoy's 5A培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2PXN穩(wěn)定敲減卵巢癌細(xì)胞系的構(gòu)建PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體(GV493-PXN-EGFP)由上海吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)并合成,感染敲減慢病毒的組別為實(shí)驗(yàn)組(shPXN),以不轉(zhuǎn)染病毒作為空白對(duì)照(Mock)、轉(zhuǎn)染空載病毒(Ctrl)作為對(duì)照。具體方法:除去多余培養(yǎng)基,分別加病毒、培養(yǎng)基及相應(yīng)感染增強(qiáng)液,輕柔混勻,常規(guī)培養(yǎng)。12h后除去多余培養(yǎng)基,用PBS輕柔清洗2次,加常規(guī)培養(yǎng)基。采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞株,若熒光顯微鏡下感染效率>80%,表明嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定感染細(xì)胞株,可收集細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) 取各組SKOV3細(xì)胞樣本,按試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序:55℃反應(yīng)30min,85℃反應(yīng)5min,4℃反應(yīng)至結(jié)束;qPCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10min,95℃變性15s,60℃反應(yīng)1min,共30個(gè)循環(huán)。PXN基因引物序列,上游:5'-CAATGGCACAATCCTTGACC-3',下游:5'-GTGATGAGGACTGAGGCTG-3';GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照,其引物序列,上游:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',下游:5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算PXNmRNA表達(dá)水平,其中Ct表示循環(huán)閾值。

1.4.4 蛋白免疫電泳(Western blot) 取各組SKOV3細(xì)胞樣本,加細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2h,加稀釋后的一抗(PXN按1∶1000稀釋,GAPDH按1∶5000稀釋),4℃搖床過(guò)夜。洗膜,加二抗,37℃搖床孵育60min。取強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑A、B液按體積1∶1混合,加至PVDF膜,用蛋白曝光儀對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行曝光、掃描、照相。

1.4.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞分別按2×105細(xì)胞/孔接種于6孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜,觀察細(xì)胞融合率達(dá)90%以上并在6孔板底部形成單層細(xì)胞。除去多余培養(yǎng)基,采用無(wú)菌槍頭垂直于板底進(jìn)行劃痕,加無(wú)血清培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0、24h,顯微鏡下觀察、測(cè)量劃痕的寬度,并拍照,采用Image J軟件分析劃痕面積,計(jì)算細(xì)胞遷移率以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力,細(xì)胞遷移率(%)=(0h的劃痕面積-24h的劃痕面積)/0h的劃痕面積×100%。

1.4.6 Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室(24孔板)上室加稀釋后(稀釋倍數(shù)1∶5)的Matrigel基質(zhì)膠70μL(遷移實(shí)驗(yàn)則無(wú)需)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,按1×105/孔細(xì)胞加入Transwell小室的上室,在下室中加含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基,隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。經(jīng)甲醛固定、結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察、拍照,Image J軟件計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù),以此反映細(xì)胞的遷移侵襲能力。

2 結(jié) 果

2.1 影響卵巢癌遷移侵襲能力的預(yù)后相關(guān)基因

2.1.1 篩選在卵巢癌組織中高表達(dá)的遷移侵襲相關(guān)基因 從GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載影響細(xì)胞遷移與侵襲能力的基因,以相關(guān)分?jǐn)?shù)(Relevance score)>7為條件,篩選出與遷移侵襲相關(guān)性均較高的基因55個(gè)。聯(lián)合TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù),基于R語(yǔ)言“l(fā)imma”算法對(duì)篩選出的55個(gè)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析,火山圖用于可視化。以logFC(差異倍數(shù))>1和adj.P(統(tǒng)計(jì)學(xué)方法校正后的P)<0.001為篩選條件,發(fā)現(xiàn)36個(gè)遷移侵襲相關(guān)基因在卵巢癌組織高表達(dá),1個(gè)遷移侵襲相關(guān)基因在卵巢癌組織低表達(dá)(圖1)。

圖1 篩選在卵巢癌組織中高表達(dá)的遷移侵襲相關(guān)基因A:Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中遷移與侵襲相關(guān)基因的集合情況;B:火山圖展示遷移侵襲相關(guān)基因在卵巢癌組織與正常卵巢癌組織中的表達(dá)差異

2.1.2 各隊(duì)列生存預(yù)后相關(guān)基因情況 基于TCGA-OV隊(duì)列(訓(xùn)練集)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE26712數(shù)據(jù)集(驗(yàn)證集),依據(jù)基因表達(dá)的中位數(shù)將樣本分為高低表達(dá)組,利用R語(yǔ)言和Kaplan-Meier生存曲線對(duì)36個(gè)高表達(dá)基因進(jìn)行生存分析后取交集,發(fā)現(xiàn)1個(gè)遷移侵襲相關(guān)基因具有生存預(yù)后意義(P<0.05),該基因?yàn)镻XN。見圖2。

圖2 各隊(duì)列生存預(yù)后相關(guān)基因情況

利用Kaplan-Meier生存曲線對(duì)36個(gè)高表達(dá)基因進(jìn)行生存分析后取交集,GSE26712隊(duì)列中有1個(gè)基因具有預(yù)后意義,TCGA-OV隊(duì)中有4個(gè)基因具有預(yù)后意義,在兩個(gè)隊(duì)列中均有預(yù)后意義的基因有1個(gè)

2.1.3PXN基因?qū)β殉舶┗颊呖偵嫫诘挠绊?進(jìn)一步對(duì)交集中的PXN基因進(jìn)行生存曲線可視化,發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌患者不良預(yù)后相關(guān),隨著基因表達(dá)量增加,患者的總生存期明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 PXN基因?qū)β殉舶┗颊呖偵嫫诘挠绊慉:利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)探討PXN基因?qū)β殉舶┗颊呖偵嫫诘挠绊?B:利用GSE26712數(shù)據(jù)集探討PXN基因?qū)β殉舶┗颊呖偵嫫诘挠绊?/p>

2.1.4PXN基因GO功能富集分析結(jié)果 通過(guò)GO/KEGG功能富集分析探索PXN參與的生物過(guò)程(biological process,BP)。結(jié)果表明PXN的功能與組蛋白修飾、染色質(zhì)共價(jià)修飾、賴氨酸肽基修飾、蛋白質(zhì)去泛素化、通過(guò)去除小蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾、組蛋白去泛素化及組蛋白H3-K4三甲基化等相關(guān)(P<0.05),見圖4。

圖4 PXN基因GO功能富集分析結(jié)果

2.2 敲減PXN基因?qū)β殉舶┘?xì)胞遷移侵襲能力的影響

2.2.1 成功敲減PXN基因 利用敲減慢病毒載體感染卵巢癌細(xì)胞SKOV3后,Western blot檢測(cè)結(jié)果示,PXN敲減組(shPXN)的paxillin蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組(Mock)和陰性對(duì)照組(Ctrl)(P<0.0001);RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果示,PXN敲減組(shPXN)的PXNmRNA表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組(Mock)和陰性對(duì)照組(Ctrl)(P<0.01)。表明慢病毒已成功感染卵巢癌細(xì)胞,并干擾PXN基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。見圖5。

圖5 驗(yàn)證PXN基因敲減效果A、B:Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞paxillin蛋白表達(dá);C:RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞PXN mRNA表達(dá);Mock:空白對(duì)照組,Ctrl:陰性對(duì)照組,shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,****P<0.0001

2.2.2 敲減PXN基因抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移侵襲能力 劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到24h時(shí),PXN敲減組(shPXN)的劃痕愈合面積明顯少于空白對(duì)照組(Mock)和陰性對(duì)照組(Ctrl),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖6A)。表明敲減PXN基因抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞愈合能力、遷移能力。

圖6 各組SKOV3細(xì)胞遷移侵襲能力A:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè);B:PXN敲減后SKOV3細(xì)胞遷移數(shù)改變;C:PXN敲減后SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)改變;Mock:空白對(duì)照組;Ctrl:陰性對(duì)照組;shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組(Mock)和陰性對(duì)照組(Ctrl)比較,PXN敲減組(shPXN)穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖6B、C)。表明敲減PXN基因可抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3體外遷移侵襲能力。

2.3PXN基因?qū)β殉舶┗熌退幍臐撛谟绊慞XN高表達(dá)組中順鉑及紫杉醇的IC50值明顯高于PXN低表達(dá)組(P<0.001),而吉西他濱及多柔比星的IC50值明顯低于PXN低表達(dá)組(P<0.0001)。腫瘤細(xì)胞(PXN高表達(dá)組及PXN低表達(dá)組)中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細(xì)胞(P<0.0001),吉西他濱及多柔比星的IC50值高于正常卵巢細(xì)胞(P<0.0001)。見圖7。

圖7 PXN基因表達(dá)水平對(duì)藥物IC50的影響A:不同組別順鉑的IC50;B:不同組別紫杉醇的IC50;C:不同組別吉西他濱的IC50;D:不同組別多柔比星的IC50;1:PXN高表達(dá);2:PXN低表達(dá);3:正常卵巢組織***P<0.001,****P<0.0001

3 討 論

大多數(shù)卵巢癌患者確診時(shí)已為晚期,且70%的晚期上皮性卵巢癌患者會(huì)出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)、生存率極低,因此腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制越來(lái)越引起研究者的重視[10]。本研究發(fā)現(xiàn),36個(gè)遷移侵襲相關(guān)基因(Relevance score>7)在卵巢癌中高表達(dá)(logFC>1和adj.P<0.001),它們可能是潛在的致癌基因,通過(guò)編碼相關(guān)蛋白促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步將基礎(chǔ)研究與臨床特征相關(guān)聯(lián),探索遷移侵襲相關(guān)基因的高表達(dá)與卵巢癌患者總生存時(shí)間是否存在聯(lián)系,對(duì)卵巢癌中高表達(dá)的36個(gè)遷移侵襲相關(guān)基因進(jìn)行了多隊(duì)列生存分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同隊(duì)列中PXN基因高表達(dá)都與患者不良預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。GO/KEGG功能富集分析結(jié)果提示,PXN基因與染色質(zhì)的修飾調(diào)控相關(guān),PXN基因可能通過(guò)干預(yù)轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞的惡性化過(guò)程。

PXN基因編碼的paxillin蛋白分子量大小為68kDa,是整合素調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分,能將肌動(dòng)蛋白連接到富含整合素的細(xì)胞黏附位點(diǎn),在細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞黏附之間起重要作用[11]。多項(xiàng)研究已表明,PXN基因能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能,如PXN基因能通過(guò)維持細(xì)胞間黏附連接完整性來(lái)促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲;通過(guò)增加Src表達(dá)促進(jìn)NF-κB的活化,促進(jìn)卵巢癌血管生成;降低PXN基因表達(dá),抑制ERK信號(hào)通路抑制直腸癌的轉(zhuǎn)移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[12-14]。PXN作為遷移侵襲相關(guān)基因在卵巢癌中的作用機(jī)制尚不清楚,既往研究提示PXN基因可能作為致癌因子促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示,PXN敲減抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的愈合及體外遷移侵襲能力。PXN基因的生物學(xué)功能在其他腫瘤中也得到相應(yīng)的驗(yàn)證,敲減PXN基因抑制胃癌細(xì)胞、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移侵襲[15-17];通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制宮頸癌細(xì)胞增殖與黏附[18];抑制裸鼠體內(nèi)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)[19]。提示PXN基因能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。這與本研究生物信息分析結(jié)果相吻合。PXN基因是卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn),可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附影響細(xì)胞的遷移侵襲能力,其促癌能力或許是卵巢癌患者不良預(yù)后的因素之一。

本研究結(jié)果顯示,PXN高表達(dá)降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性,而吉西他濱和多柔比星或許是更具潛力的備選藥物。但總體來(lái)說(shuō),紫杉醇仍是最優(yōu)選擇,因腫瘤細(xì)胞中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細(xì)胞,或許能最大程度地降低化療藥物對(duì)卵巢癌患者的傷害。

綜上所述,PXN作為遷移侵襲相關(guān)基因在卵巢癌中呈相對(duì)高表達(dá),且與患者不良預(yù)后及對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān),敲減PXN能抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移侵襲,可能是潛在的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)標(biāo)志物。PXN基因調(diào)控卵巢癌遷移侵襲的機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用尚待進(jìn)一步研究,本課題組將在后續(xù)的研究中為晚期卵巢癌的靶向治療尋找更多的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。