熊素雅, 王 寧, 白夢(mèng)天, 康海軍, 林 莉,

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科學(xué)院, 四川 成都, 610075; 2. 四川省遂寧市中心醫(yī)院 眼科中心, 四川 遂寧, 629000)

角膜盲發(fā)病率高居中國(guó)致盲性眼病第2位,角膜移植手術(shù)是治療角膜盲的有效方法,但因角膜供體嚴(yán)重匱乏,許多角膜盲患者缺少重獲光明的機(jī)會(huì),因此尋找新的角膜供體材料成為眼科界的關(guān)注熱點(diǎn)[1]。角膜基質(zhì)透鏡是角膜組織的一部分,由有序排列的膠原纖維和角膜基質(zhì)細(xì)胞組成,沒有血管和淋巴組織,可作為一種免疫排斥反應(yīng)較小的角膜移植材料應(yīng)用。研究[2-3]發(fā)現(xiàn),飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(SMILE)來源的角膜基質(zhì)透鏡最大程度地保留了角膜組織的理化特性,學(xué)者們將其用來治療角膜潰瘍、圓錐角膜、角膜營(yíng)養(yǎng)不良等眼科疾病,并證實(shí)其安全有效。因角膜移植術(shù)前需進(jìn)行傳染病篩查、供體和受體需在同一天完成手術(shù)等因素限制,致使大多新鮮透鏡不能及時(shí)應(yīng)用于臨床而被丟棄。故如何保存角膜基質(zhì)透鏡,維持其膠原纖維結(jié)構(gòu)完整性、透明度和降低免疫原性并延長(zhǎng)其保存時(shí)間等,成為了研究熱點(diǎn)。本文就SMILE來源的角膜基質(zhì)透鏡的保存方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 超低溫冷凍保存

超低溫冷凍保存技術(shù)是指在活細(xì)胞、角膜組織或其他生物樣本中添加冷凍保護(hù)劑(如二甲亞砜、丙二醇和聚乙二醇等),使其在冷凍過程中免受或減少一系列低溫?fù)p傷(冰晶損傷、滲透損傷和溶質(zhì)損傷等)的影響,并通過緩慢冷凍、快速冷凍或玻璃化方法將樣本降至超低溫(-80 ℃或-196 ℃)進(jìn)行保存,在需要的時(shí)候,以適當(dāng)?shù)姆椒◤?fù)溫、解凍,并去除冷凍保護(hù)劑進(jìn)行使用[4-5]。在超低溫環(huán)境中,細(xì)胞生長(zhǎng)活動(dòng)及物質(zhì)代謝幾乎停止,可避免代謝產(chǎn)物積聚所帶來的毒性作用,也可抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖,故超低溫冷凍保存法在醫(yī)學(xué)上運(yùn)用廣泛[4]。有研究證實(shí),超低溫冷凍保存角膜基質(zhì)透鏡有效可行, MOHAMED-NORIEGA K等[6]將-80 ℃下保存1個(gè)月的透鏡和新鮮透鏡進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)2組的膠原纖維都保存完好,且存在有活性的角質(zhì)細(xì)胞,2組中分離出的角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)和增殖率沒有顯著差異,證實(shí)-80 ℃冷凍保存1個(gè)月的透鏡與新鮮角膜組織相似。韋琦等[7]對(duì)比觀察-80 ℃中保存1、24、60及84個(gè)月的透鏡,發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間延長(zhǎng),膠原排列逐漸紊亂、細(xì)胞變形皺縮明顯,但各組的透光率及凋亡率無顯著差異,說明-80 ℃可長(zhǎng)期保存透鏡。不過該研究尚未明確透鏡膠原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的時(shí)間節(jié)點(diǎn),以及缺乏將長(zhǎng)期保存的透鏡用于臨床治療的相關(guān)研究。RIAU A K等[8]發(fā)現(xiàn)在-196 ℃下,短期(3個(gè)月)和長(zhǎng)期保存(12個(gè)月)的透鏡較新鮮透鏡透明度顯著降低,之后將冷凍保存的透鏡植入兔角膜中,隨訪觀察16周發(fā)現(xiàn)2組均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)及炎癥反應(yīng),且角膜透明度均接近術(shù)前,提示-196 ℃長(zhǎng)期冷凍保存透鏡可行。研究[9-11]表明,植入經(jīng)超低溫冷凍保存的透鏡或新鮮透鏡,在后期的傷口愈合過程并無顯著差異,證實(shí)再植入超低溫冷凍保存的透鏡治療部分眼部疾病安全有效。高穎等[12]將-80 ℃下保存30 d以上的透鏡用于治療3例角膜變性和2例角膜潰瘍患者,術(shù)后隨訪6個(gè)月,發(fā)現(xiàn)透鏡植片與植床均貼合良好,且植片保持透明,無感染及排斥反應(yīng)等并發(fā)癥發(fā)生。上述研究均表明,將超低溫冷凍保存的角膜透鏡組織用于臨床安全可行,且能夠保持角膜組織的透明性。

但也有學(xué)者[13]提出,該技術(shù)本身會(huì)影響組織的微觀結(jié)構(gòu),對(duì)將超低溫冷凍保存的透鏡用于眼科疾病的治療存在疑慮,目前還缺乏關(guān)于移植角膜基質(zhì)透鏡的遠(yuǎn)期并發(fā)癥的相關(guān)研究。RIAU A K等[14]使用與MOHAMED-NORIEGA K等[6]相同的方法保存透鏡,發(fā)現(xiàn)1個(gè)月后透鏡出現(xiàn)組織水腫及清晰度降低,認(rèn)為可能與透鏡內(nèi)的液體平衡改變有關(guān),同時(shí)將其植入靈長(zhǎng)類動(dòng)物眼中,出現(xiàn)短期角膜水腫,推測(cè)人類也可能會(huì)出現(xiàn)類似情況,故為避免此現(xiàn)象影響透鏡臨床應(yīng)用,建議超低溫保存的時(shí)間盡量控制在1個(gè)月以內(nèi)。此外,超低溫冷凍保存法所需設(shè)備昂貴、存儲(chǔ)過程復(fù)雜以及對(duì)技術(shù)人員要求高,導(dǎo)致該方法在基層醫(yī)院開展受限,因此需要優(yōu)化透鏡的保存,以便提高透鏡的利用率。

2 介質(zhì)保存

為降低保存透鏡的成本并優(yōu)化存儲(chǔ)過程,有研究嘗試用角膜活性中期保存液(DX液)、甘油、硅油和變色硅膠等不同介質(zhì)來保存角膜基質(zhì)透鏡,并取得了良好效果,但不同保存介質(zhì)各有優(yōu)缺點(diǎn),實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)不同需求進(jìn)行選擇。DX液由山東省眼科研究所自主研制,以細(xì)胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液,添加了皮質(zhì)類固醇,與Optisol液相比,配制簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,可以降低角膜組織保存過程中的代謝,但有效期短(為配制后1周)[15]。甘油具有優(yōu)異的脫水和抗菌特性,聯(lián)合低溫保存時(shí),可維持組織的膠原板層結(jié)構(gòu)并去除生物源性[16], 因此被認(rèn)為是一種理想的透鏡保存介質(zhì),但較適合1個(gè)月內(nèi)的短期保存。硅油具有無毒、不揮發(fā)、疏水性和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等一系列優(yōu)異的理化性質(zhì),可以與外界環(huán)境達(dá)到很好的隔離效果,因此有研究[17]用硅油作為介質(zhì)來保存透鏡,但存在從硅油取出透鏡洗滌時(shí)不易洗凈的問題。變色硅膠可去除角膜組織中的水分、防止細(xì)胞酶失活和抑制細(xì)胞自溶,從而保持角膜組織的完整性[18]。ROMANO V等[19]將在室溫下用硅膠保存2周的角膜基質(zhì)復(fù)水后,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)透鏡仍保留其分子和生物力學(xué)特性,建議用此方法保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)低的供體或角膜內(nèi)皮移植術(shù)等手術(shù)后剩余的角膜組織,以便后期用于深板層角膜移植術(shù),從而增加角膜供體數(shù)量。

田樂等[16]對(duì)比觀察4 ℃ DX液與-20 ℃甘油保存透鏡的效果,發(fā)現(xiàn)DX液保存1周的透鏡膠原纖維排列規(guī)則致密、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,而甘油中保存1 d就出現(xiàn)基質(zhì)組織水腫、細(xì)胞核裸露,1周后細(xì)胞分布稀疏、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,說明在保存時(shí)間為1周內(nèi)時(shí),DX液在維持透鏡組織結(jié)構(gòu)的完整性方面優(yōu)于甘油。但以上研究?jī)H進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)且保存時(shí)間較短,在眼科疾病治療中的研究仍需進(jìn)一步完善。LIANG G等[18]探索無水甘油、變色硅膠和Optisol培養(yǎng)基保存透鏡的效果,發(fā)現(xiàn)2周后, Optisol培養(yǎng)基組在保持基質(zhì)細(xì)胞活性、透鏡透明度和結(jié)構(gòu)完整性上優(yōu)于無水甘油和變色硅膠,但Optisol培養(yǎng)基成本顯著高于無水甘油、變色硅膠,因而限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。XIA F等[17]比較無水甘油、硅油和變色硅膠對(duì)透鏡透光率和超微結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)3種保存介質(zhì)均可用于透鏡保存,4周后硅膠在維持透鏡透光率方面效果更好,這與李文娟等[20]研究結(jié)果一致。然而該研究?jī)H探索了透光率和超微結(jié)構(gòu)變化,缺乏免疫原性和生物力學(xué)特性的相關(guān)研究。LIU Y C等[21]將透鏡分別在磷酸鹽緩沖液、DMEM、Optisol GS和無水甘油共4種介質(zhì)中保存48 h,結(jié)果顯示,各組透鏡均保持較高的透明度、結(jié)構(gòu)完整性和低免疫原性,說明在無法立即將透鏡進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存于大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備前,或轉(zhuǎn)運(yùn)至基層醫(yī)院應(yīng)用時(shí),可用此法進(jìn)行臨時(shí)保存48 h。研究[17-18]發(fā)現(xiàn),甘油保存的透鏡表現(xiàn)出更嚴(yán)重的水腫和更稀疏的膠原排列,但LIU Y C等[21]將透鏡在甘油中保存時(shí),發(fā)現(xiàn)透鏡仍保持良好膠原纖維排列,XIA F等[17]認(rèn)為這可能與其研究中相對(duì)較短的保存時(shí)間有關(guān)。

Optisol液因成本、來源和保存期等因素限制,目前在中國(guó)難以廣泛應(yīng)用,而甘油成本低且室溫保存時(shí)能保持透鏡透明度和超微結(jié)構(gòu)特征,在低溫下比Optisol液更具優(yōu)勢(shì)[22]。

3 超低溫冷凍聯(lián)合介質(zhì)保存

盡管角膜被認(rèn)為是相對(duì)免疫赦免的器官,但角膜基質(zhì)透鏡移植仍存在排斥風(fēng)險(xiǎn),為探索降低抗原性的有效保存方法,許多學(xué)者借助角膜保存液、硅油、甘油等不同介質(zhì)聯(lián)合超低溫冷凍技術(shù)來保存透鏡[23]。SHANG Y F等[24]將透鏡分為新鮮組、-78 ℃無水甘油保存組和0.1%十二烷基硫酸鈉脫細(xì)胞組進(jìn)行免疫組化、透光率檢測(cè)及透射電鏡觀察,結(jié)果表明,-78℃無水甘油保存是減少抗原性而不破壞透鏡結(jié)構(gòu)和光學(xué)性能的理想方法。相關(guān)研究[25]將透鏡置于室溫和4、-20、-80 ℃的無水甘油中保存3個(gè)月,發(fā)現(xiàn)-80 ℃組的透光率接近于新鮮透鏡且抗原性減少,而其他組的透光率均顯著降低,提示-80 ℃無水甘油中保存為最佳方法。薛春燕等[26]用-80 ℃無水甘油中保存的透鏡治療5例角膜潰瘍穿孔患者,發(fā)現(xiàn)僅1例真菌性角膜潰瘍患者在術(shù)后1個(gè)月因植片融解壞死,而更換了新的植片,其余患者創(chuàng)面均愈合良好; 此外,劉嫻[27]用-80 ℃無水甘油中保存的透鏡聯(lián)合羊膜移植治療14例真菌性角膜潰瘍患者,其術(shù)后潰瘍炎癥消退、前房形成良好,雖然隨訪時(shí),此研究中多數(shù)植片處于半透明狀,但其可有效控制炎癥進(jìn)展,并為后期光學(xué)性角膜移植創(chuàng)造條件。上述研究表明, -80 ℃下無水甘油保存的透鏡單獨(dú)或聯(lián)合羊膜應(yīng)用治療角膜潰瘍的短期療效是安全可靠的。雖然許多研究證實(shí),超低溫冷凍聯(lián)合介質(zhì)保存法較單純超低溫冷凍保存及介質(zhì)保存法能有效降低透鏡的免疫原性,并在維持透鏡透光率和膠原纖維結(jié)構(gòu)完整性方面具有優(yōu)勢(shì),但這些研究存在樣本量較小且隨訪時(shí)間較短等局限,還需擴(kuò)大樣本量及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間觀察遠(yuǎn)期療效,以為臨床應(yīng)用提供參考。

4 去細(xì)胞化保存

有研究利用物理、化學(xué)和輻射等方法去除透鏡的細(xì)胞成分,消除其免疫原性的同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì),然后在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存于角膜基質(zhì)透鏡庫(kù)特定介質(zhì)中,在需要時(shí)運(yùn)送至醫(yī)院使用,另有研究表明在透鏡移植后受體自身的細(xì)胞會(huì)逐漸遷移植入透鏡中,進(jìn)一步揭示了去細(xì)胞化法在臨床應(yīng)用中的可行性[28-29]。去細(xì)胞化法因可降低透鏡免疫原性和便于長(zhǎng)期保存等優(yōu)勢(shì)極大提高了透鏡的臨床應(yīng)用潛力,可能是透鏡保存的研究熱點(diǎn)。但該方法過程復(fù)雜,設(shè)備要求高,暫未廣泛使用而且在中國(guó)一些患者無法負(fù)擔(dān)其費(fèi)用。盡管如此,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的更迭,未來去細(xì)胞化法保存透鏡仍將有廣闊的發(fā)展前景。

5 營(yíng)養(yǎng)膠囊保存

近期, ZHAO J等[30]受天然人類淚膜成分的啟發(fā),構(gòu)建了1種能夠維持淚膜穩(wěn)態(tài)的營(yíng)養(yǎng)水凝膠膠囊,用于中期保存角膜基質(zhì)透鏡,最長(zhǎng)保存長(zhǎng)28 d后,營(yíng)養(yǎng)膠囊組活細(xì)胞比例、透光率及膠原纖維數(shù)量均高于傳統(tǒng)甘油組,且膠原纖維排列更為整齊規(guī)律,目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于臨床。在人類同種異體移植研究中,植入的透鏡無排斥反應(yīng)且保持透明,術(shù)后70%的患者矯正遠(yuǎn)視力有所提高,營(yíng)養(yǎng)膠囊保存為透鏡及其他活體組織的保存與臨床再利用帶來了新的可能。

6 總結(jié)與展望

人角膜基質(zhì)透鏡的再利用為角膜疾病的治療提供了新思路。研究表明,當(dāng)條件允許時(shí),可選擇超低溫冷凍聯(lián)合介質(zhì)保存法,其可降低透鏡免疫原性并可長(zhǎng)期保存。在設(shè)施不完善的情況下,介質(zhì)保存(如DX液、甘油、硅膠等)仍是首選方法,去細(xì)胞化法及營(yíng)養(yǎng)膠囊保存法目前未能廣泛使用,但隨著制備工藝的精進(jìn)與簡(jiǎn)化,去細(xì)胞化法及營(yíng)養(yǎng)膠囊保存法有望成為透鏡保存的理想方法。目前,尚無可以完全滿足臨床需求的保存方法,因此需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)研究,探討可長(zhǎng)期保存且能維持角膜透鏡特性及運(yùn)輸方便、技術(shù)簡(jiǎn)單且費(fèi)用低廉,并適合中國(guó)現(xiàn)階段角膜基質(zhì)透鏡庫(kù)和醫(yī)療情況的保存方法。相信隨著更全面、深入的研究和更多規(guī)范化角膜基質(zhì)透鏡庫(kù)的運(yùn)行, SMILE來源的角膜基質(zhì)透鏡將會(huì)得到更好的再利用,從而為角膜病患者帶來光明與希望。