郭晉祥 魏攀 呂會茹 李姣鋒 王開武 張紅

(洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 1內(nèi)科教研室,河南 洛陽 471000;2生物化學(xué)教研室;3藥理學(xué)教研室;4河南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;5鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

乳腺癌發(fā)病率和致死率在女性惡性腫瘤中分別居首位和第二位,已成為全球性的治療問題〔1〕。盡管目前臨床上相對早期和部分局部晚期乳腺癌患者經(jīng)手術(shù)和(或)放化療治療后預(yù)后良好,然而乳腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移依然棘手,同時放化療手段常常導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用,影響患者的治療效果〔2～4〕。此外,乳腺癌發(fā)病的年輕化趨勢及患者對治療后生活質(zhì)量要求的不斷提高,對相關(guān)治療藥物的開發(fā)提出了更高要求。金絲桃苷是黃酮醇苷類化合物,既往研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷具有抗炎、抗腫瘤等廣泛藥理作用,對包括肺癌在內(nèi)的多種實體腫瘤具有抑制活性〔5～7〕,但金絲桃苷對乳腺癌的作用鮮有報道。本研究旨在觀察金絲桃苷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及對乳腺癌生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及實驗動物 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)。Balb/c品系裸鼠16只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),SPF級,8～10周齡,體質(zhì)量25～30 g。

1.2主要試劑 金絲桃苷(純度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),熱休克蛋白(HSP)90α家族A類成員(HSP900AA)1過表達(dá)質(zhì)粒(優(yōu)寶生物),兔抗人HSP900AA1一抗(武漢菲恩生物科技有限公司),兔抗鼠Ki67一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗(美國CST公司),CCK-8檢測試劑盒(美國Abbkine公司),Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),Transwell小室(美國Corning公司)。

1.3金絲桃苷治療乳腺癌相關(guān)靶點篩選 利用SwissTarget數(shù)據(jù)庫和TargetNet數(shù)據(jù)庫預(yù)測金絲桃苷的作用靶點,利用GeneCards數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)橄侔┫嚓P(guān)靶點以篩選金絲桃苷治療乳腺癌作用靶點。

1.4金絲桃苷-乳腺癌靶點蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的金絲桃苷和乳腺癌的靶點取交集,并使用STRING平臺構(gòu)建金絲桃苷治療乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)一步使用Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行可視化。

1.5基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析靶點基因與乳腺癌臨床表型的關(guān)系 利用Uaclan在線分析篩選出TCGA數(shù)據(jù)庫中在乳腺癌組織中表達(dá)差異及與生存相關(guān)的基因。下載TCGA_BRCA數(shù)據(jù)矩陣和臨床信息,分析HSP900AA1表達(dá)及與乳腺癌臨床特征的關(guān)系。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 分別取MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待匯合率達(dá)85%以上傳代培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000將HSP900AA1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞。

1.7裸鼠成瘤實驗 取MCF-7細(xì)胞約1×107個重懸于100 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,注射到裸鼠的第四對乳房墊誘導(dǎo)乳腺癌移植瘤;將16只裸鼠隨機分為Control組和Hyperoside組各8只,Hyperoside組經(jīng)腹腔注射50 mg/kg金絲桃苷,1次/2 d,共14 d;Control組注射等量生理鹽水。每間隔2 d測量移植瘤體積(V),V=0.5×L×W2,L和W分別為測得的瘤體長、寬;治療結(jié)束后處死裸鼠,剝離瘤體,并采用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測移植瘤組織中Ki67表達(dá)。

1.8CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞以約3 000個/孔密度接種至96孔板,放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后,MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度金絲桃苷(75和100 μmol/L)處理,分別于繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后,用細(xì)胞培養(yǎng)基1∶100稀釋CCK-8試劑,加入100 μl的稀釋液培養(yǎng)1 h后測定450 nm處各孔吸光度。

1.9Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 將MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)密度為1×105個/ml。于Transwell小室上室加入200 μl細(xì)胞懸液,下室加入600 μl含有不同濃度金絲桃苷(75和100 μmol/L)的10% FBS的培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后使用結(jié)晶紫染色小室下層細(xì)胞并計數(shù)。

1.10劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 將MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞接種至6孔板,5×105個/孔,待細(xì)胞鋪滿孔后利用200 μl移液槍頭劃一平直線,PBS清洗后顯微鏡觀察劃痕區(qū)域?qū)挾炔⑴恼铡Ｈ缓髮CF-7、MDA-MB-231細(xì)胞置于含有不同濃度金絲桃苷(75和100 μmol/L)的2% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,再次觀察劃痕寬度變化并拍照,Image Pro測量劃痕寬度。

1.11Western印跡檢測蛋白表達(dá) 收集處理后的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞,PBS沖洗后冰上裂解提取總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白樣品后,取40 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,以β-actin為內(nèi)參,加入HSP90AA1一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后加二抗室溫下孵育2 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色,ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.12統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析,兩兩比較使用SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測金絲桃苷治療乳腺癌靶點 共獲得金絲桃苷-乳腺癌交集靶點24個,利用這24個生物靶點使用STRING工具繪制金絲桃苷治療乳腺癌的最佳PPI網(wǎng)絡(luò)(圖1)。

圖1 金絲桃苷-乳腺癌交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

利用Ualcan在線工具分析這24個基因在乳腺癌中表達(dá)水平。結(jié)果表明,有ESR2、HSP90AA1、TOP1、PTPN1、DNMT1、CDC25B、FLT3、ESR1、MIF、TERT、CA 9共11個基因在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)。對這11個基因進(jìn)一步進(jìn)行K-M曲線分析,結(jié)果表明熱休克蛋白(HSP)90AA1 ESR1表達(dá)水平與乳腺癌生存狀態(tài)相關(guān)。下載TCGA_BRCA表達(dá)矩陣和臨床信息,乳腺癌組織中HSP90AA1 mRNA表達(dá)(31 320±550)較癌旁組織(23 410±432)明顯上升(P<0.05),HSP90AA1表達(dá)與乳腺癌患者生存相關(guān)(P<0.05,圖2),且隨著T分期〔Ⅰ～Ⅱ期(28 210±764) vs Ⅲ～Ⅳ期(32 430±690)〕和臨床分期〔T1(30 620±560) vs T2～4(33 530±1 472)〕進(jìn)展,HSP90AA1表達(dá)水平依次升高(P<0.05)。此外,HSP90AA1表達(dá)與乳腺癌預(yù)后〔預(yù)后良好(28 492±1 204) vs 預(yù)后不良(35 174±1 682)〕密切相關(guān)(P<0.05)。本研究選擇HSP90AA1進(jìn)行研究。

圖2 HSP90AA1高表達(dá)和低表達(dá)患者Kaplan-Meier生存曲線

2.2金絲桃苷對乳腺癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲的影響 CCK-8實驗中,乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞活力隨著金絲桃苷濃度升高而逐漸下降,IC50值分別為75.66、98.67 μmol/L。見圖3。與Control組比較,金絲桃苷明顯抑制MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖、明顯增加劃痕寬度,明顯減少侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05)。見表1、圖4、表2。

表1 金絲桃苷對乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響

表2 兩組乳腺癌細(xì)胞劃痕寬度、侵襲細(xì)胞數(shù)比較

圖3 CCK-8檢測乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞對金絲桃苷治療的敏感性

圖4 金絲桃苷對乳腺癌細(xì)胞體外遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.3金絲桃苷對乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響 與Control組比較,金絲桃苷組腫瘤體積、腫瘤重量明顯下降,移植瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01,P<0.001)。見圖5、表3。

表3 兩組移植瘤體積、重量及瘤組織中Ki67蛋白比較

圖5 金絲桃苷對乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響(IHC,×400)

2.4金絲桃苷抑制HSP90AA1的表達(dá) 金絲桃苷在體外呈濃度、時間依賴性抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞HSP90AA1蛋白表達(dá)(P<0.05),見表4、5,圖6。

表4 不同濃度金絲桃苷對HSP90AA1表達(dá)的影響

表5 不同金絲桃苷處理時間對HSP90AA1表達(dá)的影響

圖6 Western印跡檢測不同濃度、處理時間金絲桃苷對HSP90AA1表達(dá)的影響

2.5金絲桃苷抑制HSP90AA1對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 與Control組比較,MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSP90AA1過表達(dá)質(zhì)粒后,HSP90AA1蛋白表達(dá)顯著上調(diào),并促進(jìn)其細(xì)胞活力、劃痕寬度明顯增大,侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05);金絲桃苷處理顯著抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的活力、增大劃痕寬度、減少侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05),而恢復(fù)HSP90AA1表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)金絲桃苷的上述抑癌功能(P<0.05),見表6、圖7、圖8。

表6 各組乳腺癌HSP90AA1蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、劃痕寬度及侵襲細(xì)胞數(shù)比較

圖7 各組細(xì)胞遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

1～4：Control組、金絲桃苷組、HSP90AA1組、金絲桃苷+HSP90AA1組圖8 Western印跡檢測4組HSP90AA1蛋白表達(dá)

3 討 論

以往研究已經(jīng)證實金絲桃苷對多種腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性〔6,7〕,然而由于腫瘤的異質(zhì)性,金絲桃苷對乳腺癌細(xì)胞的作用尚不清楚。HSP90AA1屬于HSP90家族成員。HSP90AA1經(jīng)歷了一個與其ATP酶活性相關(guān)的功能循環(huán),這個周期可能引起特定蛋白的構(gòu)象變化,從而引起其激活。此外,HSP90AA1可以與多種共同伴侶相互作用,調(diào)節(jié)其底物識別、ATP酶周期和伴侶功能〔8,9〕。在眾多惡性生長和侵襲性腫瘤樣本中檢測到高水平的HSP90AA1表達(dá)〔10〕。近年來利用蛋白組學(xué)等方法獲得在腫瘤與正常組織中的差異表達(dá)分子或基因,有助于指導(dǎo)相關(guān)靶向藥物的研發(fā)。有研究者應(yīng)用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),HSP90AA1 mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),且其高表達(dá)與較短的總生存期和無進(jìn)展生存期密切相關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果與賈真等〔11〕研究結(jié)果相一致。

腫瘤細(xì)胞的增殖能力異常使得腫瘤能在體內(nèi)能非正常生長〔12〕。之前的報道〔13〕顯示,金絲桃苷能抑制肺癌細(xì)胞的增殖與遷移。在本研究體外細(xì)胞實驗中,金絲桃苷呈劑量依賴性抑制了MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖速率。研究〔14,15〕表明,Ki67是反映細(xì)胞增殖能力的重要標(biāo)志,本研究提示金絲桃苷可能通過內(nèi)源性途徑抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究進(jìn)一步證實金絲桃苷具有明顯的抗腫瘤活性。本研究結(jié)果表明,HSP90AA1是金絲桃苷抗乳腺癌的重要功能靶點。

綜上,HSP90AA1在乳腺癌表達(dá)上調(diào),并與乳腺癌分期晚和不良預(yù)后密切相關(guān);此外,金絲桃苷能抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲,其機制與抑制HSP90AA1表達(dá)有關(guān)。