劉望龍

（豐凱利醫(yī)療器械〈上海〉有限公司，上海，201318）

0 引言

抗凝血生物材料作為生物材料的重要組成部分，已被廣泛應用于與人類血液和組織相接觸的醫(yī)療器械上，如體外循環(huán)系統、心臟起搏器、人工血管等［1］。以特定的工藝將抗凝血材料涂敷于基體材料表面，使其具有良好的抗凝血功能和血液相容性，已被證實可有效降低血液接觸類醫(yī)療器械表面血栓形成的風險。

1 抗凝血材料的研究進展

抗凝血材料也叫血液相容性材料，系材料在與血液直接接觸時不會引起血液凝固，同時可以正常發(fā)揮其性能的一類生物材料。目前，已有研究證實具有抗凝血功能的材料主要包括無機材料、兩性離子聚合物材料和生物活性材料。

1.1 無機材料

類金剛石（DLC）是一種由碳元素構成，在物理性能上和鉆石類似，微觀結構由石墨原子組成的物質。DLC涂層是一種非晶態(tài)薄膜，具有許多優(yōu)點，包括超高強度、低摩擦系數、化學穩(wěn)定性和高導熱性，以及優(yōu)良的生物相容性和血液相容性。在室溫條件下，DLC薄膜（或涂層）可以在較溫和的環(huán)境下利用一定技術手段使石墨小分子沉積在基材上形成，而且絕大部分材料表面均可制備DLC薄膜［2］。與碳鈦合金、氧化鈦、聚晶金剛石和膨脹聚四氟乙烯等其他常用于制備醫(yī)療器械的材料相比，DLC涂層表面優(yōu)良的疏水性和光滑性使血小板黏附性最低，血液相容性最優(yōu)［3］。不過，DLC涂層是一種超硬涂層，適用于金屬等較硬材料表面，當材料使用時發(fā)生彎折或形變，涂層存在出現開裂的風險，故不適合高分子彈性材料或有機塑料材料表面。

1.2 兩性離子聚合物材料

磷酸膽堿（PC）是一種類似于生物膜表面結構的磷脂類聚合物，也是構成血紅細胞外膜的主要成分，具有優(yōu)異的血液相容性和穩(wěn)定性。2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿（MPC）具有磷酰膽堿基團，MPC聚合得到的兩性離子聚合物已被證實具有良好的血液相容性，其抗凝作用主要通過增加聚合物中游離水的量來形成“水合層”以減少蛋白質吸附，從而完全抑制血小板黏附和激活，即使聚合物與沒有抗凝劑的人血接觸時也能夠保持血液相容性和抗蛋白質吸附的特性［4］?；诖耍诨撞牧媳砻嬷苽湟粚覯PC聚合物薄膜可以顯著增強材料的抗凝血性能［5］。

1.3 生物活性材料

肝素是一種天然抗凝血藥物，最早被用來制備具有抗凝血作用的生物活性材料。醫(yī)學研究表明，血漿中加入肝素成分可以有效抑制促凝血蛋白酶Xa因子和凝血酶的活性以阻止纖維蛋白凝塊的形成，從而達到抗凝血的功效［6，7］。在材料表面形成一層肝素化涂層可以防止血小板黏附并降低其活性，從而提高材料的血液相容性。傳統的肝素涂層一般采用物理涂覆的方法附著在材料表面。物理涂覆的通常做法是通過靜電自組裝作用先在材料表面形成一層聚乙烯亞胺薄膜，然后利用離子相互作用使肝素吸附在表面［8］。但這種方法制備的抗凝涂層穩(wěn)定性較差，肝素易脫落，因此在很大程度上限制了使用時間。

近些年來，采用化學接枝方法的研究越來越多?；瘜W接枝采用等離子處理、共價鍵結合等方法使材料表面形成含肝素成分的聚合物涂層。這種方法制備的抗凝涂層牢固度很好，其抗凝血特性可保持長達幾個月甚至更久［9，10］。因此，通過共價鍵固定的肝素涂層是一個解決材料抗凝的好方法，但這項技術所涉及的化學過程和操作比較復雜［11］?；诖?，本文重點介紹了一種材料表面肝素化設計的方案，通過表面接觸角測試追蹤實驗每個步驟以保證過程的準確性，通過血小板吸附實驗和體外PTT測試證實表面肝素化的材料具有良好的抗凝血特性。

2 一種表面肝素化抗凝血材料的制備方法

聚醚酰胺嵌段共聚物（pebax）具有良好的力學性能、化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，是一種已被廣泛應用于微創(chuàng)介入領域的生物高分子材料。以pebax材料為例，在其表面制備“肝素化涂層”，可實現pebax材料導管抗凝血的性能。

2.1 實驗部分

2.1.1 材料表面氨基化

配制3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）5%（V/V %）的溶液，溶劑96%乙醇/水，同時加入2～3滴乙酸做保護劑。

把pebax導管清洗干凈后真空干燥，使用等離子設備（O2氛圍，60W，300s）將導管活化，然后浸沒到APTMS溶液中，在37℃水浴條件下反應2h，過程通過測試材料表面接觸角來判斷表面活化和氨基化的效果。

2.1.2 接枝聚N-羥基琥珀酰亞胺甲基丙烯酸酯（PNHSMA）

配制PNHSMA溶液80mg/mL，采用三氟乙醇做溶劑，加入7%（V/V %）三乙胺做催化劑。

把第一步得到的導管加入溶液中，室溫下反應24h。反應結束后，依次用乙醇、去離子水清洗干凈。

2.1.3 接枝聚乙烯亞胺（PEI）

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配制PEI（MW 70000）溶液10mg/mL，采用三氟乙醇做溶劑，加入1%（V/V %）三乙胺做催化劑。

把導管浸泡在溶液中，室溫下反應24h。依次用乙醇、去離子水清洗干凈。

2.1.4 pebax材料表面肝素化

取一定量嗎啉乙磺酸（MES，分散劑），配置其緩沖液11mg/mL；加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽（磺基-NHS，催化劑），1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCl，活化劑）和肝素鈉鹽，三者摩爾比是1：1：2.5；把pebax導管浸泡在溶液中，室溫下反應24 h；反應結束后，用去離子水充分清洗，以確保將物理吸附在材料表面的肝素及其他成分清洗干凈。真空干燥，待測。

2.2 測試結果與分析

2.2.1 表面接觸角測試

在實驗過程中，涉及多種基團的化合物或聚合物的接枝，材料表面的接觸角也會發(fā)生變化。測試結果見表1。

表1 導管表面的水接觸角

利用靜態(tài)接觸角測量追蹤實驗過程的每個步驟。pebax導管表面最初的水接觸角是83°，經過等離子活化處理后，接觸角降至47°，這說明材料表面形成了一層親水的羥基基團。當接枝完APTMS時，材料又形成一層氨基化表面，接觸角升高至80°。繼續(xù)接枝一層PNHSMA聚合物，接觸角變化不大。當接枝完偏親水性的PEI，接觸角降低至64°。繼續(xù)接枝親水性的肝素大分子，接觸角降低至26°，這與之前一些研究報告的結果相符合［12］。

血小板具有與其他物質表面黏著的特性。當材料表面與血液相接觸時，會逐漸吸附血小板，引起血小板的聚集。這一變化是導致血栓形成的重要原因。因此，材料表面抗血小板黏附的性能是衡量材料抗凝血性能的一個重要指標［13］。

把導管加入血小板血漿中，37℃條件下浸泡1h，結束后使用PBS緩沖溶液（pH 7.4）洗滌3次，再在戊二醛溶液（2.5%）中浸泡30 min。依次在不同濃度（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）的乙醇溶液中各浸泡30 min，以逐級脫水。干燥后噴金，使用掃描電鏡觀察材料表面血小板的黏附情況。為方便對比，同時加一組無涂層的pebax導管作為空白樣。實驗結果如圖1。

圖1 pebax材料表面SEM掃描圖

經過l小時的血小板吸附實驗可以觀察到，空白導管表面有大量血小板黏附，而且呈現出聚集趨勢。與此同時，帶肝素涂層的材料表面僅僅有少量的血小板吸附，而且很分散。由此可見，采用多步接枝使材料表面肝素化的方法，可顯著提高材料的抗凝血性能。

2.2.3 體外抗凝血測試

當材料表面與血液接觸時可激活內源性凝血通路，引起血漿中與凝血酶相關的抗凝血酶Ⅲ復合物（TAT）和β -血小板球蛋白水平的提高，因此，通過測定這些指標，可以判斷凝血通路被激活的程度。PTT是測定內源性凝血通路激活常用的方法［14］，可通過凝血分析儀測定與醫(yī)療器械/材料接觸后血漿的部分凝血活酶時間。

采集新鮮的抗凝兔全血（采集4h內），離心獲得上層血漿，顛倒均勻后置于冰上保存?zhèn)溆?。使用不與任何材料接觸的兔全血作為空白對照。把制備的新鮮兔血漿加入試管A和試管B中分裝，取不帶涂層的導管和有肝素涂層的導管分別浸沒在試管A和試管B中，將所有試管輕輕混勻后放在旋轉培養(yǎng)器上，在37± 1C條件下，動態(tài)接觸60min。每管血漿進行兩次重復測試，變異系數≤15%，否則重新進行試驗。取3次結果的平均值為最終結果。溫育結束后將試管中的血漿轉移至預先冰浴的新試管中。使用全自動凝血分析儀分別測定各試管血漿的PTT值。測試結果見表2。

表2 體外凝血時間測試

與空白對照組不與任何材料接觸的血漿相比，不帶涂層的樣品的PTT值為30.2s，變化不大，但帶肝素涂層樣品的PTT值升高至156.2s，這說明肝素涂層對凝血有顯著的延時作用。

通過體外凝血時間測試，進一步證實了利用接枝手段使材料表面肝素化的方法可以有效提高材料的血液相容性，減少血栓的形成。

3 小結

抗凝血材料具有較高的技術門檻，由于國內醫(yī)療器械領域起步晚、產品研發(fā)落后，在過去很長一段時間內，抗凝血材料的應用嚴重依賴于國外廠家的技術服務。但近些年來，隨著我國科學技術的不斷進步和創(chuàng)新，國內在生物醫(yī)用高分子材料，特別是抗凝血材料研究方面取得了很多成果。

2020年，四川大學國家生物醫(yī)學材料工程研究中心開發(fā)了肝素長效抗凝涂層技術，打破了國外技術壁壘，成功應用在 ECMO 系統上，具有良好的組織相容性，能降低血液破壞、減少炎癥反應及延緩血栓形成。2022年，天津大學李雙陽團隊開發(fā)的兩性離子水凝膠材料，有著比天然血管內皮表面更佳的超親水性和超潤滑性，再加上獨特的抗蛋白質吸附功能，成為制備人工血管的理想材料。

當然，每一種抗凝血材料都有自己的優(yōu)勢和劣勢，目前還沒有哪種生物材料表面具有天然血管壁內皮細胞所特有的抗凝血和止血功能。隨著材料科學、醫(yī)學、生物學等學科的發(fā)展與相互滲透，抗凝血材料相關技術會不斷得到開發(fā)與改進，并更多、更有效地應用在醫(yī)療領域，造福更多的心血管疾病患者。