康紹英 劉宇星 趙紅清 李燦 劉蘭 張新

摘 要：實(shí)驗(yàn)采用鄰苯二甲醛和丹磺酰氯兩種柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定奶粉中?；撬岬暮?，并比較了兩種方法的優(yōu)劣。樣品用水溶解除去蛋白質(zhì)后，上清液用鄰苯二甲醛和丹磺酰氯衍生，衍生產(chǎn)物經(jīng)C18反相色譜柱分離，采用高效液相色譜法測(cè)定，以外標(biāo)法定量。兩種衍生化方法靈敏度好、分離度高，均可用于奶粉中?；撬岬臏y(cè)定，但鄰苯二甲醛法具有樣品前處理快、分析時(shí)間短、干擾少等優(yōu)點(diǎn)，是較理想的?；撬釡y(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲醛；丹磺酰氯；柱前衍生；高效液相色譜法；牛磺酸

Comparison of Two Pre-Column Derivatization Methods for the Determination of Taurine in Milk Powder

KANG Shaoying， LIU Yuxing， ZHAO Hongqing， LI Can， LIU Lan*， ZHANG Xin

（Hunan Provincial Institute of Product and Goods Quality Inspection， Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning， Changsha 410017， China）

Abstract： The content of taurine in milk powder were determined by high performance liquid chromatography with two kinds of pre-column derivatization by o-phthalaldehyde dansyl chloride. The advantages and disadvantages of the two methods were compared. After the samples were dissolved with water to remove the protein， the supernatant was derivatized with o-phthalaldehyde and dansyl chloride. The derivatives were separated by C18 reversed-phase column and determined by HPLC and quantified by external standard method. The two derivatization methods have good sensitivity and high resolution and can be used for the determination of taurine in milk powder. However， the o-phthalaldehyde method has the advantages of fast sample preparation， short analysis time and less interference， and is an ideal taurine determination method.

Keywords： o-phthalaldehyde; dansyl chloride; pre-column derivatization; high performance liquid chromatography; taurine

?；撬嵊置?-氨基乙磺酸、牛膽素、牛膽酸，因最早從牛黃中提取出來(lái)而得名。?；撬崾且环N含硫氨基酸，但并不是蛋白質(zhì)的組成成分，這種非蛋白氨基酸不參與體內(nèi)蛋白的生物合成，以游離氨基酸形式存在于人體內(nèi)。作為一種特殊的氨基酸，其對(duì)人體健康非常重要，是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素。研究表明?；撬峋哂斜８卫憽⒔档脱獕?，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗驚厥和心律紊亂、預(yù)防心腦血管疾病、抑制血糖升高、提高免疫力、抗疲勞等生理作用，特別是對(duì)嬰幼兒提高智力發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺(jué)功能以及鈣的吸收有著非常重要的作用，是一種促進(jìn)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)素。研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒如果缺乏?；撬?，會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育緩慢，造成智力低下、視覺(jué)功能紊亂等不良后果。牛磺酸廣泛存在于人和動(dòng)物的腦、心臟、肝、腎及乳汁中。嬰兒主要從母乳中獲得牛磺酸，而牛奶中幾乎不含?；撬?，所以完全由人工喂養(yǎng)的嬰兒，可能會(huì)造成?；撬岬娜狈?，因此嬰幼兒配方奶粉中必須強(qiáng)化添加一定量的牛磺酸。目前我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880—2012）中規(guī)定嬰幼兒調(diào)制乳粉中牛磺酸的允許使用量為0.3～0.5 g·kg-1。

牛磺酸的主要檢測(cè)方法有薄層色譜法[1]、酸堿滴定法[2]、比色法[3]、氨基酸分析儀法[4]以及柱前衍生高效液相色譜法[4-11]等，其中最常見(jiàn)的?；撬釞z測(cè)方法為柱前衍生高效液相色譜法。?；撬岱肿邮街袩o(wú)共軛雙鍵，在紫外區(qū)無(wú)吸收，需經(jīng)衍生加入紫外吸光基團(tuán)方可產(chǎn)生吸收，從而進(jìn)行含量測(cè)定。用于測(cè)定?；撬岬闹饕把苌鷦┯朽彵蕉兹5-7]、丹磺酰氯[4，8]、2，4-二硝基氟苯[9]、異硫氰酸苯酯[10]、9-氯甲酸芴甲酯[11]等。本研究采用鄰苯二甲醛（OPA）和丹磺酰氯（Dansyl-Cl）兩種柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定奶粉中牛磺酸的含量，并比較了兩種方法的優(yōu)劣。兩種衍生化方法靈敏度好、分離度高，均可用于奶粉中牛磺酸的測(cè)定，但實(shí)際樣品分析表明OPA法具有樣品前處理快、分析時(shí)間短、干擾少等優(yōu)點(diǎn)，是較理想的牛磺酸測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試奶粉來(lái)源于流通領(lǐng)域抽取的食品安全監(jiān)督抽檢樣品。

牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心）；甲醇、乙腈、鹽酸甲胺、丹磺酰氯（色譜純，CNW Technologies）；鄰苯二甲醛（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥）；乙硫醇（分析純，F(xiàn)luka Analytical）；硼酸（分析純，上海山浦）；氫氧化鈉（分析純，天津風(fēng)船）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、鹽酸、無(wú)水碳酸鈉、乙酸鈉（分析純，國(guó)藥）。

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；BS224S電子天平、PB-10 pH計(jì)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-500B超聲波清洗機(jī)，昆山美美超聲儀器有限公司；TG16-WS離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

（1）?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取0.050 2 g?；撬針?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取適量?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋制備濃度為1 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1和20 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（3）沉淀劑Ⅰ。稱取15.0 g亞鐵氰化鉀用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（4）沉淀劑Ⅱ。稱取30.0 g乙酸鋅用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（5）0.4 mol·L-1硼酸鈉緩沖液。分別稱取2.48 g硼酸、1.41 g氫氧化鈉用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（6）OPA衍生劑。稱取0.1 g OPA加10 mL甲醇溶解，再加0.1 mL乙硫醇，最后用0.4 mol·L-1硼酸鈉緩沖液稀釋至100 mL容量瓶中。

（7）1 mol·L-1鹽酸溶液。吸取9 mL鹽酸用水定容至100 mL容量瓶中。

（8）0.08 mol·L-1碳酸鈉緩沖液（pH=9.5）。稱取0.424 g無(wú)水碳酸鈉以40 mL水溶解，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5，再用水定容至50 mL容量瓶中。

（9）1.5 g·L-1丹磺酰氯溶液。稱取0.15 g丹磺酰

氯，用乙腈溶解定容至100 mL容量瓶中。

（10）20 g·L-1鹽酸甲胺溶液。稱取2.0 g鹽酸甲

胺，水溶解定容至100 mL容量瓶中。

（11）0.01 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=4.2）。稱取0.820 g乙酸鈉，用水溶解稀釋至1 000 mL容量瓶中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.2 試樣制備

（1）試液提取。稱取1.0 g左右試樣至100 mL容量瓶，加入80 mL 50～60 ℃溫水溶解，充分混勻后超聲提取10 min，冷至室溫。加1.0 mL沉淀劑Ⅰ混勻，再加入1.0 mL沉淀劑Ⅱ混勻，用水定容并充分混勻，提取液于5 000 r·min-1離心10 min，取出上清液待衍生用。該上清液在4 ℃暗處可穩(wěn)定保存24 h。

（2）試液衍生化。①OPA衍生化。準(zhǔn)確吸取上清液2.5 mL、OPA衍生劑2.5 mL于10 mL具塞離心管中搖勻，衍生反應(yīng)2 min后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，立即進(jìn)樣分析，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液從衍生開(kāi)始至上機(jī)分析的時(shí)間應(yīng)盡量保持一致并控制在

5 min內(nèi)。②丹磺酰氯衍生化。準(zhǔn)確吸取上清液、碳酸鈉緩沖液和丹磺酰氯溶液各1.00 mL于10 mL具塞玻璃試管中，充分混勻在室溫條件下避光衍生反應(yīng)2 h（中間振搖1次），加0.10 mL鹽酸甲胺溶液搖勻終止衍生反應(yīng)，避光靜置沉淀取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾待分析用。衍生后的溶液在4 ℃避光條件下可保存48 h。標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品溶液同步衍生。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，

5 μm）；OPA法流動(dòng)相：乙腈∶水=10∶90；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；丹磺酰氯法流動(dòng)相：10 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液∶乙腈=80∶20；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：

1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

在堿性條件下?；撬崤cOPA衍生試劑發(fā)生衍生反應(yīng)，生成具有紫外吸收的衍生產(chǎn)物。衍生產(chǎn)物光譜圖顯示在335 nm處具有最大吸收峰，因此OPA法檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。同樣在堿性條件下?；撬崤c丹磺酰氯發(fā)生衍生反應(yīng)生成具有紫外吸收的衍生產(chǎn)物，該產(chǎn)物在254 nm處具有最大吸收，因此丹磺酰氯法檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

OPA衍生法采用乙腈-水作為流動(dòng)相，并分別考察了30%、20%、10%的乙腈-水對(duì)?；撬岱蛛x的影響，最終選擇10%乙腈-水作為流動(dòng)相，?；撬嵩? min左右出峰，且樣品檢測(cè)無(wú)雜質(zhì)干擾。

丹磺酰氯衍生法首先以10 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液∶乙腈=70∶30為流動(dòng)相，實(shí)際樣品分析時(shí)測(cè)得某奶粉?；撬岷繛闃?biāo)簽標(biāo)示值的2倍，而用OPA衍生法測(cè)得其?；撬岷颗c標(biāo)簽標(biāo)示值一致，進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相比例發(fā)現(xiàn)該衍生方法衍生產(chǎn)物中存在干擾目標(biāo)分析物檢測(cè)的組分，且干擾物衍生產(chǎn)物的光譜圖和牛磺酸衍生產(chǎn)物的光譜圖完全一致，當(dāng)乙酸鈉緩沖液與乙腈的比例為80∶20時(shí)，干擾成分與目標(biāo)物完全分離，測(cè)得奶粉樣品中牛磺酸的含量與標(biāo)簽標(biāo)示含量基本一致，因此丹磺酰氯衍生法以乙酸鈉緩沖液∶乙腈=80∶20為流動(dòng)相。

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 方法的線性范圍及檢出限

將不同質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別采用兩種衍生法衍生后于優(yōu)化的色譜條件下依次進(jìn)樣分析，以分析物峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。由表1可知，兩種方法在1～20 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 9和0.999 6，方法檢出限均為1.5 mg/100 g，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 回收率及重復(fù)性結(jié)果

分別稱取1 g（精確至0.01 g）奶粉試樣于100 mL容量瓶中，以3種濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平各分別制備5份測(cè)試溶液進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算各濃度添加水平的平均測(cè)定值、平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表2可知，兩種方法均可獲得較好的回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.30%。

2.3 兩種方法優(yōu)缺點(diǎn)討論

OPA衍生劑是目前應(yīng)用最為廣泛的測(cè)定?；撬岬闹把苌噭?shí)際樣品檢測(cè)表明OPA衍生法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如OPA衍生劑本身不會(huì)干擾目標(biāo)物的分離檢測(cè)，過(guò)量試劑不必除去；衍生反應(yīng)迅速，

2 min內(nèi)即可完成；衍生產(chǎn)物出峰快，分析一個(gè)樣品僅需10 min。但OPA衍生法的最大缺點(diǎn)是衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，要求衍生反應(yīng)結(jié)束后必須在很短的時(shí)間內(nèi)完成進(jìn)樣分析，且每份樣品的時(shí)間必須保持一致，因此嚴(yán)格控制衍生反應(yīng)時(shí)間及進(jìn)樣分析時(shí)間是獲得較好的重復(fù)性的必備條件；樣品不能批量處理；衍生過(guò)程中需加入乙硫醇，乙硫醇?xì)馕洞笄叶拘暂^大。如色譜儀配備有在線衍生系統(tǒng)，則可實(shí)現(xiàn)在線衍生化反應(yīng)，能夠很好地解決以上缺點(diǎn)。無(wú)在線衍生條件的實(shí)驗(yàn)室，只要衍生時(shí)間和進(jìn)樣時(shí)間控制好，也很容易獲得滿意的重復(fù)性。

衍生劑丹磺酰氯目前也被較多地應(yīng)用于?；撬岬臏y(cè)定中，該衍生法具有前處理操作簡(jiǎn)便、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，其主要優(yōu)點(diǎn)是衍生產(chǎn)物非常穩(wěn)定，在4 ℃可避光保存48 h，樣品能夠批量處理。但此衍生法亦有不足之處，如衍生反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，需要2 h；需加入淬滅劑終止反應(yīng)以除去過(guò)量試劑；衍生產(chǎn)物干擾成分多，色譜分析時(shí)間較長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較了OPA和丹磺酰氯兩種柱前衍生法測(cè)定奶粉中?；撬岬臋z測(cè)方法。結(jié)果表明，兩種方法線性關(guān)系良好，回收率高，靈敏度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，均可用于奶粉中牛磺酸的測(cè)定。但丹磺酰氯法衍生反應(yīng)慢，分析耗時(shí)長(zhǎng)、干擾多。與之相比OPA法具有樣品前處理時(shí)間短、分析時(shí)間短、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，其衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、樣品不能批量處理，但可運(yùn)用在線衍生系統(tǒng)解決，是較為理想的牛磺酸測(cè)定方法。

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