花胤， 方海麗， 劉守勝， 辛永寧， 張梅， 宣世英

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬青島臨床醫(yī)學(xué)院， 青島市市立醫(yī)院 a. 感染性疾病科， b. 臨床研究中心， 山東 青島 266011； 2 青島市第八人民醫(yī)院感染性疾病科， 山東 青島 266000

HBV的復(fù)制可以概括為松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）轉(zhuǎn)化為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），以cccDNA為模板合成RNA中間體，再從RNA中間體逆轉(zhuǎn)錄回rcDNA的過程。cccDNA在HBV復(fù)制過程中高度穩(wěn)定，由此導(dǎo)致HBV的長期慢性感染和較低治愈率［1］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)HBV復(fù)制過程中肝臟內(nèi)存在不同程度的熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）90表達(dá)，并且其表達(dá)水平與乙型肝炎的診斷和分型有密切的關(guān)聯(lián)。隨著對Hsp90在HBV復(fù)制過程中的作用的研究不斷開展，提示Hsp90有可能作為抗HBV的潛在靶點(diǎn)，但目前尚未對此有系統(tǒng)的歸納總結(jié)。本文對Hsp90在HBV復(fù)制過程中的作用進(jìn)行綜述，以期為Hsp90作為抗HBV的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 Hsp90的生理功能

1.1 分子伴侶 分子伴侶是一類參與蛋白質(zhì)的折疊與組裝，但其本身并不進(jìn)行折疊的蛋白質(zhì)［2］。多項(xiàng)研究已經(jīng)證明Hsp90的分子伴侶功能。酶、類固醇受體、轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)的一級序列中存在疏水性基團(tuán)，Hsp90可以協(xié)助這些疏水性基團(tuán)折疊到其球形蛋白的內(nèi)部，以防止疏水性基團(tuán)自發(fā)地聚集而失去正常的結(jié)構(gòu)和功能［3］。Hsp90經(jīng)常與Hsp70和Hsp40合作發(fā)揮分子伴侶功能［4］，純化的Hsp90可以穩(wěn)定熱變性的蛋白質(zhì)，包括檸檬酸合成酶、硫氰酸酶、蛋白激酶2［5-6］。Hsp90的目標(biāo)蛋白常在信號通路中發(fā)揮作用，典型的目標(biāo)蛋白有類固醇受體和v-Src蛋白激酶。

1.2 細(xì)胞骨架 在非應(yīng)激情況下，Hsp90占哺乳動物細(xì)胞內(nèi)總蛋白的1%～2%，而在應(yīng)激條件下會增加到4%～6%，由于其龐大的數(shù)量和分子伴侶的性質(zhì)，Hsp90在細(xì)胞漿內(nèi)常參與細(xì)胞骨架的形成。體外實(shí)驗(yàn)［7］發(fā)現(xiàn)Hsp90與肌動蛋白絲交聯(lián)，其分解產(chǎn)物Hsp90cl會導(dǎo)致肌動蛋白的氧化累積增強(qiáng)，而防止Hsp90降解可以減少肌動蛋白氧化的積累。另有研究［8］表明乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X，HBx）可以與鈣調(diào)蛋白相互作用，從而使Hsp90與鈣調(diào)蛋白脫離，并增強(qiáng)Hsp90的活性，啟動下游的Hsp90/LIMK1/cofilin通路實(shí)現(xiàn)肌動蛋白的重組。此外Hsp90可以與微管蛋白發(fā)生作用并保護(hù)其受熱變性［9］，且Hsp90與動植物細(xì)胞中的微管都存在相互作用［10］。

1.3 核內(nèi)功能 細(xì)胞核中Hsp90在正常情況下占核內(nèi)總蛋白的5%～10%，而在應(yīng)激條件下，Hsp90的核內(nèi)占比有所增加。在核內(nèi)Hsp90可以與DNA、RNA以及組蛋白結(jié)合。Hsp90可以和細(xì)胞分裂周期蛋白37共同參與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶的折疊，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6［11］、細(xì)胞周期依賴性激酶11p110［12］以及細(xì)胞周期依賴性激酶調(diào)節(jié)蛋白Wee1等［13］。

2 Hsp90參與HBV的復(fù)制過程

2.1 Hsp90促進(jìn)HBV核衣殼的形成 HBV的部分雙鏈環(huán)狀DNA在機(jī)體內(nèi)可以表達(dá)4種蛋白質(zhì)，即表面蛋白（HBs）、核心蛋白（HBc）、DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶（polymerase-reverse transcriptase，Pol/RT）和HBx（圖1）。HBc在HBV的復(fù)制周期中起到重要作用，它可以分為氨基端和羧基端，羧基端能夠調(diào)節(jié)病毒復(fù)制而氨基端參與HBc的組裝［14］。在HBV復(fù)制的起始階段，HBc會形成一個(gè)同源二聚體，而后90個(gè)或120個(gè)二聚體自我組裝成二十面體的核衣殼，該衣殼可以將Pol/RT、pgRNA以及其他對病毒復(fù)制起重要作用的因子如Hsp、蛋白激酶等共同封裝在其內(nèi)部從而保護(hù)病毒DNA不受外界干擾。最終的病毒是由HBc與病毒基因組及其他蛋白組裝產(chǎn)生，因此HBc對病毒的成熟至關(guān)重要［15］。Shim等［16］的研究證實(shí)Hsp90可以與HBc二聚體結(jié)合以促進(jìn)核衣殼形成，并且核衣殼的形成過程依賴其反應(yīng)溫度，Hsp90可以降低不同溫度條件下核衣殼的分解。該研究還在HepG2.2.15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hsp90表達(dá)下調(diào)或其活性受到抑制后，HBV的復(fù)制將受到抑制。此外有實(shí)驗(yàn)［17］證實(shí)了Hsp90表達(dá)下調(diào)或活性受到抑制并不影響HBc的表達(dá)，而是通過影響HBc的組裝來抑制HBV的復(fù)制。Zhao等［18］研究首次表明HBc二聚體在封裝pgRNA前是高度磷酸化狀態(tài)，而封裝之后則發(fā)生去磷酸化，在這一過程中Hsp90抑制劑可以通過抑制pgRNA的封裝來干擾HBc的去磷酸化，該研究結(jié)果表明了Hsp90對HBc的潛在增強(qiáng)機(jī)制。Makokha等［19］研究顯示Hsp90可以與TAR DNA結(jié)合蛋白（transactive response DNA-binding protein，TARDBP）相互作用，后者作為一種多功能蛋白可以調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制，沉默或敲除TARDBP均會嚴(yán)重破壞病毒的復(fù)制過程。除Hsp90以外，TARDBP還可與許多其他支持HBV生命周期的蛋白如核仁磷酸蛋白1、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶1、脯氨酸和谷氨酰胺剪接因子等蛋白相結(jié)合。

圖1 HBV復(fù)制過程示意圖Figure 1 Diagram of HBV replication process

2.2 Hsp90促進(jìn)pgRNA的逆轉(zhuǎn)錄 HBV的基因組雖然是一組雙鏈DNA，但其復(fù)制是由pgRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄形成的。此外，pgRNA逆轉(zhuǎn)錄過程的關(guān)鍵酶是pgRNA自身表達(dá)所生成。在逆轉(zhuǎn)錄的起始階段，逆轉(zhuǎn)錄酶識別pgRNA 5'端的ε結(jié)構(gòu)，以其內(nèi)部凸起（5'-UUC-3'）為模板，并由自身的第63個(gè)酪氨酸充當(dāng)引物［20-21］，形成逆轉(zhuǎn)錄酶-dGAA復(fù)合體，然后逆轉(zhuǎn)錄酶再轉(zhuǎn)運(yùn)至pgRNA 3'端的直接重復(fù)序列1來完成DNA負(fù)鏈的合成。在HBV的生命周期中，逆轉(zhuǎn)錄酶與pgRNA的結(jié)合啟動了HBV復(fù)制早期的兩個(gè)關(guān)鍵事件，即逆轉(zhuǎn)錄和核衣殼封裝。前者實(shí)現(xiàn)了pgRNA的逆轉(zhuǎn)錄，后者導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶和pgRNA被HBc選擇性的封裝［13］。Hu等［22］實(shí)驗(yàn)證實(shí)在逆轉(zhuǎn)錄酶與pgRNA的結(jié)合過程中Hsp90不可或缺，抑制Hsp90的表達(dá)將導(dǎo)致封裝進(jìn)核衣殼的pgRNA數(shù)量下降，并且此過程依賴于ATP的水解。盡管Hsp70或Hsp40也可以促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶與pgRNA的結(jié)合，但只有在Hsp90共同參與的情況下，Hsp70或Hsp40才能最大程度地促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶與pgRNA的結(jié)合［23］。Gyoo Park等［24］研究表明Hsp90通過與逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合影響pgRNA逆轉(zhuǎn)錄的起始，加入Hsp90抗體（3G3）將降低逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性，從而表明Hsp90對逆轉(zhuǎn)錄酶在逆轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮正常功能十分重要。

3 Hsp90與其他分子相互作用參與HBV的復(fù)制過程

3.1 Hsp90與Hsp70相互作用 Hsp70也是細(xì)胞內(nèi)分子伴侶網(wǎng)絡(luò)中的組成成分，并且與Hsp90常常組成蛋白復(fù)合體共同發(fā)揮作用［25］。在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展中，Hsp70與Hsp90的表達(dá)上調(diào)，并通過逆轉(zhuǎn)錄酶-Hsp復(fù)合體的形式影響核衣殼封裝與病毒DNA的合成［26］。Seo等［27］研究證實(shí)，Hsp70可以與Hsp90協(xié)同增加病毒衣殼的形成，隨著Hsp70水平的提高，核衣殼形成的速率也會增加，并且這種協(xié)同效應(yīng)來自于HBc六聚體的形成。此外，核仁磷蛋白同樣具有促進(jìn)核衣殼形成的效應(yīng)，但不具備與Hsp90的協(xié)同作用。

3.2 Hsp90與ROS相互作用 HBV在感染過程中會影響線粒體功能從而產(chǎn)生ROS，ROS又可以通過改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和激活類似核因子-κB的轉(zhuǎn)錄因子從而提高病毒的復(fù)制水平。不斷積累的ROS會導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常和染色體突變，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展，而Hsp90和谷胱甘肽可以作為抗氧化成分發(fā)揮抗氧化防御作用［28］。Kim等［25］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hsp90存在時(shí)，ROS可以促進(jìn)HBV的核衣殼形成，而Hsp90不存在時(shí)ROS則會抑制HBV的核衣殼形成。此外，谷胱甘肽可以通過抑制Hsp90的功能來減慢核衣殼形成。ROS和谷胱甘肽都會引起Hsp90與p23、ATP復(fù)合體的構(gòu)象改變，前者會引起a-螺旋的輕度降低，而后者會導(dǎo)致a-螺旋升高。

3.3 Hsp90與A3G相互作用 A3G是在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的RNA編輯酶，具有胞苷脫氨酶活性，可誘導(dǎo)胞嘧啶突變?yōu)槟蜞奏?。A3G不僅在癌變過程中經(jīng)常表達(dá)上調(diào)，而且能夠抑制包括HBV在內(nèi)的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒，常參與宿主對抗病毒的免疫過程。Turelli等［29］發(fā)現(xiàn)A3G具有抑制DNA復(fù)制的作用，并進(jìn)一步推測該機(jī)制與A3G阻斷HBV前基因組pgRNA封裝至衣殼的過程有關(guān)。Nguyen等［30］研究發(fā)現(xiàn)A3G進(jìn)入核衣殼發(fā)揮效應(yīng)的同時(shí)需要HBV逆轉(zhuǎn)錄酶和pgRNA片段ε以及自身氨基末端的完整性。Chen等［31］在HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Hsp90可以刺激A3G的脫氨酶活性，進(jìn)一步的測序分析顯示Hsp90增加了A3G介導(dǎo)的HBV基因的胞嘧啶突變效率和總HBV基因突變頻率，并且能夠改變A3G對HBV基因的胞嘧啶區(qū)域選擇性，而Hsp90抑制劑呈劑量依賴性地抑制HBV的A3G突變活性，從而表明Hsp90在固有免疫抗病毒的過程中有一定的潛在作用，而Hsp90是否能通過影響A3G的脫氨酶活性對HBV復(fù)制產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步探究。

4 Hsp90抑制劑對HBV復(fù)制的作用

由于Hsp90參與pol-ε復(fù)合體的形成，并且可以和HBc相互作用穩(wěn)定核衣殼，因此Hsp90小分子抑制劑均具有抑制HBV復(fù)制的潛力［32］。目前Hsp90的抑制機(jī)理主要圍繞氨基端的ATP競爭抑制。格爾德霉素（Geldanamycin，GM）是天然的小分子Hsp90抑制劑，其可以在Hsp90氨基端的口袋結(jié)構(gòu)模擬核苷酸結(jié)構(gòu)達(dá)到抑制效果，但是存在嚴(yán)重的肝毒性和溶解性差的問題。為了克服GM系列物的副作用，Brough等開發(fā)出基于間苯二酚的抑制劑Luminespib（NVPAUY922）［33］，后續(xù)同類型的抑制劑還有AT13387，其作用方式與GM類似，此外還有基于嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的衍生物Zelavespib（PU-H71）、Icapamespib（PU-AD）、BIIB021等［3］。另有研究［34］顯示KNK437能夠通過抑制Hsp90的活性來抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。此外Hsp90抑制劑對腫瘤細(xì)胞的敏感性高于正常細(xì)胞，新型Hsp90抑制劑SNX-2112可加強(qiáng)肝癌細(xì)胞凋亡［35］，Hsp90抑制劑Ganetespib（STA-9090）能夠抑制c-Myc依賴性食管鱗狀腫瘤生長［36］。

綜上所述，本文對Hsp90的生理功能進(jìn)行了簡介，并重點(diǎn)歸納總結(jié)了Hsp90在HBV復(fù)制過程中的作用，即參與促進(jìn)核衣殼的形成，并對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性有重要調(diào)節(jié)作用，能夠直接影響HBV的復(fù)制效率，以及與胞內(nèi)其他分子相互作用來促進(jìn)HBV的復(fù)制。這些研究充分證明了Hsp90在HBV復(fù)制過程中的關(guān)鍵作用，表明Hsp90可作為潛在的生物靶點(diǎn)來開展抗HBV的藥物研發(fā)，為慢性乙型肝炎的防治提供新的理論指導(dǎo)和方向。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：花胤負(fù)責(zé)撰寫和修改論文；方海麗、劉守勝負(fù)責(zé)參與文獻(xiàn)的收集和整理；宣世英、張梅、辛永寧負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。