蘇 航，蘇建國*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋生物與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，也是世界上產(chǎn)量最高的淡水養(yǎng)殖魚類，2022 年全國草魚產(chǎn)量達(dá)到590.5 萬t。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，無序養(yǎng)殖增加了各種水生動(dòng)物疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，不僅會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境。病原體從養(yǎng)殖環(huán)境至野生環(huán)境的傳播也可能導(dǎo)致野生魚類感染、環(huán)境污染[1]。草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染引起的草魚出血病，可導(dǎo)致草魚魚種出現(xiàn)嚴(yán)重的出血癥并死亡，死亡率高達(dá)90%，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[2]，對(duì)草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害，同時(shí)對(duì)其他淡水經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展也造成一定的威脅。

GCRV 是一種雙鏈RNA (dsRNA)病毒，屬于水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，是水生呼腸孤病毒中毒力最強(qiáng)的病毒之一[3]。GCRV 病毒顆粒是一個(gè)具有雙層衣殼的正二十面體，其基因組包含11 個(gè)片段，編碼13 個(gè)蛋白(7 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和6 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白)[4-5]。目前，在我國已經(jīng)分離鑒定出草魚呼腸孤病毒超過30 株，其中完成全基因組測(cè)序的毒株超過12 株[6-7]。根據(jù)不同VP6 基因序列，GCRV 可 分 為GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ和GCRV-Ⅲ等3 種類型，代表毒株分別為GCRV-873 (Ⅰ型)、GCRV-HZ08 (Ⅱ型)和GCRV104 (Ⅲ型)[8]。其中，GCRV-Ⅱ是目前我國最具流行性和毒力的類型[2]，與哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(Orthoreovirus)同源性最高[9]。正呼腸孤病毒黏附蛋白σ1 以宿主細(xì)胞表面連接黏附分子A (JAMA)蛋白為受體進(jìn)行結(jié)合，感染細(xì)胞，誘導(dǎo)NF-κB 活化和細(xì)胞凋亡[10]。而對(duì)于GCRV，感染宿主細(xì)胞的機(jī)制尚未闡明。由GCRV-Ⅱ的s7 片段編碼的VP56蛋白，分子量約為56 ku，是GCRV-Ⅱ/Ⅲ特有的纖維蛋白，可能在GCRV 感染過程中發(fā)揮黏附于宿主細(xì)胞表面的作用，在病毒入侵宿主環(huán)節(jié)起重要作用[11-12]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是負(fù)責(zé)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成、外源物質(zhì)解毒和胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)一旦遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)就會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中累積，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)生未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是一種常駐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，UPR 反應(yīng)激活從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞核的級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，GRP78 表達(dá)增強(qiáng)[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78 與未折疊蛋白結(jié)合，導(dǎo)致從PERK-eIF2α 途徑、IRE1α-XBP1途徑和活化轉(zhuǎn)錄因子6 (ATF6)途徑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜轉(zhuǎn)化子解離[15]。3 個(gè)途徑通過對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，維持應(yīng)激期間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)[16]。在哺乳動(dòng)物中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與抗病毒反應(yīng)，然而在魚類中，涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的抗病毒反應(yīng)研究較為有限[17-18]。

GCRV 與細(xì)胞表面蛋白的相互作用具有細(xì)胞類型特異性和趨向性，是病毒誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的決定因素。為了探究GCRV 感染機(jī)制，減少草魚出血病暴發(fā)帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失，前期通過內(nèi)源性co-IP、蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(GST pull down)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)鑒定，發(fā)現(xiàn)GCRV-Ⅱ的VP56 可能與GRP78 互作[19]。本研究通過經(jīng)典正向和反向co-IP 和雙分子熒光互作技術(shù)證實(shí)了VP56 與GRP78 互作，通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)VP56 使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生改變，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過ATF6 介導(dǎo)的信號(hào)通路激活非折疊蛋白反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)探究GCRV 病毒與宿主蛋白的相互作用及效應(yīng)，為研究GCRV 的致病機(jī)理提供了新思路，有助于草魚抗病毒免疫研究的發(fā)展和草魚養(yǎng)殖中出血病的防控。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系包括草魚腎細(xì)胞系(C.idellakidney cells,CIK cells)，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代擴(kuò)大培養(yǎng)并保存；胖頭鯉細(xì)胞系(fathead minnow,FHM)保存于本實(shí)驗(yàn)室。CIK 和FHM 細(xì)胞系分別培養(yǎng)于DMEM 和M199 培養(yǎng)基[包含10% FBS (Gibco，美國)、100 U/L 青霉素(Sigma,美國)、100 μg/mL 鏈霉素]，28oC 二氧化碳(5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；VP56 或空載穩(wěn)定表達(dá)的CIK 細(xì)胞系使用G418 篩選。實(shí)驗(yàn)用病毒毒株為GCRV-097 株(GCRV-Ⅱ)，由中國科學(xué)院水生生物研究所汪亞平研究員惠贈(zèng)，后經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室保種富集。

1.2 載體構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)利用pCMV-eGFP 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-VP56、pCMV-VP56-Flag 及pCMV-GRP78-HA 等；雙分子熒光互補(bǔ)載體pMN155 和pMC156由中國科學(xué)院武漢病毒研究所崔宗強(qiáng)研究員惠贈(zèng)。載體構(gòu)建所用引物信息見表1。

表1 載體構(gòu)建及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)引物信息Tab.1 The primers and their designated applications in vector construction and RT-qPCR

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代至10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿(6×106～8×106個(gè)/皿)中，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞剛好均勻長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，使用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?6(Promega,美國)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染4 μg對(duì)應(yīng)質(zhì)粒；將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)并收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫共沉淀

常溫收集FHM 細(xì)胞，加入終濃度為1 mmol/L 的PMSF 的IP 裂解緩沖液[20 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，0.5 μg/mL 亮抑肽酶，2.5 mmol/L 焦磷酸鈉] 1 mL 于冰上裂解細(xì)胞30 min。裂解后取80 μL 上清液，加入20 μL 的5 × SDS 上樣緩沖液，制備全細(xì)胞裂解液(WCL)備用。剩余IP 樣品加入1 μL 的IP 級(jí)一抗，置于搖床4 °C 搖晃孵育過夜。吸取40 μL/個(gè)樣品的protein A+G 瓊脂糖磁珠，清洗并加入IP 樣品，4°C 搖晃孵育6 h。離心取沉淀，使用IP 裂解緩沖液洗滌3～4 次后加入2 × SDS-PAGE上樣緩沖液煮樣，免疫印跡(immunoblotting,IB)檢測(cè)IP 結(jié)果或直接將樣品保存于-80°C 備用。

1.5 免疫印跡

取細(xì)胞蛋白樣品分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至NC 膜上，于2%的BSA 封閉液中室溫封閉2 h；將標(biāo)簽抗體稀釋至適當(dāng)濃度，4 °C 孵育過夜；選擇與一抗對(duì)應(yīng)種屬的HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；每次反應(yīng)后均用TBST 洗3～5 次，每次10 min。用TMB 顯色劑顯色并觀察結(jié)果。

1.6 基于遠(yuǎn)紅外紅色mNeptune 的雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)(BiFC)

基于mNeptune 的BiFC 系統(tǒng)可視化檢測(cè)CIK細(xì)胞中VP56 和GRP78 之間的相互作用。重組質(zhì)粒pGRP78-MN155 和pMC156-VP56 分別在GRP78的C 末端包含mNeptune 蛋白的N 末端(mNeptune amino acid 1-155,MN155)，在VP56 的N 末端包含mNeptune 蛋白的C 末端(mNeptune amino acid 156-244,MC156)，末端編碼區(qū)之間分別通過接頭序列GGGGSGGGGS 連接。質(zhì)粒pGRP78-MN155和pMC156-VP56 分別或共同轉(zhuǎn)染入CIK 細(xì)胞中，培養(yǎng)后使用激光共聚焦顯微鏡觀察mNeptune 蛋白是否發(fā)光。紅色熒光顯示2 種蛋白在空間構(gòu)象上相互作用，使mNeptune 蛋白的2 個(gè)末端相互結(jié)合，使mNeptune 蛋白在激發(fā)后發(fā)光。紅色熒光的檢測(cè)波段為640/20 nm (激發(fā)光)和685/40 nm (發(fā)射光)。

圖版Ⅰ BiFC 檢測(cè)VP56 與GRP78 互作CIK 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染或單獨(dú)轉(zhuǎn)染pGRP78-MN155 和/或pMC156-VP56 質(zhì)粒48 h，DAPI 染核后，根據(jù)BiFC 系統(tǒng)，使用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照；紅色熒光代表蛋白互作陽性。Plate Ⅰ Interaction between VP56 and GRP78 detected by BiFCpGRP78-MN155 and pMC156-VP56 were transfected alone or co-transfected into CIK cells under normal conditions;in the BiFC system,the nucleus was stained with DAPI,and the images were acquired using confocal microscopy under a 40 × objective lens;appearance of red fluorescence represents positive interaction.

1.7 激光共聚焦顯微鏡觀察

將過表達(dá)相應(yīng)BiFC 載體的CIK 細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。細(xì)胞經(jīng)磷酸鈉緩沖溶液(PBS)清洗3 次，使用600 μL新鮮配制的4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，室溫孵育10 min。固定后的細(xì)胞用PBS 清洗3 次，加入DAPI 染液避光孵育3～5 min。用新鮮PBS 小心洗滌細(xì)胞3 次后在激光共聚焦顯微鏡(SP8,Leica)下觀察并拍照。

1.8 透射電子顯微鏡(TEM)觀察

將相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞傳代至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，48 h 后用PBS 洗3 次，胰酶消化，收集細(xì)胞，用1 mL 電鏡固定液(2.5%戊二醛)輕緩吹散細(xì)胞，室溫放置48 h，離心棄上清液，加1 mL 新的固定液(不能吹散細(xì)胞)。固定后的細(xì)胞樣品制片后使用透射電子顯微鏡(Hitachi,日本)觀察并拍照。

1.9 RT-qPCR

取穩(wěn)轉(zhuǎn)VP56 或空載的CIK 細(xì)胞樣品，根據(jù)NCBI GenBank 基因序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)定量引物(表1)，以EF1α作為內(nèi)參基因進(jìn) 行RT-qPCR。反 應(yīng)體系為15 μL：7.5 μL 2×SYBR Green BioEasy Master Mix，2 μL cDNA，5.1 μL滅菌超純水，上下游引物各0.2 μL；反應(yīng)程序：95 °C 預(yù)變性1 min；94 °C 變性15 s，60 °C 退火15 s，72 °C 延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、統(tǒng)計(jì)和作圖。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由3 次及以上獨(dú)立重復(fù)數(shù)據(jù)組成。使用Student’st檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 VP56 與GRP78 互作

通過經(jīng)典正向和反向co-IP 發(fā)現(xiàn)VP56 與GRP78 發(fā)生相互作用。首先通過GRP78 蛋白融合的HA 標(biāo)簽，使用特異性抗體進(jìn)行co-IP，以過表達(dá)空載質(zhì)粒和IgG 為對(duì)照，結(jié)果顯示為可檢測(cè)到陽性VP56 條帶(圖1-a)，說明VP56 和GRP78 蛋白相互作用。通過VP56 蛋白融合的Flag 標(biāo)簽，以過表達(dá)空載質(zhì)粒和IgG 為對(duì)照，使用Flag 特異性抗體進(jìn)行co-IP 的結(jié)果顯示出了GRP78 蛋白陽性條帶(圖1-b)。2 個(gè)co-IP 結(jié)果均表明VP56 與GRP78 之間存在相互作用。

圖1 co-IP 檢測(cè)VP56 與GRP78 互作(a) FHM 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染VP56-GFP/空載質(zhì)粒和GRP78-HA，48 h 后使用HA 標(biāo)簽抗體或小鼠IgG (對(duì)照)進(jìn)行co-IP，然后使用相應(yīng)抗體進(jìn)行IB鑒定，(b) FHM 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染GRP78-HA/空載質(zhì)粒和VP56-Flag，48 h 后使用Flag 標(biāo)簽抗體或小鼠IgG (對(duì)照)進(jìn)行co-IP，然后使用相應(yīng)抗體進(jìn)行IB 鑒定；1.IP: HA，2.IP: IgG，3.IP: HA，vector.pCMV-GFP。Fig.1 Interaction between VP56 and GRP78 by co-IP(a) FHM cells were co-transfected with VP56-GFP/vector and GRP78-HA for 48 h,co-IP was performed with anti-HA monoclonal Ab and mouse IgG(control),and IB with the respective Abs,(b) FHM cells were co-transfected with GRP78-HA/vector and VP56-Flag for 48 h.co-IP was performed with anti-Flag monoclonal Ab and mouse IgG (control) and IB with the respective Abs;1.IP: HA,2.IP: IgG,3.IP: HA,vector.pCMV-GFP.

BiFC 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了VP56 和GRP78 之間的相互作用。mNeptune 蛋白是一種紅色熒光蛋白，將其N 端(MN155)和C 端(MC156)分別構(gòu)建于GRP78 和VP56 蛋白分子的C 端和N 端。在分別共表達(dá)單端融合蛋白和mNeptune 蛋白另一端時(shí)，在激光共聚焦顯微鏡下不能觀察到紅色熒光。將分別融合了MN155 和MC156 的GRP78 和VP56蛋白同時(shí)表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡，在遠(yuǎn)紅外波段可觀察到mNeptune 蛋白發(fā)出紅色熒光(圖版Ⅰ)。結(jié)果顯示，VP56 和GRP78 蛋白表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，mNeptune 蛋白的兩端靠近發(fā)出紅色熒光，表明VP56 和GRP78 相互作用。

2.2 VP56 導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化

GRP78 是錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶。使用電子透射顯微鏡觀察穩(wěn)定表達(dá)VP56 的CIK 細(xì)胞時(shí)，與穩(wěn)定表達(dá)空載質(zhì)粒的CIK 細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了形態(tài)變化，出現(xiàn)腫脹、擴(kuò)張和脫粒等現(xiàn)象(圖版Ⅱ)，說明VP56 引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的變化，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

2.3 VP56 通過ATF6 激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

為探究VP56 激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游非折疊蛋白反應(yīng)的途徑，利用相關(guān)引物(表1)，通過RTqPCR 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游非折疊蛋白反應(yīng)3 條不同途徑關(guān)鍵分子的mRNA 表達(dá)水平(圖2)。結(jié)果顯示，VP56 顯著誘導(dǎo)atf6 表達(dá)，對(duì)另外2 條途徑關(guān)鍵分子無顯著影響，表明VP56激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)ATF6 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，造成非折疊蛋白反應(yīng)。

圖2 VP56 通過ATF6 誘導(dǎo)UPR1.grp78，2.atf4，3.atf6，4.traf2；*.P＜0.05,**.P＜0.01；轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平以EF1α 基因表達(dá)水平為標(biāo)準(zhǔn)，以對(duì)照組為1。Fig.2 VP56 activates UPR through ATF61.grp78,2.atf4,3.atf6,4.traf2;*.P＜0.05,**.P＜0.01;the relative transcription levels were normalized to the transcription level of EF1α gene and are represented as fold induction relative to the transcription level in control cells,which was set to 1.

3 討論

圖版 Ⅱ VP56 過表達(dá)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化1.對(duì)照，2.VP56，N.細(xì)胞核，E.內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (白色箭頭)。Plate Ⅱ Effect of VP56 overexpression on ER morphology1.control,2.VP56,N.nucleus,E.endoplasmic reticulum (white arrows indicate).

草魚出血病嚴(yán)重危害我國草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。病毒性疾病在水環(huán)境中傳播性很強(qiáng)。傳染性疾病發(fā)生的基本條件包括宿主、病原體和環(huán)境。為了控制疾病的傳播，從病原體出發(fā)，對(duì)病毒蛋白的分子功能，及其與宿主關(guān)系的闡釋，有利于病毒性疾病的控制。因此，在草魚出血病防控及GCRV 感染機(jī)制研究中，病毒蛋白的功能亟待研究。GCRV 目前分成3 個(gè)基因型，對(duì)于GRCV-I 研究的較為深入，而對(duì)流行基因型GCRV-II 的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)從GCRV-II 纖維蛋白VP56 與宿主蛋白互作方面著手，發(fā)現(xiàn)VP56 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)識(shí)蛋白GRP78 互作，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

病毒感染過程中，病毒一般通過吞噬作用、巨胞飲、網(wǎng)格蛋白、包膜窖依賴的內(nèi)吞作用以及其他不依賴于網(wǎng)格蛋白和包膜窖的內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，而GCRV 進(jìn)入細(xì)胞的途徑有可能與網(wǎng)格蛋白與窖蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有關(guān)[20-21]。感染哺乳動(dòng)物的正呼腸孤病毒利用宿主細(xì)胞表面的JAMA 為受體，通過黏附蛋白σ1 與其結(jié)合，從而進(jìn)入細(xì)胞[22-23]。在水生呼腸孤病毒中，已知多種有可能與病毒蛋白互作的分子，如Fibulin-4、Ubc9、LITAF、LamR 和TIA1 等[24-28]。根據(jù)同源比對(duì)分析，VP56 與正呼腸孤病毒的黏附蛋白σ1同源性很高，極有可能行使黏附功能。在GCRV感染宿主細(xì)胞過程中，嵌于GCRV 病毒顆粒表面的纖維蛋白VP56 黏附并固定與于宿主細(xì)胞表面，進(jìn)而完成后續(xù)進(jìn)入細(xì)胞的生物過程[11]。

利用co-IP 和BiFC 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VP56 與GRP78之間的相互作用。使用傳統(tǒng)的研究蛋白分子互作的方法co-IP，根據(jù)抗原-抗體結(jié)合原理，并且輔以空載質(zhì)粒對(duì)照和免疫球蛋白抗體對(duì)照，使用融合在2 個(gè)蛋白分子上的不同標(biāo)簽抗體進(jìn)行co-IP，使本研究中發(fā)現(xiàn)的VP56 和GRP78 的互作結(jié)果更加可靠。同時(shí)使用新興的研究分子間互作的基于遠(yuǎn)紅外紅色mNeptune 蛋白的雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)[19,29]，通過激光共聚焦顯微鏡，直觀地觀察到VP56 和GRP78 蛋白分子在CIK 細(xì)胞中的結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了兩個(gè)分子間的相互作用。

本研究發(fā)現(xiàn)VP56 與GRP78 相互作用。分別檢測(cè)3 個(gè)UPR 分支的關(guān)鍵分子后，VP56 激活了ATF6 途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATF6，而未激活另外2 個(gè)分支中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATF4 和TRAF2，表明了VP56 與GRP78 結(jié)合觸發(fā)ATF6 途徑，即VP56 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR，表明GCRV-Ⅱ感染導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞。VP56 破壞胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，引起ER 應(yīng)激和UPR 反應(yīng)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)造成巨大損傷，影響其功能。GCRV 攻擊宿主時(shí)，破壞宿主細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與胞內(nèi)抗病毒反應(yīng)，VP56 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷有利于GCRV 病毒逃逸。

綜上所述，本研究通過co-IP 和BiFC 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GCRV-Ⅱ纖維蛋白VP56 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78 的相互作用，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)VP56 可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)變化，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)ATF6 介導(dǎo)的非折疊蛋白反應(yīng)。研究表明，GCRV 感染過程中，VP56 激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，打破細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。本研究從病毒與宿主蛋白互作的角度闡釋了VP56在GCRV 感染過程中的功能，為GCRV 感染機(jī)制的研究提供新思路。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）