劉 玉，陳曉婷，吳靖娜，劉智禹*，周常義

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023)

暗紋東方鲀 (Takifugu obscurus)為四齒鲀科(Tetraodontidae)東方鲀屬的魚類，主要分布在我國近海 (東海、黃海和渤海)和長江中下游，屬于海淡水洄游魚類。其肝臟、卵巢和血液均有劇毒，皮和精巢有弱毒，魚肉無毒[1]。有研究分析了3 個地區(qū)的3 種不同養(yǎng)殖模式下紅鰭東方鲀(T.rubripes)的肌肉營養(yǎng)組成、風(fēng)味物質(zhì)含量等特性，結(jié)果顯示3 種養(yǎng)殖模式下，其水分、粗蛋白和粗脂肪之間都不存在顯著差異，同時肌肉中檢測到18種常見氨基酸，氨基酸總量平均達(dá)肌肉濕樣的(15.65%±0.95%)，或占肌肉比重79.13 g/100.00 g～83.19 g/100.00 g (干重)[2]。養(yǎng)殖雄性暗紋東方鲀肌肉中多不飽和脂肪酸 (PUFA)含量為0.52%，DHA 含量為0.16%，氨基酸總量為80.08 g/100.00 g(干重)，并且魚肉和精巢中富含Se，其氨基酸種類齊全，必需氨基酸占總氨基酸的比例為44.13%～49.80%，屬于食源性優(yōu)質(zhì)蛋白[3]。

以暗紋東方鲀?yōu)榇恚潴w內(nèi)含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪，同時富含魚油 (DHA、EPA)和人體必需的8 種氨基酸及多種微量元素，營養(yǎng)豐富，食用價值高[4]，因此河鲀深受廣大消費者的喜愛，是一類經(jīng)濟(jì)價值高、開發(fā)潛力巨大的水產(chǎn)珍品[5-6]。但是河鲀?nèi)獠灰踪A藏，在4 °C條件下冷藏，僅有約4 d 的貨架期，因此延長河鲀的貨架期成為亟待解決的問題[7]。

近年來，將微生物用于魚肉制品的加工受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。隨著時代的發(fā)展，緩慢不可控的傳統(tǒng)發(fā)酵方式已經(jīng)無法滿足生產(chǎn)消費需求，人為添加發(fā)酵劑，控制發(fā)酵條件加快發(fā)酵食品的成熟是現(xiàn)代發(fā)酵制品生產(chǎn)的普遍方式[8-9]。微生物發(fā)酵通常會混合使用乳酸菌、微球菌和酵母菌等多種益生菌，微球菌科(Micrococcaceae)中的葡萄球菌屬(Staphylococcus)常見于發(fā)酵食品中。葡萄球菌在與乳酸菌的生存競爭中，不會因為pH 的降低而受到影響，在發(fā)酵期和成熟期的最初主要依靠乳酸菌的作用，最終發(fā)酵制品的風(fēng)味、口感和顏色等感官品質(zhì)還依靠葡萄球菌和酵母菌的共同作用，使用混合發(fā)酵劑不僅可以抑制腐敗微生物的生長繁殖，還能降低硝酸鹽、亞硝酸鹽、生物胺、過氧化氫等不良發(fā)酵代謝產(chǎn)物的含量[10]，從而得到色澤穩(wěn)定、風(fēng)味獨特、口感優(yōu)良、營養(yǎng)豐富的肉類發(fā)酵制品。

在生產(chǎn)工作與科學(xué)實驗中，人們經(jīng)常會遇到模糊概念或現(xiàn)象，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科領(lǐng)域?qū)τ谶@些模糊概念有關(guān)的實際問題都需要給出定量的分析，模糊數(shù)學(xué)就是研究和處理具有不確定性和模糊性的量的變化規(guī)律的一種數(shù)學(xué)方法[11]。食品感官評價是對食品品質(zhì)綜合質(zhì)量判斷的重要實驗方法，但是感官評價主要使用等級評分，同時需要評價者通過多種感知渠道對食品的綜合屬性進(jìn)行評定，易受評價者主觀想法的影響，因此使用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法能得到更為客觀而準(zhǔn)確的結(jié)果[12]。

本研究以暗紋東方鲀?yōu)樵?，用戊糖片球?Pediococcus pentosaceus)、植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)、木糖葡萄球菌 (Staphylococcus xylosus)作為發(fā)酵劑，利用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法確定輔料配方，通過正交試驗設(shè)計對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開發(fā)發(fā)酵河鲀魚腸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗紋東方鲀?nèi)∽愿＝ㄊ△冎r水產(chǎn)有限公司。凍干菌種 (CICC 22227 戊糖片球菌、CICC 21803植物乳桿菌、CICC 21445 木糖葡萄球菌)來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。馬鈴薯淀粉，安徽山河藥用輔料股份有限公司。食用鹽，福建省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司。葡萄糖，山東祥瑞藥業(yè)有限公司。蔗糖，廈門市新興貿(mào)易有限公司。MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSAB201 電子天平 (德國賽多利斯)。BS124S電子分析天平 (德國賽多利斯)。VT-840K-U 潔凈工作臺 (蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。GI54DWS 高壓滅菌器 (美國ZEALWAY)。5810R高速冷凍離心機(jī) (德國eppendorf)。SHKE6000-8CE低溫可疊放搖床 (美國Thermo Scientific)。BSP-100 生化培養(yǎng)箱 (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。BGZ-140 電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。SZ-18 小型高速斬拌機(jī) (廣州旭眾食品機(jī)械有限公司)。HWS-28 電熱恒溫水浴鍋 (上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。IMS-25 雪花制冰機(jī) (常熟市雪科電器有限公司)。DW-86L388A立式超低溫保存箱 (青島海爾特種電器有限公司)。BCD-569W 冷藏冷凍冰箱 (德國西門子)。FE28 pH 計 (瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 發(fā)酵河鲀魚腸制備

以戊糖片球菌、植物乳桿菌、木糖葡萄球菌為發(fā)酵劑，按照購買菌種機(jī)構(gòu)提供的說明書，將凍干粉末用液體培養(yǎng)基溶解后，在平板內(nèi)劃線培養(yǎng)，再將單個菌落接種到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，菌落計數(shù)調(diào)整菌懸液濃度至107CFU/mL，按照菌懸液體積比1∶1∶1 混合菌懸液后，放入4 °C 冰箱待用[13]。按魚肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加馬鈴薯淀粉10%、蔗糖4%、葡萄糖3%、食用鹽2%、菌懸液3%，為發(fā)酵魚腸基礎(chǔ)配方。

暗紋東方鲀鮮活宰殺后采肉清洗，4 °C 下瀝干水分，低溫條件下添加輔料與發(fā)酵劑，斬拌3 min 使其混合均勻，灌制魚腸，放入生化培養(yǎng)箱中35 °C 發(fā)酵8 h。發(fā)酵結(jié)束后采用二段式加熱的方式對魚腸進(jìn)行加熱，先低溫45 °C 加熱1 h，再高溫95 °C 加熱30 min，然后用冰水迅速冷卻，放入4 °C 平衡12 h 備用[14-15]。本研究實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守集美大學(xué)動物實驗倫理規(guī)范，并按照國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局制定的實驗動物福利倫理審查標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4 采用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法優(yōu)化輔料添加量

輔料添加量單因素實驗條件設(shè)置 葡萄糖添加量組加入不同質(zhì)量比(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)的葡萄糖；食用鹽添加量組加入不同質(zhì)量比(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)的食用鹽；馬鈴薯淀粉添加量組加入不同質(zhì)量比(6%、8%、10%、12%)的馬鈴薯淀粉，其余輔料添加量不變，總共設(shè)置14 個輔料添加量優(yōu)化樣品。

模糊數(shù)學(xué)模型建立 請10 位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，具有食品感官評價經(jīng)驗的專業(yè)人員對發(fā)酵后的樣品進(jìn)行感官評價，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。利用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法得出葡萄糖、食用鹽和馬鈴薯淀粉的最佳添加量。

表1 感官評價表Tab.1 Sensory evaluation rules

根據(jù)感官評價標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定感官指標(biāo)評定論域U={口感(u1)，風(fēng)味(u2)，色澤(u3)，組織狀態(tài)(u4)}；感官評語評定論域V={優(yōu)，良，中，一般，差}。根據(jù)發(fā)酵魚腸中口感、風(fēng)味、色澤與組織狀態(tài)在整體感官質(zhì)量中所占據(jù)的重要性，可以將其權(quán)重域設(shè)定為A={0.20，0.40，0.20，0.20}。

Y是U到V上的一個模糊映射集，綜合評判的結(jié)果集Y就是由模糊關(guān)系矩陣R與各指標(biāo)因素權(quán)重域A計算而得，具體公式可表達(dá)為Y=R·A[16]。

1.5 采用正交試驗設(shè)計法對發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素輪換實驗依次優(yōu)化發(fā)酵劑接種量(1%、2%、3%、4%、5%)；發(fā)酵時間 (8、12、16、20、24、28、32、36、40、44 和48 h)；發(fā)酵溫度(25、35、45 和55 °C)。

請10 位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，具有食品感官評價經(jīng)驗的專業(yè)人員對發(fā)酵后的魚腸進(jìn)行感官評價，感官評價細(xì)則見表1。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以感官評分為評價指標(biāo)，采用L9(34)正交表 (表2)，利用正交試驗設(shè)計法得出發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的最優(yōu)發(fā)酵條件組合[17]。

表2 正交因素水平設(shè)計Tab.2 Orthogonal of factors and levels design

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用正交設(shè)計助手IIV 3.1 以及GraphPad prism 8.02 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 模糊數(shù)學(xué)模型建立

匯總整理輔料添加量感官評價實驗結(jié)果，得出模糊關(guān)系綜合評判集 (表3)。根據(jù)“采用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法優(yōu)化輔料添加量”中的方法設(shè)置葡萄糖、食用鹽和馬鈴薯淀粉這3 種輔料的14 個不同添加量的樣品(表4)。

表3 模糊關(guān)系綜合評判集Tab.3 Fuzzy relational comprehensive evaluation set

表4 感官評價結(jié)果Tab.4 Results of the sensory evaluation

樣品1 的口感官評分：選擇優(yōu)的2 人，選擇良的1 人，選擇中的2 人，選擇一般的5 人，選擇差的0 人。將上述評價人數(shù)除以總參與人數(shù)10 人，得到模糊矩陣R1第1 行，同理，樣品1 風(fēng)味、色澤、組織狀態(tài)的感官評分分別為模糊矩陣R1第2 行、第3 行、第4 行。由此可得所有樣品的模糊矩陣R，即：

模糊矩陣結(jié)果與權(quán)重因素集通過模糊變換得到模糊綜合評價值，以第一組為例：

式中，Y1-1=0.2×0.20+0.5×0.40+0.0×0.20+0.1×0.20=0.26，以此類推可得Y1-2=0.32，Y1-3=0.18，Y1-4=0.22，Y1-5=0.02，由此可得到Y(jié)1=(0.26，0.32，0.18，0.22，0.02)，同理：

將感官評價等級設(shè)置為優(yōu)(100 分)、較好(80分)、中等(60 分)、一般(40 分)、差(20 分)，即評價等級集K=(100，80，60，40，20)，將矩陣結(jié)果和評價集經(jīng)過計算得出感官評分(表4)。

根據(jù)感官評價結(jié)果得出輔料最佳添加量：葡萄糖添加量3%、食用鹽添加量2%、馬鈴薯淀粉添加量10%、感官評價得分分別為78.00、75.20和74.80。

2.2 發(fā)酵條件單因素實驗感官評價結(jié)果

對發(fā)酵條件單因素實驗樣品進(jìn)行感官評價，同時，發(fā)酵36 h 后魚腸變質(zhì)，因此發(fā)酵時間感官評價實驗在36 h 結(jié)束。結(jié)果見圖1，圖2，圖3，發(fā)酵劑接種量感官評分最高為66.40，發(fā)酵時間感官評分最高為63.80，發(fā)酵溫度感官評分最高為64.40。選擇每組評分最高的發(fā)酵條件參數(shù)：發(fā)酵菌懸液接種量3%、發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度35 ℃，做為正交試驗的基礎(chǔ)。

圖1 發(fā)酵魚腸發(fā)酵劑接種量感官評價結(jié)果Fig.1 Results of sensory evaluation for incubation amount in fermented pufferfish sausage

圖3 發(fā)酵魚腸發(fā)酵溫度感官評價結(jié)果Fig.3 Results of sensory evaluation for the fermentation temperature in fermented pufferfish sausage

2.3 發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化

在單因素實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實驗設(shè)計，根據(jù)表2 設(shè)計的因素水平來考察接種量(A)、發(fā)酵時間 (B)、發(fā)酵溫度 (C)這3 個因素對感官評價結(jié)果的影響，分別設(shè)置3 個水平，為接種量2.5%、3.0%和3.5%，發(fā)酵時間10、12 和14 h，發(fā)酵溫度30、35 和40 °C，以上數(shù)據(jù)為表5 中括號內(nèi)數(shù)字，根據(jù)正交性從全面試驗中選擇9 個最具代表性的實驗組合，以感官評分為考察指標(biāo)，確定發(fā)酵工藝條件。正交試驗結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵魚腸工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal experiment for fermented pufferfish sausage technology optimization

根據(jù)正交試驗直觀分析結(jié)果可以得知，接種量的k1為接種量2.5%的考察指標(biāo)，即感官評分結(jié)果：(66.50+59.60+56.80)/3，同理接種量的k2和k3為接種量3.0%和3.5%的感官評分結(jié)果，R值為對應(yīng)的每列k值的最大值減去最小值，發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的結(jié)果以此類推。發(fā)酵條件選擇由k值決定，最佳發(fā)酵工藝條件：接種量3.5%、發(fā)酵時間10 h、發(fā)酵溫度35 ℃。對感官評價結(jié)果的影響主次因素由R值大小決定，即發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵溫度。

2.4 最佳發(fā)酵工藝條件驗證

按照最佳發(fā)酵條件制作發(fā)酵魚腸，實驗組感官評分為79.70 分。對照組發(fā)酵溫度為0 °C，其余條件與實驗組一致，其感官評分為72.50 分。與對照組相比，發(fā)酵后的魚腸口感得到明顯改善。

3 討論

發(fā)酵制品中常用的微生物主要有乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌等[18]。根據(jù)2010 年我國原衛(wèi)生部發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》和新資源食品公告，其中戊糖片球菌、植物乳桿菌、木糖葡萄球菌均為可用于食品加工的微生物，同時木糖葡萄球菌用于肉類生產(chǎn)的時間已超過30 年。因此，本研究采用戊糖片球菌、植物乳桿菌、木糖葡萄球菌作為發(fā)酵劑，制備發(fā)酵河鲀魚腸制品。

有研究表明，葡萄球菌能產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，在pH 值較低的環(huán)境下亞硝酸鹽被分解成NO，同時產(chǎn)生的過氧化氫酶能夠消除乳酸菌代謝所產(chǎn)生的過氧化氫，過氧化氫作為強(qiáng)氧化劑，會對肉類發(fā)酵制品的風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面的影響[19]。此外，蛋白酶和脂肪酶對肉類發(fā)酵制品后期成熟時呈色、呈味與獨特口感的形成有重要影響[20]。也有國外研究人員發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵肉類制品中分離出的凝血酶陰性的葡萄球菌可能是幫助降解硝酸鹽和亞硝酸鹽的主要菌種[21]。此外，采用包含清酒乳桿菌(L.sakei)、彎曲乳桿菌(L.curvatus)和戊糖乳酸菌(L.pentosus)的混合發(fā)酵劑制作香腸，結(jié)果顯著降低了干發(fā)酵香腸中酪胺、尸胺和腐胺的含量[22]。曾雪峰[23]發(fā)現(xiàn)，接種了混合菌發(fā)酵劑的酸魚在發(fā)酵過程中酪胺、尸胺和腐胺的積累受到顯著抑制。因此，使用混合發(fā)酵劑不僅可以抑制腐敗微生物的生長繁殖，還能降低硝酸鹽、亞硝酸鹽、生物胺和過氧化氫等不良的發(fā)酵代謝產(chǎn)物的含量，增加魚肉的安全性、保藏性和功能性[24]。

Kopermsub 等[25]使用鹽水腌制魚肉，在添加大米和蒜末后得到泰國的傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品plaasom。有研究人員采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)研究魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌群落演替的規(guī)律，結(jié)果顯示，在發(fā)酵6 個月時細(xì)菌種數(shù)達(dá)到最大 (312種)，發(fā)酵12 個月時菌群多樣性有所下降，菌群間的差異變小，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為整個發(fā)酵過程中的主要菌種類型，聯(lián)合GC-MS 檢測其揮發(fā)性成分，篩選得到9 種呈香風(fēng)味化合物[26]。有研究測定了日本傳統(tǒng)食物Narezushi 的抗氧化能力和對超氧陰離子自由基的清除能力，鑒定得出5 株乳酸菌能夠發(fā)酵乳糖，在培養(yǎng)基中生長能清除DPPH 和超氧陰離子，在發(fā)酵牛奶時，也表現(xiàn)出同樣的協(xié)同效應(yīng)[27]。對魚露發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味成分和脂肪酸組分變化進(jìn)行研究，采用GC-MS 在5 個不同的發(fā)酵時間點進(jìn)行檢測，得到了7 大類56 種揮發(fā)性化合物，以香氣活力值(OVA)為依據(jù)篩選出12 種對魚露風(fēng)味貢獻(xiàn)顯著的主體呈香化合物，魚露中的脂肪酸主要為C15～C26，不飽和脂肪酸(UFA)相對含量高達(dá)67.23%[28]。后續(xù)研究發(fā)酵河鲀魚腸還可通過選擇優(yōu)良發(fā)酵菌種、比較發(fā)酵產(chǎn)物對產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)形成的影響等方面開展探討。

4 結(jié)論

本研究以暗紋東方鲀?yōu)橹饕?，以戊糖片球菌、植物乳桿菌、木糖葡萄球菌為發(fā)酵劑，建立了基于模糊數(shù)學(xué)綜合評價法進(jìn)行感官評價的方法，發(fā)酵河鲀魚腸的最優(yōu)輔料配方為葡萄糖添加量3%、食用鹽添加量2%、馬鈴薯淀粉添加量10% (均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，最佳發(fā)酵條件為接種量3.5%、發(fā)酵時間10 h、發(fā)酵溫度35 °C，感官評分為79.70 分。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）