楊西西，池洪樹，鄭在予，劉曉東，羅潘潘，許斌福，陳秀霞，龔 暉*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建 福州 350002；3.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

大黃魚(Larimichthys crocea)是中國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海水魚類[1]，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，大黃魚病害問題日益突出，已成為制約大黃魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素[2]。何愛華等[3]通過電鏡從夏季發(fā)病的大黃魚幼魚中發(fā)現(xiàn)了虹彩病毒(Iridovirus)，Chen 等[4]證實1999—2001 年夏季福建省寧德、羅源等地養(yǎng)殖大黃魚幼魚暴發(fā)性死亡由虹彩病毒感染所致，根據(jù)組織病理學、形態(tài)學和分子生物學特征分析，確認該病毒屬于腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus)，并將其命名為大黃魚虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus,LYCIV)。近年來，養(yǎng)殖大黃魚中常有腫大細胞病毒檢出[5-6]，但受限于無敏感細胞系，研究無法深入開展，開展的研究主要集中于病毒檢測方法的建立和部分功能基因的分析[7-10]。已有團隊建立了對ISKNV 型和RSIV 型腫大細胞病毒高度敏感的鱖(Siniperca chuatsi)仔魚細胞系(mandarin fish fry cell line-1，MFF-1)，基于MFF-細胞可實現(xiàn)ISKNV 型和RSIV型腫大細胞病毒持續(xù)、穩(wěn)定地傳代[11-15]。本研究利用MFF-1 細胞系分離培養(yǎng)大黃魚腫大細胞病毒，對病毒的主要衣殼蛋白基因(major capsid protein，mcp)進行比較分析，以期為大黃魚腫大細胞病毒病的研究和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

病料 2018—2020 年間所采集，用國家標準GB/T 36191—2018[16]中的1F/R 引物PCR 檢測呈陽性的大黃魚肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟組織，存于-80 °C。(表1)

表1 實驗所用的大黃魚病料Tab.1 Pathologicalspecimens of L.crocea used in the experiment

細胞系 鱖仔魚細胞系MFF-1。

引物 根據(jù)NCBI 上的登錄的LYCIV 的mcp(GenBank: AY779031.1)，利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計擴增全長mcp的引物，上游引物mcpF：ATGTCTGCGATCTCAGGTGC，下游引物mcpR：TTACAGGATAGGGAAGCCTGC，預期擴增片段大小為1 362 bp。

實驗試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、含EDTA 和酚紅的胰酶、青霉素和鏈霉素雙抗(Gibco)，血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。病毒基因組DNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒(Omega Bio-Tek)、2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、瓊脂糖粉末、50×TAE 瓊脂糖電泳緩沖液[生工生物工程(上海)股份有限公司]。DL2000 DNA Marker、pMD-19T 載體克隆試 劑 盒、TB Green?Premix ExTaq? Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，日本)。Triton X-100 (Sigma-Aldrich，美國)。組織固定液：2.5%戊二醛(Sigma-Aldrich，美國)，取25%戊二醛10 mL，0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4) 50 mL，ddH2O 定容至100 mL，4 °C 保存。

1.2 細胞培養(yǎng)

MFF-1 細胞用DMEM 培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)于25 cm2細胞瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2，27 °C，飽和濕度。0.25%胰酶消化、傳代。

1.3 病毒分離、接種與傳代

分別將凍存于-80 °C，采自福鼎和寧德沙澳的大黃魚幼魚病料(FD201807 和SA201808)腎臟組織裝入1.5 mL 離心管中，加入適量的0.1 mol/L PBS (pH 7.4)，在冰浴條件下研磨成漿。4 °C，4 602 ×g離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，取500 μL 濾過液加入已棄去培養(yǎng)液的單層MFF-1 細胞中，靜置1 h，加入5 mL維持液(含2% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每12 小時觀察1 次，若7 d 內(nèi)無病變，細胞與培養(yǎng)液一并收集，凍融3 次后，凍融液于4 °C，2 348 ×g離心10 min，收集上清液，與維持液以1∶10 的比例感染單層MFF-1 細胞繼續(xù)傳代，每7 天盲傳1 次，直至出現(xiàn)細胞病變(cytopathic effects，CPE)，80%細胞出現(xiàn)CPE時將細胞與培養(yǎng)液一并收集，按以上方法繼續(xù)傳代。

1.4 電鏡觀察

收集病毒感染細胞，棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化，吹洗一下細胞，2 348×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 組織固定液重懸沉淀，再次2 348 ×g離心5 min，棄上清液，補充1 mL 組織固定液，4 °C 保存2 d 后，委托中山大學生命科學學院電鏡室按董傳甫[12]的方法進行漂洗、脫水、包埋、超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，最后通過JEM-1400 透射電鏡觀察。

1.5 病毒全長mcp 的克隆、測序與分析

按病毒基因組DNA 提取試劑盒產(chǎn)品說明書分別提取FD201807 和SA201808 組織勻漿液、15代次的病毒感染細胞凍融液，以及其他15 個大黃魚病樣組織勻漿液總DNA 作為模板。以全長mcp引物進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix (Dye Plus) 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA 模板 2 μL，補充ddH2O 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 °C 變性5 s；94 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min 20 s，共32 個循環(huán)；72 °C延伸5 min。

凝膠電泳后，按照膠回收試劑盒說明書回收目的基因，連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，用含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板篩選陽性克隆，隨機挑取3 個陽性克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，通過NCBI-BLAST 將FD201807株和SA201808 株mcp與GenBank 數(shù)據(jù)庫中腫大細胞病毒mcp進行比對分析，用MEGA 4 軟件分別對上述2 株病毒的mcp與GenBank 數(shù)據(jù)庫中腫大細胞病毒以及15 個大黃魚病料中檢出的腫大細胞病毒mcp進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒對細胞的感染

FD201807 和SA201808 的病料組織勻漿液感染MFF-1，盲傳3 代均未出現(xiàn)明顯的細胞病變，第4 代感染細胞開始出現(xiàn)病變，病變的主要表現(xiàn)為細胞脫壁、變圓，折光率增強，隨著培養(yǎng)時間的延長，脫壁細胞逐漸增多，同時培養(yǎng)液中的顆粒增加，第4 代FD201807 株感染細胞10 d 的細胞病變率達80%，第4 代SA201808 株感染細胞病變率達到80%的時間為12 d。隨著代次的增加，病毒感染細胞病變周期逐漸縮短，第15 代FD201807 株感染細胞48 h 時病變率達50%以上，72 h 時細胞病變率達80%以 上。第15 代SA201808 株感染細胞72 h 時部分細胞出現(xiàn)病變，168 h 時細胞病變率近80%。(圖版Ⅰ)

2.2 病毒結(jié)構(gòu)特征

電鏡觀察病毒感染細胞，可見細胞質(zhì)內(nèi)存在大量散在的六邊形病毒粒子和空殼，直徑130～150 nm(圖版Ⅱ)。

2.3 病毒全長mcp 基因的克隆、測序結(jié)果

用所設(shè)計的腫大細胞病毒全長mcp引物對FD201807 和SA201808 的組織勻漿液和15 代病毒的細胞凍融液進行PCR 擴增，均得到了大小約1 300 bp 的單一目的條帶(圖1)。

圖1 FD201807 株和SA201808 株全長mcp 擴增結(jié)果M.DL2000 DNA Marker；1.FD201807 組織勻漿液；2.SA201808 組織勻漿液；3.第15 代FD201807 株感染的MFF-1 細胞凍融液；4.第15代SA201808 株感染的MFF-1 細胞凍融液；5.MFF-1 細胞凍融液。Fig.1 Completemcp sequences amplification from isolate FD201807 and SA201808M.DL2000 DNA Marker;1.FD201807 tissue homogenate;2.SA201808 tissue homogenate;3.freeze-thawed MFF-1 cells infected with FD201807,passage 15;4.freeze-thawed MFF-1 cells infected with SA201808,passage 15;5.freeze-thawed MFF-1 cells.

圖版Ⅰ 15 代次FD201807 和 SA201808 感染MFF-1 細胞的病變過程1～3.FD201807 株接種后0、48 和72 h；4～6.SA201808 株接種后0、72 和168 h。Plate Ⅰ Cytopathic effects of MFF-1 infected FD201807 and SA201808 at passage151-3.0,48 and 72 h after FD201807 inoculation,respectively;4-6.0,72 and 168 h after SA201808 inoculation,respectively.

圖版Ⅱ 病毒感染的MFF-1 細胞電鏡照片1.14 代次FD201807 株感染MFF-1 細胞72 h 后的電鏡照片(6 000×)；2.第一幀圖片的局部放大(15 000×)；3.14 代次SA201808 株感染MFF-1 細胞144 h 后的電鏡照片(5 000×)；4.第3 幀圖片的局部放大(15 000×)。Plate Ⅱ Electron micrograph of virus-infected MFF-1 cells1.MFF-1 cell infected with FD201807,passage 14,72 h post inoculation (6 000×);2.local zoom of frame 1 (15000×);3.MFF-1 cell infected with SA201808,passage 14,144 h post inoculation (6 000×);4.local zoom of frame 3 (15 000×).

分別對上述目的條帶進行膠回收和克隆測序。結(jié)果顯示FD201807、SA201808 的組織勻漿液和15 代病毒細胞凍融液PCR 擴增產(chǎn)物均為1 362 bp。FD201807 株、SA201808 株與其他相關(guān)的腫大細胞病毒分離株比較分析表明，F(xiàn)D201807 株和SA201808 株屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus)的不同病毒分離株。SA201808 株與 LYCIV-Zhoushan (GenBank:MW139932.1)的mcp核酸序列僅有1 個堿基差異，與LYCIV (GenBank: AY779031.1)mcp有5 個堿基差異。FD201807 株與SA201808 的mcp有21 個堿基差異，與花鱸虹彩病毒(Lateolabrax macu-latusiridovirus,LMIV) (GenBank: MH577517.1)mcp存在1 個堿基差異(圖2)。

圖2 FD201807 株、SA201808 株、LYCIV、LYCIV-Zhoushan 與LMIV-1 706 的 mcp 序列比對灰色區(qū)域為5 個序列中相似度為60%的堿基，黑色區(qū)域為5 個序列中相似度為80%的堿基。Fig.2 mcp sequences alignment of FD201807,SA201808,LYCIV,LYCIV-Zhoushan and LMIV-1706Grey area.the bases with 60% similarity among the 5 sequences;black area.the bases with 80% similarity among the 5 sequences.

(圖2 Fig.2)

與已知的腫大細胞病毒mcp聚類分析結(jié)果顯示，SA201808 株、FD201807 株歸屬腫大細胞病毒RSIV 基因型，SA201808 株與FD201807 株有一定的遺傳距離(圖3)。

圖3 腫大細胞病毒mcp 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on mcp of Megalocytivirus

FD201807 株、SA201808 株與其他15 株大黃魚腫大細胞病毒mcp的聚類分析結(jié)果表明，12 株大黃魚腫大細胞病毒的mcp序列與SA201808 聚類；另3 株大黃魚腫大細胞病毒mcp與FD201807以及LMIV(MH577517.1)聚類(圖4)。

圖4 大黃魚腫大細胞病毒分離株mcp 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on mcp gene of the Megalocytivirus isolated from L.crocea

3 討論

虹彩病毒科可分為α 虹彩病毒亞科(Alphairidovirinae)和β 虹彩病毒亞科(Betairidovirinae)，α 虹彩病毒亞科病毒主要感染硬骨魚類、兩棲類和爬行類等冷血脊椎動物，分為淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、腫大細胞病毒屬和蛙病毒屬(Ranavirus) 3 個屬[17]。腫大細胞病毒屬病毒僅感染硬骨魚類，是魚類的主要病原[18]，Inouye 等[19]于1990 年在養(yǎng)殖真鯛(Pagrus major)上首次發(fā)現(xiàn)真鯛虹彩病毒(red sea bream virus,RSIV)。吳淑勤等[20]于1997 年從鱖上發(fā)現(xiàn)一種直徑約為150 nm的病毒，He 等[21]對該病毒開展了研究，將該病毒命名為脾腎壞死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)了20余種腫大細胞病毒，感染對象包括鱸形目(Perciformes)、鰈形目 (Pleuronectiformes)、鱈形目(Gadiformes)和鲀形目(Tetraodontiformes)等近百種魚類[22-24]。適合腫大細胞病毒培養(yǎng)的細胞系較少，在病毒培養(yǎng)過程中常遇到細胞病變緩慢、病毒滴度低或難以穩(wěn)定傳代的問題[23]。Ao 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚腫大細胞病毒可在BF-2 細胞系上增殖，但未見大黃魚腫大細胞病毒引起細胞病變的報道，本研究利用MFF-1 細胞對大黃魚腫大細胞病毒進行了分離培養(yǎng)，經(jīng)過3 代盲傳后，大黃魚腫大細胞病毒感染的細胞表現(xiàn)出典型的腫大細胞病毒細胞病變特征，經(jīng)過15 個代次的傳代，病毒的感染力并未減弱，CPE 的周期縮短，說明MFF-1 細胞適用于大黃魚腫大細胞病毒的培養(yǎng)。此外從本研究結(jié)果來看，不同來源的大黃魚腫大細胞病毒對MFF-1 細胞的易感性存在差異，這種差異產(chǎn)生的原因還有待進一步研究。

虹彩病毒的mcp相對保守，因此常被用于虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析[26-29]，根據(jù)mcp或ATPase可將腫大細胞病毒分成 RSIV、ISKNV 和 TRBIV三個基因型[18]。本研究結(jié)果表明，SA201808 株和FD201807 株的mcp與RSIV 基因型病毒的mcp聚類，SA201808 株的mcp與已報道的大黃魚腫大細胞病毒同源性高，而FD201807 與花鱸虹彩病毒的mcp(GenBank: MH577517.1)高度一致，同時從17 株大黃魚腫大細胞病毒mcp的聚類分析來看，不同的大黃魚腫大細胞病毒分布與年份、養(yǎng)殖區(qū)域和魚體大小無直接相關(guān)性，同一時間同一養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)可同時存在2 種大黃魚腫大細胞病毒，推測大黃魚腫大細胞病毒可能有不同來源且可跨物種感染。大黃魚腫大細胞病毒的傳播途徑和進化關(guān)系如何，還需做更大范圍的調(diào)查分析。

本研究實現(xiàn)了大黃魚腫大細胞病毒的穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，為該病毒的致病性研究和疫苗研發(fā)提供了條件，通過對大黃魚腫大細胞病毒的mcp比較分析，為大黃魚腫大細胞病毒病的流行病學研究和防控提供了參考。

感謝中山大學生命科學學院董傳甫課題組為本研究提供細胞系。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）