何耀海

(廣西省防城港市第一人民醫(yī)院病理科, 廣西 防城港 538021)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)即大腸癌,包括結(jié)腸癌與直腸癌,全球范圍內(nèi),結(jié)直腸癌是第三位最常見的惡性腫瘤,也是第二位最常見的惡性腫瘤死亡原因,而隨著居民飲食習(xí)慣改變,我國結(jié)直腸癌發(fā)病率也逐年升高[1]。結(jié)直腸癌根治術(shù)為治療CRC主要方式,但術(shù)后存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況使得患者總體預(yù)后仍不能令人滿意。富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白耦聯(lián)受體5(Leucine-rich G-protein-coupled receptor 5,LGR5)系一種糖蛋白激素受體,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2]。人表皮生長因子受體2(Human epidermogenic factor receptor 2,Her-2)是一種表皮生長因子,在多種惡性腫瘤中均有表達(dá),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲[3]。Ki-67為常用細(xì)胞增殖抗原,同時(shí)也為腫瘤標(biāo)志物之一。本研究擬通過分析LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中表達(dá),觀察其和臨床病理參數(shù)的關(guān)系,并探討三者對患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2020年1月至2021年7月防城港市第一人民醫(yī)院收治的132例結(jié)直腸癌患者臨床資料。男75例,女57例,年齡為45～76歲,平均(60.50±5.70)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合文獻(xiàn)[4]中關(guān)于原發(fā)性CRC的診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為腺癌;②術(shù)前未接受放、化療治療;③均行結(jié)直腸癌根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并除CRC外的其他惡性腫瘤;②合并嚴(yán)重肝腎功能障礙;③合并自身免疫病;④合并嚴(yán)重感染性疾病;⑤臨床資料不完整。

1.2方 法

1.2.1臨床病理參數(shù)收集:收集性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等臨床病理參數(shù)。

1.2.2標(biāo)本采集:患者入院后均接受結(jié)直腸癌根治術(shù)治療,術(shù)后留存新鮮(離體30min內(nèi))癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5cm)標(biāo)本,置于EP管內(nèi),液氮冷凍并于-80℃下冷藏待測。

1.2.3主要試劑:鼠抗人LGR5單克隆抗體、鼠抗人Her-2單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、免疫組化SP-9000試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10%山羊血清封閉液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測:采用免疫組化SP法檢測LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達(dá)水平。①取組織石蠟包塊,常規(guī)切片(LGR5為3μm,Her-2為4μm,Ki-67為5μm)、脫蠟處理;②高壓修復(fù)抗原;③阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶;④滴加羊血清封閉;⑤滴加采用PBS稀釋(LGR5稀釋比為1∶300,Her-2稀釋比為1∶100,Ki-67稀釋比為1∶400)鼠抗人一抗,PBS沖洗;⑥滴加經(jīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗;⑦滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶(SP);⑧DAB顯色;⑨蘇木素復(fù)染;⑩脫水、透明、封片、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5結(jié)果判讀:結(jié)果由2位資深病理醫(yī)師雙盲法單獨(dú)閱片,于高倍鏡下(×400倍)隨機(jī)挑選5個(gè)視野,每個(gè)視野選取100個(gè)細(xì)胞。LGR5在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中呈黃色、棕黃色顆粒即視為陽性表達(dá),Her-2在胞膜中呈棕黃色顆粒即視為陽性表達(dá),Ki-67在細(xì)胞核中呈黃色、棕黃色顆粒即視為陽性表達(dá)。LGR5采用染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞占比乘積進(jìn)行半定量分析:染色強(qiáng)度:無染色計(jì)0分,淺黃色計(jì)1分、黃色計(jì)2分,棕黃色計(jì)3分;陽性細(xì)胞占比:≤5%計(jì)0分,6%～25%計(jì)1分,26%～50%計(jì)2分,51%～75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分,乘積得分0～4分為陰性表達(dá),5～12分為陽性表達(dá)。Her-2參考文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn)判定:無染色或<10%細(xì)胞膜染色為陰性(-),>10%細(xì)胞膜不完整染色為(+),>10%細(xì)胞膜完整較弱染色為(++),>30%細(xì)胞膜完整較強(qiáng)染色為(+++),(-)納入陰性表達(dá)組,(+)、(++)、(+++)納入陽性表達(dá)組。Ki-67采用陽性細(xì)胞占比進(jìn)行半定量分析:≤10%為(-),11%～25%為(+),26%～50%為(++),>50%為(+++),(-)納入陰性表達(dá)組,(+)、(++)、(+++)納入陽性表達(dá)組。

1.3隨訪及預(yù)后分組:術(shù)后隨訪12個(gè)月(電話或回院復(fù)查形式隨訪),獲悉患者預(yù)后,并根據(jù)預(yù)后情況分為預(yù)后良好組(114例)、預(yù)后不良組(18例)。預(yù)后良好:截止至隨訪結(jié)束生存,且未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移;預(yù)后不良:截止至隨訪結(jié)束任何原因所致死亡,或出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件處理。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示,行χ2/Fisher確切概率分析法檢驗(yàn);采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估預(yù)測價(jià)值,曲線下面積(AUC)0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性,AUC>0.9時(shí)準(zhǔn)確性較高。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LGR5、Her-2、Ki-67蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中陽性表達(dá)情況比較:CRC組織中LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。

表1 LGR5 Her-2 Ki-67蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中陽性表達(dá)情況比較n(%)

2.2LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達(dá)與CRC患者臨床病理參數(shù)關(guān)系:LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達(dá)與CRC患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度等無關(guān)(P>0.05)。LGR5、Ki-67蛋白表達(dá)與浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05);Her-2蛋白表達(dá)與浸潤程度無關(guān)(P>0.05),而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 LGR5 Her-2 Ki-67蛋白表達(dá)與CRC患者臨床病理參數(shù)關(guān)系n(%)

2.3不同預(yù)后患者LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達(dá)情況比較:預(yù)后不良組患者LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達(dá)率均高于預(yù)后良好組患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后患者LGR5 Her-2 Ki-67蛋白陽性表達(dá)情況比較n(%)

2.4LGR5、Her-2、Ki-67蛋白對CRC患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值分析:以CRC患者預(yù)后為因變量(1=預(yù)后良好組,2=預(yù)后不良組),將LGR5、Her-2、Ki-67蛋白(1=陽性,2=陰性)納入Logistic回歸分析模型,結(jié)果見表4?？梢奓GR5、Her-2蛋白陽性表達(dá)是預(yù)測CRC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子(P<0.05)。Ki-67蛋白不是預(yù)測CRC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子(P>0.05)。經(jīng)計(jì)算可得,LGR5蛋白陽性表達(dá)預(yù)測CRC患者預(yù)后敏感度、特異度分別為66.7%、43.0%,Her-2蛋白為72.2%、72.8%。通過公式兩項(xiàng)聯(lián)合的預(yù)測指數(shù)=LGR5蛋白+(1.869/2.523)*Her-2蛋白繪制ROC曲線。結(jié)果顯示,兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測AUC為0.804(0.709～0.899),敏感度、特異度為94.4%、82.5%,均高于LGR5、Her-2蛋白單項(xiàng)檢測,表明兩項(xiàng)聯(lián)合檢測的預(yù)測價(jià)值較高。見圖1。

圖1 兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測CRC患者預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

CRC為高度生物學(xué)異質(zhì)性惡性腫瘤之一,術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高。探尋新型分子標(biāo)志物對CRC診斷、病情評估、治療方法選擇以及預(yù)測預(yù)后意義重大。本研究通過免疫組化法檢測LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,探討其是否可作為CRC病情評估及預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。

LGR5為一種胃腸道腫瘤標(biāo)志物,有研究指出,LGR5陽性細(xì)胞具備極強(qiáng)的自我增殖、分化、更新能力,在CRC發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。陳懇等[6]研究顯示,LGR5在人CRC癌前病變中表達(dá)異常升高,推測CRC可能由LGR5陽性細(xì)胞發(fā)展而來。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中LGR5蛋白陽性表達(dá)率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),LGR5蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無關(guān),但和浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),說明LGR5蛋白可能在CRC腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列過程中扮演關(guān)鍵角色。分析原因?yàn)?LGR5蛋白通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)CRC發(fā)生發(fā)展,還可通過抑制Slug、N-cadherin等細(xì)胞黏附分子表達(dá),促進(jìn)上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

Her-2系迄今為止研究最多的乳腺癌相關(guān)基因,其過表達(dá)不但和腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),而且還是一個(gè)重要的臨床治療監(jiān)測及預(yù)后指標(biāo)[7]。國內(nèi)外關(guān)于Her-2蛋白在CRC組織中表達(dá)情況報(bào)道差異較大,其陽性表達(dá)率為1.6%～81.9%不等[8-9]。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中Her-2蛋白陽性表達(dá)率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),Her-2蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤程度無關(guān),但和TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),說明Her-2蛋白可能參與了CRC腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程?？紤]原因?yàn)?Her-2蛋白可通過促進(jìn)腫瘤組織形成新生血管及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

Ki-67為一種目前廣泛使用的細(xì)胞增殖抗原,已有研究表明,其表達(dá)水平和腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及患者預(yù)后有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),Ki-67蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無關(guān),但和浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),說明Ki-67蛋白可能參與了CRC腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。究其原因?yàn)?Ki-67蛋白可通過減弱同質(zhì)性細(xì)胞間的黏附力以及重塑細(xì)胞外基質(zhì)來促進(jìn)腫瘤組織新生血管形成,從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

此外,本研究結(jié)果顯示,LGR5、Her-2單獨(dú)檢測對CRC患者預(yù)后預(yù)測價(jià)值較低,而當(dāng)兩項(xiàng)聯(lián)合檢測時(shí),AUC、敏感度、特異度均明顯提高,表明兩項(xiàng)聯(lián)合檢測的預(yù)測價(jià)值較高。

綜上所述,LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中呈高表達(dá),其表達(dá)水平和患者臨床病理參數(shù)密切相關(guān),LGR5、Her-2兩項(xiàng)聯(lián)合檢測對患者預(yù)后具有較高預(yù)測價(jià)值。