陳思源,項永晶,李正勝,謝娟,黃波,黃海平,汪丹丹,趙姣,李億,陳靜

膜性腎病(MN)是以腎小球基底膜上皮細胞下免疫復合物的沉積和基底膜(GBM)增厚為特征的一種自身免疫性疾病,是常見的腎病綜合征類型之一,以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫、高脂血癥等為臨床表現(xiàn)[1-2]。MN可分為原發(fā)性膜性腎病(PMN)和繼發(fā)性膜性腎病(SMN);PMN較為常見,占75%～80%[3]。PMN患者10年內(nèi)約1/3能自發(fā)緩解,約1/3在治療后仍會進展為終末期腎臟病[1];現(xiàn)代醫(yī)學治療主要為激素聯(lián)合免疫抑制劑,臨床療效明顯,但存在不良反應(yīng)、藥物撤減困難及病情反復、肝腎毒性大等問題[4]。中醫(yī)學近年對PMN的認識不斷深入,國內(nèi)研究顯示中西醫(yī)結(jié)合治療PMN的臨床效果優(yōu)于單純西藥治療[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論的新學科,能從整體探索藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性,提高藥物治療效果、減少不良反應(yīng),指導新藥研發(fā)和提高新藥臨床試驗成功率[7]。

1 材料與方法

1.1 靶點篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP,以“地錦草”為關(guān)鍵詞搜索,篩選出口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18的信息。應(yīng)用蛋白質(zhì)序列和功能信息資源數(shù)據(jù)庫Uniprot將有效成分的靶點與基因名進行匹配,得到中藥靶點。應(yīng)用Gene Cards疾病數(shù)據(jù)庫,以“primary membranous nephropathy”為關(guān)鍵詞進行檢索,得到疾病靶點。

1.2 地錦草和PMN交集靶點的獲取及蛋白互作(PPI) Venny中獲取地錦草與PMN交集靶點,導入String數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo Sapiens”,設(shè)置最低置信度≥0.90,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò);將PPI網(wǎng)絡(luò)圖下載并上傳至Cytoscape軟件中,根據(jù)Degree值篩選核心靶點。

1.3 GO和KEGG富集分析及數(shù)據(jù)可視化 利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO生物功能分析,得到生物過程(BP)、細胞成分(CC)、分子功能(MF)三組條目,以P<0.05的條件進行篩選,各取前20個條目,即組成60個條目在“微生信”在線繪圖工具中進行可視化;利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG富集通路分析,限定物種為“Homo Sapiens”,制作KEGG富集氣泡圖。將地錦草成分-PMN靶點—數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件中進行可視化。

1.4 核心成分與核心靶點的分子對接 基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB和Pub Chem數(shù)據(jù)庫下載成分和靶蛋白結(jié)構(gòu),基于AutoDock tool進行分子對接,使用Pymol進行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 靶點篩選 地錦草有7個有效成分,包括MOL001002、MOL000359、MOL000422、MOL006321、MOL006326、MOL006331、MOL000098。255個藥物靶點,利用Uniprot數(shù)據(jù)庫刪除重復值,成功匹配到136個中藥靶點?；贕ene Cards數(shù)據(jù)庫,以“primary membranous nephropathy”為關(guān)鍵詞進行檢索,得到3 592個疾病靶點。

2.2 地錦草有效成分與PMN PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及主要靶點的篩選 102個交集靶點(圖1)導入String數(shù)據(jù)庫中,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行分析。結(jié)果顯示,網(wǎng)絡(luò)共包含102個蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)之間有1 798個關(guān)聯(lián)信息,有效成分靶點—疾病靶點網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點平均相連35.3條邊,見圖2(第181頁)。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖下載并上傳至Cytoscape軟件中,對結(jié)果進行拓撲分析后得到關(guān)聯(lián)度最高的4個核心靶點RELA、MAPK1、TP53、AKT1,見圖3。

圖1 地錦草與PMN的交集靶點

圖2 地錦草有效成分與PMN的 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 地錦草治療PMN的主要靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO生物功能富集分析 在Metascape數(shù)據(jù)庫中分析GO生物功能,得到BP條目1 449個,CC條目61個,MF條目135個,以P<0.05的條件分別進行篩選,各取前20個條目,結(jié)果顯示,在地錦草有效成分與PMN的交集靶點中,BP主要集中在腫瘤壞死因子反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)和細胞來源分子的細胞反應(yīng)等;CC主要集中在絲氨酸蛋白酶抑制劑復合物、蛋白酶抑制劑復合物和肽酶抑制劑復合物等;MF主要集中在轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性和核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等,見圖4。

圖4 GO功能富集分析圖

2.4 KEGG通路富集分析 在Metascape數(shù)據(jù)庫中進行KEGG富集通路分析,得到相關(guān)性最高的前20條信號通路(P<0.01),結(jié)果顯示,富集顯著性最高的前3條通路分別是:癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切力和動脈粥樣硬化,見圖5。

圖5 KEGG通路氣泡圖

2.5 地錦草有效成分—交集靶點—通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape軟件中的“Analyze Network”工具得到地錦草有效成分—交集靶點—通路網(wǎng)絡(luò)圖,見圖6(第181頁)。根據(jù)Degree值顯示,前2位有效成分是:槲皮素、山奈酚,4位核心靶點是:TP53、AKT1、MAPK1、RELA,且上述靶點均富集于癌癥通路與HIF-1信號通路中,由此可見,癌癥通路及HIF-1信號通路可能是地錦草治療PMN機制的重要通路之一。

2.6 分子對接 將地錦草治療PMN的核心成分槲皮素和山奈酚分別與核心靶點TP53、AKT1、MAPK1、RELA進行分子對接,根據(jù)閾值得到8組配體—受體對接結(jié)果,以結(jié)合能篩選結(jié)合活性較好的靶點,其中結(jié)合能≤-5 kcal/mol認為配體與靶點之間具有較好的結(jié)合活性。TP53、AKT1、MAPK1、RELA與槲皮素和山奈酚均具有很好的結(jié)合活性,其中,槲皮素、山奈酚與TP53的結(jié)合活性最強,見表1。

表1 分子對接結(jié)果

3 討 論

PMN是國內(nèi)外引起腎病綜合征的常見病理類型之一,其治療無特異性[8];地錦草是醫(yī)院腎內(nèi)科治療腎臟病的常用中藥,前期研究表明地錦草對腎小球疾病的治療安全有效,但機制尚不清楚[9]。

本文篩選出地錦草的有效成分槲皮素和山奈酚,可能是地錦草治療PMN的核心成分。槲皮素具有抗炎、抗氧化特性,且能通過拮抗腫瘤壞死因子-α誘導的NF-κB/β-catenin信號通路,阻斷NF-κB活化,改善腎損傷[10]。NF-κB是介導MN腎損傷多條信號通路中的一條,它調(diào)控許多參與PMN發(fā)生發(fā)展過程的基因表達;同時能調(diào)控IL-1、IL-6、IL-8等參與機體炎性反應(yīng)過程[11];它通過引起感染、損傷或自身免疫因素參與實驗和人類腎臟炎性相關(guān)疾病的發(fā)生[12]。山奈酚具有抗炎作用,可抑制自由基引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和腎損傷[13-14];山奈酚通過調(diào)節(jié)AMPK/NOX4通路,發(fā)揮腎臟保護作用,同時能抑制腎癌細胞增殖[15-16]。

TP53是一種轉(zhuǎn)錄因子,有研究表明TP53對MN腎臟病理有一定提示作用[17];最近一項研究表明TP53與腎損傷密切相關(guān)[17];TP53可抑制mTOR,增強自噬,調(diào)節(jié)自噬水平,可明顯減少足細胞損傷延緩MN進展,自噬存在PMN中[18];在腎病中,TP53也是腎小管細胞損傷和凋亡的主要遞質(zhì)[19]。MAPK1的激活與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)[20];通過激活的MAPK1誘導花生四烯酸促進NF-κB信號通路可引起腎臟細胞損傷[21],在Wang等[22]研究中過度激活的NF-κB通路與巨噬細胞誘導的腎纖維化相關(guān)。AKT1是P13K重要的下游因子,P13K/AKT參與了腎纖維化過程;Lin等[23]研究表明AKT1信號傳導可減輕腎損傷,保護腎功能,并顯著提高缺血再灌注損傷后的存活率(分別為76.9%和20.8%);AKT1可能參與藥物治療MN過程。RELA是NF-κB家族成員,NF-κB的激活是MN腎臟疾病慢性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵[24]。HIF-1信號通路是有機體的低氧應(yīng)激通路,且對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用。

4 小 結(jié)

地錦草治療PMN可能是槲皮素、山奈酚通過NF-κB及HIF-1信號通路作用于TP53、AKT1、MAPK1、RELA靶點,通過降低炎性反應(yīng)水平、抑制腎臟纖維化等機制對MN發(fā)揮作用。雖本研究體現(xiàn)了多成分、多靶點、多通路的特點,可為地錦草治療PMN提供新思路,但網(wǎng)絡(luò)藥理學仍存在一定局限性,本文的研究結(jié)果仍需通過相關(guān)實驗進一步研究證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。