張楠 張婷婷

【摘要】目的 通過多種檢測方法分析HA-RGD對細胞活性因子修復功效的影響。方法 利用一定的比例構建HA-RGD、細胞活性因子組合物1和組合物2，在細胞水平和人體水平分別評估其對皮膚的修復效果。結果 組合物1和組合物2中受試者人體安全斑貼試驗結果均為陰性，未出現(xiàn)不良反應，安全性良好；基于細胞遷移實驗，組合物1和組合物2與空白對照相比，相對遷移平均值顯著升高（P<0.01）；且組合物2和陽性對照效果相似；組合物1和組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周和4周時顯著低于0周時（P<0.01），且呈極顯著性下降趨勢（P<0.001）；根據(jù)受試者28 d的檢測數(shù)值，組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周、4周時的下降數(shù)值均顯著大于組合物1（P<0.01）。結論 HA-RGD對細胞活性因子的修復效果有一定的促進作用，能進一步提升細胞活性因子的修復效果，滿足更大的皮膚修復需求市場。

【關鍵詞】多氨基酸多糖縮合物；細胞活性因子；皮膚修復

中圖分類號：R392 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）18-0070-04

Study on the Effect of HA-RGD on the Repair Efficacy of Cell Active Factor

ZHANG Nan， ZHANG Ting-ting

（Xian Bohong Biotechnology Co. Ltd.， Xian 710032， Shaanxi， China）

【Abstract】Objective To analyze the effect of HA-RGD on the repair effect of cell active factors by various detection methods. Methods HA-RGD， cell active factor composition 1 and composition 2 were constructed in a certain proportion， and their repair effects on skin were evaluated at the cellular level and human level， respectively. Results Human safety patch test of subjects in combination 1 and combination 2 were negative， no adverse reactions occurred， and the safety was good. Based on the cell migration experiment， the average relative migration of composition 1 and composition 2 was significantly higher than that of blank control （P<0.01）， and the effect of compound 2 was similar to that of positive control. The TEWL values of subjects in combination 1 and combination 2 were significantly lower at 2 weeks and 4 weeks than at 0 weeks （P<0.01）， and showed a significant downward trend （P<0.001）. According to the 28-day detection value of the subjects， the TEWL value of the subjects in the combination 2 decreased significantly more than that in the combination 1 at 2 weeks and 4 weeks （P<0.01）. Conclusion HA-RGD has a certain promoting effect on the repair effect of cell active factors， which can further improve the repair effect of cell active factors and meet the larger market demand for skin repair.

【Key words】Polyamino sugar condesate； Cell active factors； Skin repair

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種能夠自我更新且具有多向分化潛能的成體干細胞[1，2]，其在培養(yǎng)過程中會分泌大量的細胞因子，是除外泌體外另一具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，富含細胞活性關鍵的信息傳遞物質，這種傳遞物質被稱為細胞活性因子[3]。間充質干細胞對體內受到損傷的組織和細胞的功能恢復起到重要作用，也被稱作“生長因子”或“修復因子”[4]，主要在護膚品中，起細胞修護組織再生功能[5]。水解透明質酸鈉-肽（HA-RGD）為多氨基酸多糖縮合物與水解透明質酸組成，其中RGD是一種含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽序列，能與11種整合素特異性結合，能有效促進細胞對生物材料的黏附[6]。整合素是細胞黏附分子家族的重要成員，能介導細胞與細胞、細胞與細胞外間質的黏附及信號傳導，調節(jié)細胞的黏附、遷移、增殖和凋亡等。整合素又分為4個亞族，其中一族就是RGD受體，在RGD受體中整合素αV和β3是研究最早、最深入的亞型之一。研究表明[7]，在部分炎癥過程中，整合素αV和β3可能在成纖維細胞激活和傷口愈合等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。細胞活性因子作為一款具有修復功效的原料，利用超濾濃縮技術將干細胞上清液中的細胞活性因子分離出來[8]。為了進一步提升其修復效果，滿足更大的皮膚修復需求市場，本研究利用HA-RGD對于生物材料的黏附性以及其能與整合素特異性結合的特點，通過設計細胞水平和人體水平的實驗方案并根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，研究HA-RGD對于細胞活性因子修復功效的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 水解透明質酸鈉-肽（HA-RGD>99%）：所需原料由陜西未來生物基質工程有限公司固定原料商提供，規(guī)格：1 g/支；細胞活性因子（>0.6 mg/ml）由陜西未來肉膳健康科技有限公司固定原料商提供，規(guī)格：500 ml/瓶。本次測試所用細胞為成纖維細胞（廣東博溪生物科技有限公司），低糖DMEM培養(yǎng)液（博溪生物）、新生牛血清（NBS，蘭州榮曄）、細胞培養(yǎng)板（BIOFIL，24孔）。測試志愿者由西安博鴻生物技術有限公司召集。SKINLAB COMBO（Cortex Technology，Dermalab）、低致敏膠帶、無屑吸水干紙巾、無塵紙。CO2培養(yǎng)箱（Thermo，150 i）、超凈工作臺（蘇州安泰，SW-CJ-1F）、酶標儀（BioTek，Epoch）、倒置顯微鏡（Olympus，CKX41）。

1.2 方法

1.2.1用于實驗的組合物的制備 按比例稱取細胞活性因子（37.5%）和其他原料進行配制，然后過濾除菌、灌裝、凍干后得到組合物1，備用；同理，按比例稱取原料HA-RGD（0.05%）、細胞活性因子（37.5%）和其他原料進行配制，然后過濾除菌、灌裝、凍干后得到組合物2，備用。

1.2.2安全性驗證 人體斑貼試驗：依照志愿者入選標準招募膚質符合要求的志愿者30名，年齡20～50歲。采用封閉式試驗方法，將受試物置于合適的斑貼試器內，將其用低致敏膠帶貼敷于受試者的手臂曲側，用手掌輕壓使之均勻的貼敷于皮膚上，持續(xù)24 h，空白對照組為受試者不使用產(chǎn)品。分別在24 h后去除受試器，0.5 h、24 h觀察皮膚反應，記錄反應結果。

1.2.3具有皮膚修復功能組合物的研究 ①細胞遷移實驗：細胞遷移是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的刺激后而產(chǎn)生的移動[9]；細胞遷移能力增加，表明具有促進創(chuàng)傷修復作用；皮膚受到損傷后，皮膚內的各種細胞主要通過細胞遷移到達損傷部位來進行修復活動，角質形成細胞的遷移能力對表皮損傷修復具有重要作用；將 2×10⁵個細胞/孔接種于24孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育達到完全融合；用無血清培養(yǎng)基清洗細胞，并用10 μg/ml絲裂霉素在培養(yǎng)箱孵育1 h，后用消毒后的10 μl槍頭在24孔中心的單層細胞表面劃出一條無細胞的傷痕，用基礎培養(yǎng)液漂洗數(shù)次清洗劃痕上的細胞；加入含2%血清的培養(yǎng)液以及用含2%血清培養(yǎng)基配置的樣品溶液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察16 h后遷移到劃痕區(qū)細胞的情況，計算遷移相對平均值，每組設3個復孔，實驗設計見表2；②經(jīng)表皮失水率檢測：目前大多研究機構通過測定經(jīng)表皮失水率來評價皮膚屏障功能，其含義是皮膚在汗腺不活動的狀態(tài)下總的失水量，能夠反應角質層對于水的屏障功能，是評價角質層狀態(tài)的重要因子；TEWL通過評價角質層屏障功能達到預測護膚品通過保濕作用對表皮屏障功能的維護、修復和加強作用，因此本實驗方案用TEWL值表征組合物對于皮膚的修復效果；在測試條件下，得到的TEWL值越高，代表單位時間、單位橫截面積的經(jīng)表皮水分流失量越多，皮膚屏障功能越差；TEWL值越低，代表單位時間、單位橫截面積的經(jīng)表皮水分流失量越少，皮膚屏障功能得到改善，具有修復效果。

依據(jù)志愿者入選標準招募符合條件的志愿者入組，年齡28～55歲，分組試驗。在測試環(huán)境中平衡等待30 min，保持放松。后使用低致敏膠帶對志愿者測試區(qū)域進行粘貼，按壓2 s后緩慢剝離，連續(xù)撕脫至出現(xiàn)肉眼可見的紅斑，然后檢測測試區(qū)域的經(jīng)表皮水分流失率記為基礎值；發(fā)放樣品，根據(jù)樣品使用說明書正確使用產(chǎn)品，測試區(qū)域分為樣品涂抹區(qū)域和對照區(qū)域；并在設定的測量時間點2周和4周測量各測試區(qū)域的經(jīng)表皮水分流失率記為測量值，檢測方法見表3。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 28.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x-±s）表示，若測試數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，則采用配對樣本t檢驗；若測試數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，則采用秩和檢驗；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示統(tǒng)計學意義顯著，P<0.001表示統(tǒng)計學意義極顯著。

2 結果

2.1 組合物的安全性 根據(jù)人體斑貼試驗結果，參加試驗的30名志愿者中，在斑貼試驗進行0.5 h以及24 h后撕掉斑貼的皮膚反應均為陰性反應，組合物1和組合物2均未出現(xiàn)不良反應，安全性良好，不良反應發(fā)生率為0，見表4。

2.2 具有皮膚修復功效組合物的功效驗證結果

2.2.1細胞遷移實驗 陽性對照的相對遷移平均值顯著高于空白對照，說明本次測試陽性對照有效；組合物1和組合物2與空白對照相比，相對遷移平均值顯著升高（P<0.01），且組合物2和陽性對照效果相似，見圖1。

2.2.2經(jīng)表皮失水率測試實驗 組合物1和組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周和4周時顯著低于0周時（P<0.01），且呈極顯著性下降趨勢（P<0.001）；根據(jù)受試者28 d的檢測數(shù)值，組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周、4周時的下降數(shù)值均顯著大于組合物1（P<0.01），見圖2。

3 討論

細胞活性因子是對細胞分泌的能調節(jié)細胞功能的多肽的統(tǒng)稱，有促進肌膚細胞組織的分化、促進受損肌膚組織的結構重建和促進受損肌膚深層細胞組織愈合等修復作用[11]。但是由于原料本身的提取純度、儲存條件和配方應用使得修復功效受到一定的限制，經(jīng)調研發(fā)現(xiàn)，可利用RGD對于生物材料的粘附性和能與多種整合素其中包括參與炎癥修復過程的αV和β3兩種整合素的特異性結合，將細胞活性因子靶向性的帶到需要修復的皮膚組織，提升細胞活性因子的修復功能。

由此通過設計多種實驗檢測手段對HA-RGD對于細胞活性因子修復功效的影響進行研究發(fā)現(xiàn)，組合物1和組合物2均未出現(xiàn)不良反應，說明組合物1和組合物2安全無刺激，安全性良好。細胞遷移實驗顯示，本次測試陽性對照有效，兩組組合物對于細胞的相對遷移平均值均有提升，說明兩組組合物均可提高細胞遷移速度，對細胞有一定的促進修復效果。且比較發(fā)現(xiàn)，組合物2較組合物1有更高的提升數(shù)值，說明組合物2有更加良好的促進細胞修復效果。在經(jīng)表皮失水率測試實驗中，TEWL值降低，說明單位時間單位橫截面積中經(jīng)表皮流失的水分減少，皮膚屏障功能得以修復。通過28 d的驗證周期，人體修復功效驗證數(shù)據(jù)表明，兩組組合物在2周、4周的實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)均能在人體水平上降低經(jīng)表皮失水率，讓敏感肌膚的皮膚屏障更加完整，起到一定的修復功效。且通過比較發(fā)現(xiàn)，組合物2較組合物1能更加明顯地降低經(jīng)表皮失水率，說明組合物2在對敏感肌膚屏障修復方面有更加突出的修復效果。本研究旨在探究HA-RGD對細胞活性因子修復功效的影響，發(fā)現(xiàn)兩組組合物均在細胞水平上可促進細胞遷移能力，從而增強修復功效，能通過降低經(jīng)表皮失水率來增強皮膚的屏障功能。且組合物2因HA-RGD的添加比組合物1有更加明顯的細胞修復效果，得以說明HA-RGD對細胞活性因子的修復效果有一定的提升作用。

綜上所述，HA-RGD對細胞活性因子的修復效果有一定的提升作用，可利用HA-RGD中RGD能與多種整合素其中也包括參與炎癥修復過程的αV和β3兩種整合素的特異性結合，將生物活性材料細胞活性因子黏附在需要修復的細胞上，進而實現(xiàn)智能靶向、精準修復功能，進一步提升細胞活性因子的修復效果。

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編輯 扶田