郭良帥

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），為革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于人和動(dòng)物腸道以及自然環(huán)境中［1］，肺炎克雷伯菌作為僅次于大腸桿菌的人畜共患條件致病菌，可引起人和動(dòng)物傷口感染、肺炎、腦膜炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎［2，3］。關(guān)于肺炎克雷伯菌感染雞［4］、牛［5，6］、犬［7］、水貂［8］、大熊貓［9］等動(dòng)物有較多的報(bào)道，均造成一定經(jīng)濟(jì)損失，因此及時(shí)了解動(dòng)物感染肺炎克雷伯菌的血清型、攜帶毒力基因及耐藥情況，對(duì)治療及預(yù)防肺炎克雷伯菌具有重要意義。

羊養(yǎng)殖業(yè)是和田地區(qū)的主要支柱產(chǎn)業(yè)，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷發(fā)展，由肺炎克雷伯菌引起的羊呼吸道疾病時(shí)有發(fā)生，試驗(yàn)從和田地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)采集25 份具有呼吸道癥狀病死羊胸腔積液及肺臟組織，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，通過(guò)革蘭氏染色、生化試驗(yàn)、16S rRNA 基因擴(kuò)增、溶血酵素（khe）基因檢測(cè)鑒定方法確定肺炎克雷伯菌，采用莢膜血清學(xué)檢測(cè)、毒力基因檢測(cè)、小鼠致病性試驗(yàn)評(píng)估分離株危害，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)了解耐藥情況，以期為和田地區(qū)防控肺炎克雷伯菌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 從和田地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)采集25 份具有呼吸道癥狀病死羊胸腔積液及肺臟組織，將樣本進(jìn)行編號(hào)，置于-20 ℃保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 40 只昆明小白鼠，小鼠體重均在25 g左右。

1.1.3 主要試劑 普通瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱肌酮醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂（MIAC）均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；核酸染料、PCR Mix 均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 藥敏紙片 藥敏紙片批號(hào)為20200919，由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 將25 份病死羊胸腔積液及肺臟組織樣本劃線接種于MIAC 選擇性培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，挑取紫紅色、有沉淀環(huán)的單菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，對(duì)純培養(yǎng)菌株進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 根據(jù)肺炎克雷伯菌的生化反應(yīng)特點(diǎn)，選取氧化酶、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、木糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、檸檬酸鹽、MR、VP、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、硫化氫、吲哚、明膠酶鑒定分離株種類，具體操作步驟及結(jié)果判定依照生化試驗(yàn)鑒定管說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 16S rRNA 基因檢測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建參考文獻(xiàn)［10］中細(xì)菌16S rRNA 引物并合成，上游引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引 物1 492 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×EasyTap PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，去離子水8.5 μL，純化菌液2.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取適量PCR 產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳后，用凝膠成像儀檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物送至公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，利用DNA Star 軟件進(jìn)行同源性比較，確定細(xì)菌種屬。

1.2.4khe基因擴(kuò)增 參照Neuberger 等［11］引物擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的特異性基因溶血酵素（khe）基因，引物序列為F：5′-TGATTGCATTCGCCAC-TGG-3′；R：5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′。擴(kuò)增片段大小為428 bp，PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×EasyTap PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，去離子水8.5 μL，純化菌液2.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取適量PCR產(chǎn)物電泳后，用凝膠成像儀檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物送至公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 莢膜血清型檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［12］合成肺炎克雷伯菌常見(jiàn)莢膜血清型引物，引物序列見(jiàn)表1。對(duì)分離株進(jìn)行血清型分型檢測(cè)，PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×Tap PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板2.0 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，51～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30～60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

表1 血清型引物序列

1.2.6 毒力基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［13-15］合成肺炎克雷伯菌6 類16 種毒力基因的引物序列，引物序列見(jiàn)表2。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）為2×Tap PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板2.0 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，48～57 ℃退火1 min，72 ℃延伸30～60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

表2 毒力基因引物信息

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離株對(duì)臨床常用的22 種藥物耐藥性的敏感性，按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)作為判斷依據(jù)（表3）。

表3 藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.8 小鼠致病性試驗(yàn) 將分離菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37 ℃、180 r/min的搖床振搖12～18 h，以分光分度計(jì)為檢測(cè)工具，將菌液經(jīng)過(guò)生理鹽水稀釋成1×108CFU/mL 作為試驗(yàn)菌液。將40 只小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組5 只，4 組試驗(yàn)組，4 組對(duì)照組；試驗(yàn)組各小鼠腹腔注射0.2 mL 菌液，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水，觀察小鼠的發(fā)病與死亡情況并做好記錄。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖并取病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

將病死羊胸腔積液及肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，初步篩選出4 株疑似肺炎克雷伯菌，分別命名為KLB-1、KLB-2、KLB-3、KLB-4，4 株 分 離 株 均 在MIAC 選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、紫紅色、有沉淀環(huán)的單菌落（圖1A），在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、粉紅色的菌落（圖1B）；革蘭氏染色鏡檢結(jié)果均為兩端鈍圓革蘭氏陰性菌（圖1C）。

圖1 分離菌株在MIAC 培養(yǎng)基（A）、麥康凱培養(yǎng)基（B）的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢（C）（1 000×）

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

經(jīng)生化鑒定管檢測(cè)顯示，阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、木糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、檸檬酸鹽、MR、明膠酶呈陽(yáng)性，氧化酶、VP、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、硫化氫、吲哚呈陰性（表4）。4 株分離菌株的鑒定結(jié)果均符合肺炎克雷伯菌的生化特性。

表4 分離株生化鑒定

2.3 16S rRNA基因檢測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

使用16S rRNA 通用引物對(duì)4 株分離菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果出現(xiàn)4 條1 500 bp 左右的條帶（圖2），符合預(yù)期目的片段大小。測(cè)序結(jié)果顯示，4株分離株與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)肺炎克雷伯菌參考株核苷酸相似性在97.4%～99.8%（圖3），進(jìn)一步明確分離菌株為肺炎克雷伯菌。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，分離菌株KLB-1、KLB-2、KLB-3、KLB-4 與登錄號(hào)為KJ465988.1 的親緣關(guān)系較近（圖4）。

圖2 分離菌株16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖3 基于16S rRNA 基因序列的相似性比對(duì)

圖4 基于16S rRNA 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 khe基因擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)PCR 擴(kuò)增4 株分離菌株特異性khe基因，電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)428 bp 左右清晰且單一的條帶（圖5），與預(yù)期目的片段大小一致，進(jìn)一步確定4 株分離菌株為肺炎克雷伯菌。

圖5 肺炎克雷伯特異性khe基因電泳結(jié)果

2.5 莢膜血清型檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR 檢測(cè)明確4 株分離菌株血清型，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，4 株分離菌株擴(kuò)增條帶均在1 283 bp 左右（圖6），表明4株分離菌株均為K1 型。

圖6 分離菌株莢膜血清型PCR 鑒定電泳結(jié)果

2.6 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)4 株分離菌株進(jìn)行16 種毒力基因檢測(cè)，共檢出12 種毒力基因（圖7）。uge、fimH、mrkD、entB、ybtA、iutA、ureA檢出率為100%，wabG、areo檢出率為75%，kfu、allS檢出率為50%，magA檢出率為25%，rmpA、rmpA2、icuB、iroNB檢出率為0（表5）。

圖7 分離菌株毒力基因電泳結(jié)果

表5 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

22 種藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 株分離菌株均對(duì)頭孢曲松、氯霉素敏感，對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢拉定、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星不同程度敏感，對(duì)多粘菌素中度敏感，對(duì)新霉素、慶大霉素、卡那霉素不同程度耐藥，對(duì)丁胺卡那霉素、紅霉素、克林霉素、麥迪霉素、青霉素、羧芐西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素耐藥。對(duì)藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，KLB-1、KLB-3 對(duì)10 種藥物耐藥，KLB-2、KLB-4 對(duì)12 種藥物耐藥，4 株分離株呈不同程度的多重耐藥性（表6）。

表6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.8 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠注射菌液及生理鹽水6 h 后出現(xiàn)精神不振、扎堆畏寒現(xiàn)象；在12～24 h 內(nèi)不斷出現(xiàn)小鼠死亡情況，24 h 后，4 組小鼠死亡率分別為80%、100%、100%和100%。對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)異常表現(xiàn)及死亡情況。剖解死亡小鼠肝臟均出現(xiàn)不同程度的淤血、腫大、質(zhì)脆，脾臟淤血腫大。無(wú)菌采取肝臟、脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，將單菌落進(jìn)行khe基因PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。表明分離菌株對(duì)小鼠均具有較強(qiáng)的致病性。

3 小結(jié)與討論

隨著規(guī)模化羊養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，羊場(chǎng)呼吸性疾?。?6］、腹瀉性疾?。?7］依然是阻擋羊養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要問(wèn)題，其中不乏由肺炎克雷伯菌引起的呼吸性疾病，江都某養(yǎng)羊場(chǎng)200 頭胡羊因感染肺炎克雷伯菌出現(xiàn)流鼻涕、咳嗽、呼吸急促等癥狀，最終造成30%死亡率［18］。范培超等［19］為了調(diào)查內(nèi)蒙古通遼市某羊場(chǎng)發(fā)病羊死亡的原因，對(duì)疑似致病菌進(jìn)行分離、鑒定及部分生物學(xué)特性研究，最終確定肺炎克雷伯菌是該羊場(chǎng)發(fā)病羊死亡的致病菌。趙潔雅等［20］從綿羊肺炎病例的病料中檢測(cè)到克雷伯菌，最終確定該病情的病原為羊肺炎克雷伯氏菌。本研究對(duì)25 份具有呼吸道癥狀病死羊胸腔積液及肺臟組織中成功分離出4株肺炎克雷伯菌，分別命名為KLB-1、KLB-2、KLB-3、KLB-4。

khe基因是肺炎克雷伯菌體外溶血酵素基因，是鑒定肺炎克雷伯菌的金標(biāo)準(zhǔn)，為保證本研究的準(zhǔn)確性，采用khe基因作為靶基因進(jìn)一步確認(rèn)。

肺炎克雷伯菌莢膜血清型主要有K1、K2、K5、K20、K54 和K57，其中K1、K2 為主要血清型，與細(xì)菌的侵襲性有關(guān)［21］，本研究對(duì)4 株羊源肺炎克雷伯分離菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，結(jié)果顯示4 株分離菌株均為K1 型，與張文舉等［22］、左偉等［12］報(bào)道的優(yōu)勢(shì)血清型有一定差異，造成差異的原因可能是地域不同、感染宿主不同。

為了解4 株分離菌株毒力基因攜帶情況，本研究通過(guò)PCR 檢測(cè)方法對(duì)4 株分離菌株進(jìn)行16 個(gè)毒力基因檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示共檢出12 種毒力基因，uge、fimH、mrkD、entB、ybtA、iutA、ureA檢 出 率 為100%，wabG、areo檢出率為75%，kfu、allS檢出率為50%，magA檢出率為25%，rmpA、rmpA2、icuB、iroNB檢出率為0。分離菌株均呈多重毒力基因型，最多攜帶11 種毒力基因，與王哲紅［6］報(bào)道的結(jié)果相近，肺炎克雷伯菌臨床分離菌株攜帶多種毒力因子，引起相關(guān)感染。

隨著抗生素在臨床及養(yǎng)殖中泛用、濫用，多重耐藥性的肺炎克雷伯菌的檢出率不斷升高。本研究對(duì)4 株分離菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果顯示，4 株分離株均對(duì)多粘菌素中度敏感，對(duì)新霉素、慶大霉素、卡那霉素不同程度耐藥，對(duì)丁胺卡那霉素、紅霉素、克林霉素、麥迪霉素、青霉素、羧芐西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素耐藥。與黃旭俊等［18］、范培超等［19］報(bào)道的分離菌株的耐藥情況相比，本研究所分離出的4 株肺炎克雷伯菌具有更高的耐藥性，可能與不同羊場(chǎng)用藥方案有關(guān)。賈麗等［23］在治療試驗(yàn)中采用了恩諾沙星和麻杏石甘散中西藥結(jié)合應(yīng)用于肺炎克雷伯菌，并取得了良好的治療效果。因此，在選擇治療肺炎克雷伯菌的方案時(shí)，可結(jié)合傳統(tǒng)中獸醫(yī)治療方案，不僅可以達(dá)到良好的治療效果，同時(shí)可利用中草藥不易產(chǎn)生耐藥性減緩肺炎克雷伯菌耐藥性的增長(zhǎng)。