孫盼盼,曹志剛,凌小雅,孫 娜,孫耀貴,李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室,太谷 030801)

細菌與病毒的混合感染在豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)中普遍存在,與單一病原體感染相比,這可能對豬群的健康構(gòu)成更大的威脅,也給疾病的治療帶來挑戰(zhàn)[1-2]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種重要的呼吸道疾病病原體,豬感染PRRSV后以出現(xiàn)免疫抑制為特點,常與其他豬病混合感染或者繼發(fā)感染。已有的研究報道,PRRSV和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共感染仔豬能夠誘導仔豬肺部強烈的炎癥反應,誘導IL-1和TNF-α等炎癥因子的高表達[3]。PRRSV與LPS協(xié)同作用顯著增加豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophage,PAMs)中IL-1β和TNF-α的分泌[4]。副豬嗜血桿菌感染可增強高致病性PRRSV感染介導的炎癥反應,IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的分泌顯著升高[5]。中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室前期在PAMs上通過轉(zhuǎn)染PRRSV 5′UTR RNA或單獨使用LPS刺激,發(fā)現(xiàn)PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激能夠誘導PAMs產(chǎn)生強烈的炎癥反應,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達顯著升高;以PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激PAMs為炎癥模型,證明苦參堿可通過抑制MyD88/NF-κB信號通路以及NLRP3炎癥小體的激活來抑制IL-1β的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎作用[6]。

抗生素具有抗菌、保健和促生長等作用[7-9],但是隨著獸藥殘留、細菌耐藥性和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量不合格等問題的出現(xiàn),減抗、替抗迫在眉睫。目前,國內(nèi)外替代飼用化學品的相關(guān)研究主要集中在中獸藥、植物源性提取物、微生態(tài)制劑和酶制劑等[10-11]。本試驗選擇5種臨床上常用的獸用抗生素:阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星[12],以PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激的PAMs為炎癥模型,IL-1β為檢測指標,從中篩選出與苦參堿具有相似抗炎作用的抗生素,然后通過與苦參堿的聯(lián)合使用,確定與苦參堿具有交互作用的抗生素,以期為苦參堿作為抗生素替代物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

本試驗所用藥物相關(guān)信息見表1。

表1 本試驗涉及藥物相關(guān)信息

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco,胎牛血清(FBS)購自以色列BI(Biological Industries),轉(zhuǎn)染試劑購自德國QIAGEN,TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國TaKaRa,2×SYBR Green Low ROX qPCR Master Mix、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自中國Bimake,RIPA裂解液(強)和增強型蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天,DH-5α感受態(tài)細胞和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自中國TIAIVGEN,線性化純化試劑盒購自美國Omega,MEGAclearTMKit Purification for Large Scale Transcription Reactions購自美國ThermoFisher Scientific,RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7試劑盒購自美國Promega。

主要儀器設(shè)備:倒置顯微鏡(Olympus,日本)、CO2培養(yǎng)箱(Heal force,中國)、核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop,美國)、ABI 7500定量PCR儀(ABI,美國)、離心機(Sigma,德國)、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio rad,美國)、恒溫振蕩培養(yǎng)器(上海智城,中國)。

1.3 細胞毒性試驗

1.3.1 不同抗生素在PAMs上的細胞毒性 原代PAMs由中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室提取凍存[6]。復蘇原代PAMs接種至96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后,分別用DMSO溶解阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星,用細胞維持液(2% FBS)連續(xù)2倍倍比稀釋成10個濃度梯度,加入接種PAMs的96孔細胞培養(yǎng)板上,100 μL·孔-1,每個濃度梯度重復4孔,同時設(shè)細胞對照(只加100 μL細胞維持液),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待培養(yǎng)72 h后,棄上清,每孔加入20 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄MTT,每孔加入150 μL DMSO,37 ℃孵育30 min,待結(jié)晶完全溶解后,490 nm處檢測OD值。以細胞病變程度和所測得OD490 nm值為依據(jù),用下列公式計算細胞的存活率,確定不同抗生素在PAMs上的最大安全濃度(maximum no-cytotoxic concentration,MNTC)。

1.3.2 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素在PAMs上的細胞毒性 以苦參堿、阿莫西林和金霉素在PAMs上最大安全濃度為起始濃度,分別連續(xù)2倍倍比稀釋3個濃度梯度,按表2進行苦參堿與阿莫西林/金霉素的聯(lián)合使用,加入至已接種PAMs的96孔細胞培養(yǎng)板中,100 μL·孔-1,每組4個重復,同時設(shè)細胞對照組,72 h后,MTT法檢測聯(lián)合用藥后藥物對PAMs的細胞毒性。

表2 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素在PAMs上細胞毒性試驗設(shè)計

1.4 PRRSV 5′UTR RNA的制備

PRRSV 5′UTR RNA由中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室制備保存[6]。制備過程如下:PRRSV感染Marc-145細胞24 h后,收集細胞樣品,提取細胞總RNA,以合成的cDNA為模板,普通PCR擴增PRRSV 5′UTR(引物序列見表3)。PCR反應結(jié)束后,3%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因條帶并進行膠回收,送北京華大基因公司測序驗證,比對正確后,將膠回收產(chǎn)物、載體pcDNA3.1(+) DNA分別進行雙酶切,然后連接、轉(zhuǎn)化,導入DH-5α感受態(tài)細胞。提取菌液質(zhì)粒DNA并進行單酶切,酶切產(chǎn)物線性化純化,參照RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7(Promega)試劑盒進行體外RNA轉(zhuǎn)錄,參照MEGAclearTMKit Purification for Large Scale Transcription Reactions(ThermoFisher)說明書將RNA進行轉(zhuǎn)錄后純化。核酸濃度測定儀測定純化后RNA的濃度,分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 引物信息

1.5 不同抗生素對PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達的影響

PAMs以1×106個·mL-1接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)2 h后棄掉未貼壁的細胞,加入新的10%培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進行后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)染4 μg PRRSV 5′UTR RNA的同時加入1 μg·mL-1LPS,共同刺激細胞6 h后,分別加入2 mL最大安全濃度的阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考或替米考星,繼續(xù)作用6 h,收集細胞,參照TaKaRa TRIzol總RNA提取試劑說明書提取細胞總RNA,qPCR檢測IL-1βmRNA的表達。引物序列見表3。

1.6 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素對PAMs炎癥模型IL-1β表達的影響

試驗分組見表4,PAMs以1×106個·mL-1接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)2 h后棄掉未貼壁的細胞,加入新的10%培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h進行后續(xù)試驗。4 μg 5′UTR RNA和1 μg·mL-1LPS共同刺激細胞6 h后,分別加入2 mL不同濃度聯(lián)合的苦參堿和阿莫西林/金霉素,繼續(xù)作用6 h,收集細胞,提取細胞總RNA和蛋白,qPCR檢測IL-1βmRNA的表達,Western blot檢測IL-1β蛋白的表達。

表4 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素試驗表

1.7 Western blot檢測IL-1β蛋白的表達

參照碧云天Western blot及IP細胞裂解液說明書進行裂解液的配制,提取細胞總蛋白。按照碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測各樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入用TBST稀釋后的IL-1β(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體,室溫孵育2 h,TBST洗膜3次后,用1∶20 000比例稀釋特異性二抗,37 ℃孵育1 h,洗膜3次,滴加適量ECL化學發(fā)光液,用X-ray膠片在暗室曝光,膠片晾干后掃描保存,掃描的圖像用Image J軟件進行灰度值分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

藥物交互作用采用Excel進行可重復雙因素方差分析,其他數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5(GraphPad Software, Inc. California, USA)軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)(Bonferroni: Compare all pairs of columns或Dunnett: Compare all columns vs. control columns),所有數(shù)據(jù)均以“Mean ± SEM”表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同抗生素在PAMs上的細胞毒性

將不同濃度梯度的阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星接種到PAMs上培養(yǎng)72 h,通過觀察細胞病變和MTT法測定藥物在所設(shè)濃度梯度內(nèi)的最大安全濃度(MNTC)。結(jié)果見表5,阿莫西林的MNTC為1 mg·mL-1,金霉素的MNTC為0.05 mg·mL-1、鹽酸多西環(huán)素的MNTC為0.004 375 mg·mL-1、氟苯尼考的MNTC為0.425 mg·mL-1、替米考星的MNTC為0.106 25 mg·mL-1。

表5 不同抗生素的最大溶解度和在PAMs上的最大安全濃度

2.2 不同抗生素對PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達的影響

根據(jù)5種抗生素在PAMs上的細胞毒性結(jié)果,在最大安全濃度下檢測不同抗生素對PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激誘導的IL-1βmRNA表達的影響。結(jié)果如圖1A所示,與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考均能顯著抑制IL-1βmRNA的表達(P<0.05),替米考星對IL-1βmRNA的表達沒有顯著影響(P>0.05)。與苦參堿用藥組相比,阿莫西林和金霉素與苦參堿具有相似的抑制效果(P>0.05),因此,選擇阿莫西林和金霉素進行后續(xù)聯(lián)合用藥試驗。

不同濃度的阿莫西林或金霉素作用于PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激的PAMs 6 h后,qPCR檢測結(jié)果顯示,與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,1 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的阿莫西林顯著降低IL-1βmRNA的表達(P<0.05),0.25 mg·mL-1的阿莫西林對IL-1βmRNA的表達沒有顯著影響(P>0.05,圖1B);0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1的金霉素顯著降低IL-1βmRNA的表達(P<0.05),0.012 5 mg·mL-1的金霉素對IL-1βmRNA的表達沒有顯著影響(P>0.05,圖1C)。

2.3 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素在PAMs上的細胞毒性結(jié)果

選擇最大濃度苦參堿與不同濃度的阿莫西林/金霉素聯(lián)合以及最大濃度的阿莫西林/金霉素與不同濃度的苦參堿聯(lián)合,PAMs用藥72 h后,不同濃度的苦參堿和阿莫西林聯(lián)合后,細胞存活率均大于80%(圖2A);不同濃度的苦參堿和金霉素聯(lián)合使用72 h后,僅0.4 mg·mL-1苦參堿+0.012 5 mg·mL-1金霉素組的細胞存活率大于80%,其余各組的細胞存活率均低于80%(圖2B)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示,苦參堿和金霉素聯(lián)合使用6和12 h時,PAMs未出現(xiàn)細胞病變情況,細胞呈圓形,折光性好,聯(lián)合使用24 h后開始出現(xiàn)細胞病變,細胞皺縮、裂解等。

《西行漫記》正是在這一時代背景下完成的，它是一部文筆優(yōu)美的紀實性很強的報道性作品。1936年6月至10月期間，作者埃德加·斯諾在以延安為中心的陜甘寧邊區(qū)進行實地采訪，真實記錄了我國西北革命根據(jù)地的所見所聞。

A. 苦參堿與阿莫西林聯(lián)合在PAMs上的細胞毒性;B. 苦參堿與金霉素聯(lián)合在PAMs上的細胞毒性A. Cytotoxicity of Matrine and Amoxicillin combined on PAMs. B. Cytotoxicity of Matrine and Aureomycin combined on PAMs圖2 苦參堿與阿莫西林/金霉素聯(lián)合在PAMs上的細胞毒性結(jié)果Fig.2 Cytotoxicity of Matrine combined Amoxicillin/Aureomycin on PAMs

2.4 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達的影響

與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,0.1 mg·mL-1苦參堿+0.25 mg·mL-1阿莫西林聯(lián)合處理對IL-1βmRNA的表達沒有顯著影響(P>0.05),其余各加藥組均能顯著降低IL-1βmRNA的表達(P<0.05)。與1 mg·mL-1單獨的阿莫西林加藥組相比,苦參堿和阿莫西林聯(lián)合用藥組中0.4 mg·mL-1+1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1聯(lián)合顯著降低IL-1βmRNA的表達(P<0.05),0.4 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+1 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1聯(lián)合對IL-1βmRNA的表達沒有顯著影響(P>0.05),但是0.1 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1聯(lián)合顯著升高IL-1βmRNA的表達(P<0.05,圖3)。

圖3 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達的影響Fig.3 Effects of Matrine and Amoxicillin combined on the mRNA expression of IL-1β in PAMs inflammatory model

2.5 苦參堿聯(lián)合金霉素對PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達的影響

與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,苦參堿聯(lián)合金霉素組0.4 mg·mL-1+0.025 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+0.012 5 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+0.025 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+0.012 5 mg·mL-1對PAMs炎癥模型IL-1βmRNA的表達沒有顯著影響(P>0.05),其余各聯(lián)合用藥組均能顯著降低IL-1βmRNA的表達(P<0.05)。與0.05 mg·mL-1單獨的金霉素加藥組相比,苦參堿和金霉素聯(lián)合用藥組0.2 mg·mL-1+0.012 5 mg·mL-1顯著升高IL-1βmRNA的表達(P<0.05),其余各聯(lián)合用藥組均無顯著差異(P>0.05,圖4)。

圖4 苦參堿聯(lián)合金霉素對PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達的影響Fig.4 Effects of Matrine and Aureomycin combined on the mRNA expression of IL-1β in PAMs inflammatory model

2.6 苦參堿與阿莫西林/金霉素聯(lián)合交互作用分析

分別將苦參堿與阿莫西林或金霉素聯(lián)合使用后對PAMs炎癥模型中IL-1βmRNA表達的結(jié)果進行可重復雙因素方差分析,結(jié)果顯示苦參堿與阿莫西林之間存在交互作用(P=2.89×10-8,表6),苦參堿與金霉素之間不存在交互作用(P=0.121 013,表7)。

表6 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對IL-1β mRNA表達影響的方差分析結(jié)果

表7 苦參堿聯(lián)合金霉素對IL-1β mRNA表達影響的方差分析結(jié)果

2.7 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對PAMs炎癥模型IL-1β蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖5),與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,0.1 mg·mL-1苦參堿+0.25 mg·mL-1阿莫西林聯(lián)合處理對IL-1β蛋白的表達沒有顯著影響(P>0.05),其余加藥處理組均能顯著降低IL-1β蛋白的表達(P<0.05)。與1 mg·mL-1單獨的阿莫西林加藥組相比,苦參堿和阿莫西林聯(lián)合用藥組中0.4 mg·mL-1+1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1+1 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1聯(lián)合顯著降低IL-1β蛋白的表達(P< 0.05),0.1 mg·mL-1+1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1聯(lián)合對IL-1β蛋白的表達沒有顯著影響(P>0.05),表明在降低阿莫西林用量的時候加入苦參堿,能夠達到相同或更顯著的抗炎效果,苦參堿能夠替代部分阿莫西林的藥效,降低阿莫西林的使用量。

圖5 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對PAMs炎癥模型IL-1β蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Matrine and Amoxicillin combined on the protein expression of IL-1β in PAMs inflammatory model

3 討 論

面對飼用化學品添加對動物源性食品質(zhì)量和公共衛(wèi)生安全造成的嚴重威脅,許多國家在養(yǎng)殖生產(chǎn)中禁止或限制添加抗生素等化學品。2019年以來,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相繼發(fā)布多個公告限制或禁止抗生素的使用,2020年7月1日起,飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料,2021年10月,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021—2025年)》。2021年11月,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于推介發(fā)布2021年農(nóng)業(yè)主推技術(shù)的通知中,遴選了114項農(nóng)業(yè)主推技術(shù),畜禽抗生素減量替代技術(shù)位列其中。近幾年,中獸藥及其提取物在防治動物疾病、提高機體免疫功能、緩解炎癥反應等的臨床應用中顯示了良好的效果。本課題組長期從事中藥提取物抗病毒、抗炎作用及機制的研究,證明苦參堿具有抗PRRSV和豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)作用[13],對PRRSV/PCV2共感染昆明小鼠誘導的間質(zhì)性肺炎有顯著的治療作用[14],還可以抑制PRRSV和LPS共刺激誘導的炎癥反應[5]。

氟苯尼考、強力霉素(鹽酸多西環(huán)素)和替米考星在臨床上常用于防治家禽呼吸道疾病,強力霉素能夠抑制PRRSV的復制,2015年的統(tǒng)計報道顯示阿莫西林和氟苯尼考作為廣譜抗菌藥,使用量居全國前兩位[12]。本試驗通過選擇臨床上常用的五種抗生素阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星,以IL-1βmRNA為檢測指標,篩選與苦參堿具有相似抑制效果的抗生素,結(jié)果顯示阿莫西林和金霉素對IL-1βmRNA抑制效果與苦參堿相似。通過與苦參堿的聯(lián)合使用,qPCR結(jié)果顯示苦參堿與金霉素聯(lián)合使用后沒有交互作用,苦參堿和阿莫西林之間存在交互作用?？鄥A與阿莫西林聯(lián)合使用后苦參堿能夠替代部分阿莫西林的用量達到相同或更顯著的效果,一定程度上降低了阿莫西林的用量。本研究為苦參堿的臨床試驗提供數(shù)據(jù)支撐,為苦參堿作為抗生素的替代物,降低抗生素使用提供依據(jù),為合理解決抗生素耐藥性等問題提供有效策略。

4 結(jié) 論

在抗PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激誘導的IL-1β表達中,苦參堿能替代部分阿莫西林的藥效,減少阿莫西林的使用量,為苦參堿作為阿莫西林的替代物以及臨床應用提供數(shù)據(jù)支撐。