任曉麗,范玉營,皇甫和平,王 軍,靳雙星,劉 云,石冬梅*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院,鄭州 450046;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150030)

犬乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床上最常見的惡性腫瘤之一,主要發(fā)生在未進(jìn)行卵巢子宮未切除的雌性犬,8歲以上的犬多發(fā),每10萬例犬中約有476例為惡性乳腺腫瘤,發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升的趨勢,轉(zhuǎn)移是造成患犬死亡的主要原因[1-2]。目前,臨床上犬乳腺腫瘤的治療主要采用手術(shù)切除、激素治療、化學(xué)療法和放射治療相結(jié)合的方式,但由于治療選擇方式有限、腫瘤病理學(xué)類型復(fù)雜性、多重耐藥和易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),影響治療效果[3]。因此,篩選犬乳腺腫瘤的分子靶標(biāo)用于早期診斷、治療或癌癥進(jìn)展監(jiān)測具有重要的臨床意義。

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控因子,參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段,如腫瘤增殖、分化、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥性等,正在成為各種類型癌癥的預(yù)測、診斷、預(yù)后和治療靶點(diǎn)的潛在的非侵入性細(xì)胞和分子生物標(biāo)志物[4-6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-502(cfa-miR-502或miR-502)在犬乳腺腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),與犬乳腺腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),發(fā)揮促癌作用[7]。其他研究顯示,Osaki等[8]對SNP(犬乳腺癌細(xì)胞系)和犬的正常乳腺組織miRNA assay結(jié)果顯示有291種不同的差異表達(dá)的miRNAs,發(fā)現(xiàn)miR-502在SNP細(xì)胞中高表達(dá),表達(dá)差異5.994 5倍。但miR-502對犬乳腺腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。RBMS1最初被認(rèn)為是一種c-Myc基因單鏈結(jié)合蛋白,參與調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程[9],也可以通過調(diào)節(jié)靶向mRNA的穩(wěn)定性和翻譯來調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展[10-11]。在腫瘤組織中,不同miRNA通過不同的靶基因而發(fā)揮作用,因此,探討miR-502與犬乳腺腫瘤的關(guān)系,及與抑癌基因RBMS1之間是否存在調(diào)控關(guān)系,對研究犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及作為治療靶點(diǎn)的潛力提供理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要研究miR-502和RBMS1在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),及miR-502是否通過靶調(diào)控RBMS1基因影響犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及EMT中的作用,旨在為犬乳腺腫瘤診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與培養(yǎng)基 犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp和CHMm細(xì)胞,分別從12歲的患惡性乳腺腺癌的雌性雜種犬的原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶中(胸腔積液)分離培養(yǎng)出來,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室饋贈;犬乳腺正常乳腺組織,來源于乳腺腫瘤切除手術(shù)中的腫瘤旁正常乳腺組織(經(jīng)病理組織學(xué)確認(rèn)為正常乳腺組織結(jié)構(gòu)),手術(shù)遵守東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會(SRM-11)制定標(biāo)準(zhǔn),并取得犬主人簽名的知情同意書。DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司;Matrigel購自Corning公司、Opti-MEM、胎牛血清、青鏈霉素和胰蛋白酶購自Gibco公司。

1.1.2 試劑 二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol購自美國Invitrogen公司;RIPA裂解液、增強(qiáng)型BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢試劑盒(SYBR Green)、U6(RNU6B)引物購自北京天根生化科技有限公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;miR-502模擬劑(mimic)和陰性對照(negative control,NC)、miR-502抑制劑(inhibitor)和陰性對照(negative control,NC)購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司;熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega公司;增強(qiáng)型ECL發(fā)光液購自上海天能生物有限公司;上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞遷移標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、增殖標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體購自北京博奧森生物有限公司;間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自沈陽萬類生物有限公司;所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 犬乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞系CHMm和犬乳腺原發(fā)腫瘤細(xì)胞系CHMp細(xì)胞分別用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,置于37 ℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度在80%左右時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代,每2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn),使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,按照試劑盒說明書要求將mimic NC、miR-502 mimic、miR-502 inhibitor、inhibitor NC轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

1.2.2 RNA的提取及qRT-PCR檢測 利用TRIzol法提取各試驗(yàn)細(xì)胞和組織中總RNA,Nanodrop分光光度計(jì)測定總RNA的純度、濃度和完整性,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA);此外,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為miRNAs的cDNA第一鏈,以snRNAU6作為內(nèi)參,miR-502引物設(shè)計(jì)由北京天根生物有限公司完成,參考miRNAs熒光定量試劑盒說明書利用qRT-PCR檢測miR-502的表達(dá)。miR-502、E-cadherin、vimentin和GAPDH等引物序列詳見表1。使用ABI熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),計(jì)算各基因的相對表達(dá)量,其中U6和GAPDH作為內(nèi)參對照,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-502和相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8試驗(yàn) 取對數(shù)生長期的CHMm細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)12 h后,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic/inhibitor及其對照組(NC),分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h進(jìn)行CCK-8檢測,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的每孔的吸光度值(OD)。

1.2.4 細(xì)胞遷移試驗(yàn) 取經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-502后的各試驗(yàn)組細(xì)胞,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞,計(jì)數(shù)使細(xì)胞密度為4×105·mL-1,分別取100 μL細(xì)胞懸液加入24孔內(nèi)的Transwell小室上室內(nèi),下室加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)12 h,用鑷子小心取出Transwell小室,用無鈣的PBS液清洗3次,甲醇固定30 min,用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦去上層未遷移細(xì)胞,PBS洗3次,在倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 24孔內(nèi)的Transwell小室上室內(nèi)加入50 μL基質(zhì)膠培養(yǎng)基混合物,37 ℃孵育1 h使其凝固,其他同“1.2.4”。

1.2.6 Western blot檢測 收取處理48 h后的miR-502轉(zhuǎn)染組及其對照組的細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次。RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA法測定其上清液中的蛋白質(zhì)濃度,進(jìn)行SDS-PAGE電泳80 V 30 min,120 V 60 min,然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,在含5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,蛋白條帶分別用一抗(anti-rabbit-E-cadherin,1∶750;anti-rabbit-vimentin,1∶500;anti-rabbit-MMP2,1∶750;anti-rabbit-PCNA;1∶500;anti-rabbit-GAPDH,1∶1 000)進(jìn)行4 ℃孵育過夜,PBS液漂洗3次,山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗HRP(1∶2 000)室溫孵育2 h,TPST液漂洗3次后,加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,曝光,以GAPDH作為內(nèi)參,應(yīng)用凝膠成像軟件掃描,通過Image J軟件分析蛋白條帶的灰度帶。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)miR-502與RBMS1的靶向關(guān)系 通過TargetScan 8.0軟件等預(yù)測miR-502與RBMS1之間存在互補(bǔ)的核苷酸序列。將含有miR-502結(jié)合位點(diǎn)RBMS1 3′-UTR序列克隆至熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中,構(gòu)建RBMS1野生型(RBMS1 3′-UTR WT)和突變型(RBMS1 3′-UTR MUT)載體,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書將miR-502 mimic/NC、pMIR-REPORT-3′UTR或pMIR-REPORT-con質(zhì)粒以及Renilla luciferase pRL-TK內(nèi)對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至CHMm細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,按照熒光酶試劑盒說明書步驟檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-502和RBMS1在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平

qRT-PCR檢測犬乳腺腫瘤細(xì)胞中miR-502和RBMS1轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果如圖1所示,與正常乳腺組織相比,CHMm細(xì)胞中miR-502的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),差異極顯著(P<0.01),miR-502在CHMp中轉(zhuǎn)錄上調(diào),差異顯著(P<0.05);而RBMS1在 CHMm細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),差異極顯著(P<0.01),CHMp細(xì)胞中RBMS1的轉(zhuǎn)錄下調(diào),差異顯著(P<0.05)。

與對照組比較,*. P<0. 05,**. P<0. 01,下圖同Compared with control group, *. P<0. 05,**. P<0. 01, the same as below圖1 miR-502和RBMS1在犬乳腺腫瘤細(xì)胞和正常乳腺組織中的轉(zhuǎn)錄Fig.1 Relative transcription of miR-502 and RBMS1 in canine mammary tumor cells and normal mammary gland tissues

2.2 miR-502轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的驗(yàn)證

構(gòu)建miR-502 mimic/inhibitor的犬乳腺腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型,利用qRT-PCR檢測miR-502 mimic和miR-502 inhibitor的轉(zhuǎn)染效果,與對照組(miR-NC)相比,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic 48 h后,CHMm和CHMp細(xì)胞中miR-502的轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)(P<0.01);反之,轉(zhuǎn)染miR-502 inhibitor 48 h后,CHMm和CHMp細(xì)胞中miR-502的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(圖2)。

A. CHMp細(xì)胞; B. CHMm細(xì)胞A. CHMp cells; B. CHMm cells圖2 犬乳腺腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-502后的轉(zhuǎn)錄檢測Fig.2 Measurement of miR-502 transcription in canine mammary tumor cells after transfection of miR-502 mimic/inhibitor

2.3 轉(zhuǎn)染miR-502后對犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

轉(zhuǎn)移是影響患犬預(yù)后不良的主要因素,基于前面的試驗(yàn)結(jié)果,miR-502在CHMm的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CHMp,選擇CHMm細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。為明確轉(zhuǎn)染miR-502后是否影響CHMm細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,采用CCK-8和Transwell試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染miR-502對CHMm細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后,與對照組(mimic NC)相比,CHMm細(xì)胞的活力顯著升高(P<0.01);反之,轉(zhuǎn)染miR-502 inhibitor后,與對照組(inhibitor NC)相比,CHMm細(xì)胞的活力顯著降低(P<0.01),如圖3A;Transwell結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后,與對照組(mimic NC)相比,CHMm細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著升高;轉(zhuǎn)染miR-502 inhibitor后,CHMm細(xì)胞的遷移和侵襲能力較對照組顯著降低(圖3B);結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-502后可以調(diào)控犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

A.轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后促進(jìn)CHMm細(xì)胞增殖,轉(zhuǎn)染miR-502 inhibior抑制細(xì)胞增殖; B. 轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后促進(jìn)CHMm細(xì)胞遷移和侵襲,轉(zhuǎn)染miR-502 inhibior抑制細(xì)胞遷移和侵襲(200×)A. Transfection of miR-502 mimic promoted the proliferation of CHMm cells, whereas miR-502 inhibitor suppressed the proliferation of CHMm cells; B. The migration and invasion of CHMm cells were increased by transfection of miR-502 mimic, but suppressed by the transfection of miR-502 inhibitor (200×)圖3 轉(zhuǎn)染miR-502后對犬乳腺腫瘤CHMm細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effects of miR-502 transfection on the proliferation, migration and invasion of canine mammary tumor CHMm cells

2.4 轉(zhuǎn)染miR-502后對犬乳腺腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)基因的影響

腫瘤細(xì)胞遷移能力與細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。為明確miR-502抑制CHMm細(xì)胞遷移的作用是否與調(diào)控EMT有關(guān),利用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-502后犬乳腺腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果顯示(圖4),與mimic NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后顯著下調(diào)CHMm中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01),上調(diào)CHMm中間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、MMP2、PCNAmRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01),差異極顯著。反之,與inhibitor NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-502 inhibitor后顯著上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01),顯著下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、MMP2、PCNAmRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01),下調(diào)PCNAmRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。

A. E-鈣黏蛋白; B. 波形蛋白; C. 基質(zhì)金屬蛋白酶2; D. 增殖細(xì)胞核抗原 A. E-cadherin; B. Vimentin; C. MMP2; D. PCNA圖4 轉(zhuǎn)染miR-502對犬乳腺腫瘤CHMm細(xì)胞EMT相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Effects of miR-502 on transcription of EMT-related mRNA in canine mammary tumor CHMm cells

2.5 轉(zhuǎn)染miR-502后對犬乳腺腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響

Western blot方法檢測E-cadherin、vimentin、MMP2、PCNA蛋白表達(dá)含量的結(jié)果如圖5所示,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后CHMm細(xì)胞中E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量顯著低于mimic NC組(P<0.01),而vimentin和MMP2蛋白的相對表達(dá)量顯著高于mimic NC組(P<0.01),PCNA 蛋白的相對表達(dá)量高于mimic NC組(P<0.05);反之,與inhibitor NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-502 inhibitor后顯著升高CHMm中E-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量(P<0.01),顯著降低vimentin和MMP2蛋白的相對表達(dá)量(P<0.01),降低PCNA蛋白的相對表達(dá)量(P<0.05)。上述結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染miR-502后調(diào)控犬乳腺腫瘤CHMm細(xì)胞的EMT。

2.6 miR-502靶向負(fù)調(diào)控RBMS1表達(dá)

miRNA主要通過調(diào)節(jié)生物靶標(biāo)發(fā)揮調(diào)控作用,利用生物信息學(xué)軟件如miRDB、miRbase和Targetscan 8.0在線數(shù)據(jù)庫初步預(yù)測分析RBMS1 3′-UTR可能為miR-502的候選靶標(biāo),miR-502和RBMS1 mRNA之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖6A、6B和6D);qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-NC組比較,miR-502 mimic組細(xì)胞中的RBMS1 mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,反之,miR-502 inhibitor組的RBMS1 mRNA相對轉(zhuǎn)錄被明顯的上調(diào)(P<0.01)(圖6C);進(jìn)一步通過雙熒光酶試驗(yàn)報(bào)告基因結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-502與RBMS1 3′-UTR WT載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),而與miR-502與RBMS1 3′-UTR MUT載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著改變(圖6E),結(jié)果表明,miR-502可以直接靶向結(jié)合RBMS1 的3′-UTR,調(diào)控RBMS1的表達(dá)。

A、B、D. 利用miRDB、miRbase和Targetscan 8.0在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析RBMS1 3′-UTR和miR-502的序列; C. qRT-PCR檢測miR-502 mimic、miR-502 inhibitor對RBMS1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響; E. 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證miR-502與RBMS1的靶向關(guān)系A(chǔ), B, D Using miRDB, miRbase, and Targetscan 8.0 online databases to predict and analyze the sequences of RBMS1 3′-UTR and miR-502; C. qRT-PCR was used to detect the effects of miR-502 mimic and miR-502 inhibitor on the transcription of RBMS1 mRNA; E. Verification of the targeting relationship between miR-502 and RBMS1 using dual luciferase reporter assay圖6 miR-502與RBMS1的靶向關(guān)系Fig.6 Targeting relationship between miR-502 and RBMS1

3 討 論

乳腺腫瘤由于其發(fā)病率高、治療方法有限及預(yù)后不良,已經(jīng)成為全世界主要的公共衛(wèi)生問題[12]。犬與人類共享生活環(huán)境,犬與人乳腺腫瘤在發(fā)生、臨床表現(xiàn)、診斷與治療反應(yīng)等方面具有相似之處,可作為研究乳腺腫瘤的模型[13-14]。迄今為止,乳腺腫瘤的診斷與治療仍存在局限性,迫切需要進(jìn)一步了解乳腺腫瘤發(fā)病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)一些新穎的診斷標(biāo)志物。

miRNA是一類調(diào)控基因表達(dá)的非編碼單鏈小RNA,長度約含22個(gè)堿基的核苷酸,并可控制多種腫瘤細(xì)胞的功能,一些異常表達(dá)的miRNA影響人和犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能,可作為腫瘤性疾病診斷、預(yù)后和治療靶點(diǎn)的潛在生物標(biāo)志物[5,15]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA的差異表達(dá)與犬乳腺腫瘤的進(jìn)展有關(guān),如miR-124在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低,miR-124通過靶向CDH2 3′-UTR區(qū)抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)IRAK2被證明是miR-497的一個(gè)功能靶點(diǎn),miR-497在犬乳腺癌細(xì)胞低表達(dá),過表達(dá)miR-497能通過IRAK2/NF-κB軸抑制犬乳腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-502位于染色體Xp11.23,是miRNA-500家族的成員,在許多不同的惡性腫瘤組織發(fā)揮作用,如人食管鱗狀細(xì)胞癌、骨肉瘤、乳腺癌、膀胱癌等[18-21]。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)miR-502在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織,且miR-502通過靶向組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(SET domain containin lysine methyltransferase,SET8)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。Xu等[18]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,miR-502在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào),這種上調(diào)通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)TE1細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡。與此研究結(jié)果相似,在本試驗(yàn)中,與正常乳腺組織相比,犬乳腺腫瘤原發(fā)CHMp和轉(zhuǎn)移CHMm細(xì)胞中miR-502表達(dá)上調(diào),其中CHMm中miR-502表達(dá)最高,因此選定CHMm細(xì)胞進(jìn)行下一步的生物功能學(xué)試驗(yàn),通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染在CHMm細(xì)胞中干擾miR-502的表達(dá),過表達(dá)miR-502后,增強(qiáng)CHMm細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,反之,抑制miR-502后,細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力被抑制。相比miR NC組,miR-502 mimic可從基因和蛋白水平下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá),上調(diào)CHMm細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA、細(xì)胞遷移標(biāo)志物MMP2和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的表達(dá),轉(zhuǎn)染miR-502 inhibitor相反。上述結(jié)果表明miR-502通過調(diào)控犬乳腺腫瘤CHMm細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT,提示miR-502可為犬乳腺腫瘤的診斷、治療提供潛在的靶點(diǎn)。

miRNA主要通過與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)結(jié)合,抑制翻譯或增加mRNA降解來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá),為進(jìn)一步研究miR-502在犬乳腺腫瘤中發(fā)揮作用的下游靶基因,通過在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn),RBMS1是miR-502的潛在靶基因,具有特異性結(jié)合位點(diǎn)。先前的一些研究表明,RBMS1在各種惡性腫瘤類型中低表達(dá),如前列腺癌組織和細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平低于正常的前列腺細(xì)胞和組織,過表達(dá)RBMS1抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及遷移,人前列腺癌中過表達(dá)miR-106b顯著降低RBMS1蛋白的表達(dá),RBMS1作為miR-106b的潛在靶標(biāo)[11];RBMS1在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的病人來源的異種移植小鼠模型中表達(dá)顯著降低,敲低RBMS1促進(jìn)轉(zhuǎn)移能力增加,而恢復(fù)其表達(dá)會減弱轉(zhuǎn)移性肝定植[22]。小鼠卵巢顆粒細(xì)胞(ovarian granulosa cell,OGC)和卵母細(xì)胞中miR-383可通過影響RBMS1 mRNA的穩(wěn)定性抑制RBMS1作用,進(jìn)而抑制c-Myc對GC雌二醇的釋放作用[23]。本研究證實(shí)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm和CHMp中RBMS1的表達(dá)顯著低于正常犬乳腺組織,轉(zhuǎn)染 miR-502 mimic后可明顯下調(diào)CHMm中RBMS1 mRNA的表達(dá),反之,抑制miR-502可使RBMS1表達(dá)上調(diào),此外,進(jìn)一步證實(shí)miR-502可以通過RBMS1發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,通過雙熒光素報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證了miR-502通過結(jié)合到RBMS1 mRNA 3′-UTR,轉(zhuǎn)染miR-502 mimic后顯著降低CHMm中野生型RBMS1熒光載體的熒光素酶活性,而對突變型RBMS1熒光載體的熒光素酶活性沒有明顯的變化,結(jié)果表明,miR-502可以靶向負(fù)調(diào)控RBMS1的表達(dá),但miR-502通過調(diào)控RBMS1的表達(dá)影響犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

miR-502在犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm和CHMp中表達(dá)上調(diào),發(fā)揮癌基因的作用,促進(jìn)CHMm細(xì)胞增殖、遷移及EMT,且miR-502靶向調(diào)控RBMS1基因的表達(dá)。