常偉辰,李帥奇,李 琰,閆 微,張紅英,王彥彬,楊明凡,張昂克

(河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,鄭州 450046)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是引起初生仔豬腹瀉的主要病毒性疾病之一,可感染所有年齡的豬, 7～10 d的仔豬死亡率高達80%～100%[1],PEDV毒株的變異以及多種腹瀉病毒的交叉感染導致現(xiàn)有疫苗對PEDV感染的保護有限[2]。中藥的應用效果和安全性已得到廣泛驗證,成為畜牧業(yè)疾病防治的研究熱點。白頭翁散臨床上常用于治療腹瀉,含有多種活性成分(如白頭翁皂苷、小檗堿、鹽酸巴馬汀等),具有抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用,主要作用于胃腸道[3];對潰瘍性結腸炎有良好的治療效果[4],還可通過調(diào)節(jié)小鼠TLR4/Myd88信號通路治療流感病毒FM1誘導的肺炎[5]。益生菌發(fā)酵可裂解植物細胞壁并轉(zhuǎn)化其代謝產(chǎn)物,提高中藥的功效和適口性,調(diào)節(jié)腸道菌群,增強腸道功能,從而達到防控疾病及健康養(yǎng)殖的目的[6]。如中藥及其乳桿菌發(fā)酵物可改善頭孢曲松鈉引起的小鼠異常腹瀉[7];枯草芽胞桿菌發(fā)酵中藥可調(diào)節(jié)肉雞腸道菌群組成,顯著提高前腸中雙歧桿菌的相對豐度[8]。此外,益生菌定植于宿主腸道,發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和增強免疫功能的作用[9]。因此,擬建立PEDV感染模型,探究白頭翁散能否減輕感染PEDV仔豬的腸道損傷。尚未發(fā)現(xiàn)有文獻報道白頭翁散在減輕感染PEDV仔豬腸道損傷和調(diào)節(jié)腸道菌群方面的作用,本研究將為預防或治療PEDV感染提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

干酪乳酸桿菌R、豬流行性腹瀉病毒(PEDV,HN2021)均由河南農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室提供;黃連、黃柏、白頭翁和秦皮購自北京同仁堂股份有限公司。

煎劑根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定配伍,將黃柏(45 g)、黃連(30 g)、白頭翁(60 g)、秦皮(60 g)等原藥材在常溫下用蒸餾水浸泡1.5 h,再用2 000 mL蒸餾水煎煮2次,每次1 h,最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 g·mL-1,保存于4 ℃。將干酪乳酸桿菌R在無菌液體MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h,菌液(4%)添加到白頭翁散煎劑中(100 mL),用食品級Na2CO3調(diào)節(jié)pH至6.5,37 ℃培養(yǎng)24 h,菌落達到109CFU·mL-1[7]。

1.2 試驗設計

試驗方案遵循河南農(nóng)業(yè)大學動物護理和使用專業(yè)委員會批準[許可證編號SCXK(河南)2013-0001]。從PEDV陰性農(nóng)場購買24頭7日齡體重相近(杜×長×大)雜交仔豬,采用隔離室飼養(yǎng),每個隔離室有單獨的通風和排水系統(tǒng),防止交叉污染。將仔豬隨機分為4組:對照組,PEDV組,煎劑組,發(fā)酵組,每組3個重復。試驗期為12 d,經(jīng)過3 d適應期,第4天對照組接種生理鹽水,其他3組中每頭仔豬以104.5TCID50劑量接種PEDV(HN2021);第5～9天,煎劑組和發(fā)酵組每天灌服煎劑和發(fā)酵液(0.2 mL·kg-1);經(jīng)過3 d觀察期,第12天,前腔靜脈采集血液,然后處死全部仔豬,收集腸道樣本并用4%多聚甲醛固定或液氮速凍,-80 ℃保存待用。

1.3 生長性能與腹瀉指數(shù)指標

試驗期間每天記錄仔豬體重、腹瀉和采食量,收集新鮮糞便進行活菌培養(yǎng)。糞便評分如Zhang等[10]描述,分為4個等級:0=正常,1=糊狀,2=半液體,3=液體。分數(shù)≥2為腹瀉。計算公式:平均日增重(ADG)=總增重/試驗時間。

料肉比(F/G)=每頭仔豬總采食量/每頭仔豬總增重。

1.4 腸道細菌組成指標

新鮮糞便均質(zhì)后在生理鹽水中梯度稀釋,將稀釋度為10-1～10-7的樣品涂布在不同的選擇性瓊脂培養(yǎng)基上。采用平板計數(shù)法對大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌進行平板計數(shù)。

1.5 腸道中病毒拷貝量指標

將0.5～1.0 cm的腸道樣本切成碎片, 加入1 mL TRIzol進行RNA提取,用NanoDrop ND-2000分光光度計檢測RNA質(zhì)量,隨后使用Prime-ScriptTM試劑盒合成cDNA。引物序列如表1所示。qRT-PCR使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒建立,并在應用生物系統(tǒng)7500快速RT-PCR上進行分析,反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,39個循環(huán)。用GAPDH作為內(nèi)部對照,采用2-ΔΔCt法檢測目的基因的表達水平。

表1 引物序列

1.6 腸道形態(tài)和屏障功能指標

將腸道樣本的固定組織沿橫切面切成約1 cm的管狀,4%多聚甲醛固定,經(jīng)過脫水,透明并包埋在石蠟中,切片至4 μm厚,蘇木精-伊紅染色后晾干制片,測量絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)、絨毛高度/隱窩深度的比值(VH/CD)。

將采集的血液樣本在4 ℃下、3 000 r·min-1離心10 min,獲得血清。按照試劑盒說明書中提供的步驟和方法檢測血清中D-木糖含量,腸型脂肪酸結合蛋白(I-FABP)和二胺氧化物(DAO)的活性。

1.7 血清和腸道抗氧化酶指標

稱取0.15 g腸道組織,剪碎混勻制備10%的組織勻漿,3 000 r·min-1離心10 min,取上清,用于檢測抗氧化指標。根據(jù)試劑盒的說明書檢測血清和腸道中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 對生長性能和PEDV復制的影響

由圖1可知,PEDV感染前,4組間仔豬平均日增重(ADG)和料肉比(F/G)無明顯差異,無腹瀉現(xiàn)象;PEDV感染后仔豬ADG顯著降低,F/G顯著升高(P<0.05);灌藥可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象,患病仔豬ADG顯著升高(P<0.05)。感染PEDV仔豬糞便評分顯著升高,與PEDV組相比,灌藥后糞便評分顯著降低(P<0.05)。結果表明灌藥后可改善患病仔豬的生長性能,降低腹瀉率。

A. 平均日增重(ADG);B. 料肉比(F/G);C. 糞便評分;D. PEDV復制。差異顯著性以小寫字母表示,標有相同字母為差異不顯著(P>0.05),標記字母不同為差異顯著(P<0.05),下同A. Average daily gain (ADG); B. Feed to meat ratio (F/G); C. Fecal score; D. PEDV replication. The significance of the difference is indicated by lowercase letters, the same letter means the difference is not significant (P>0.05), and the different letter means the difference is significant (P<0.05), the same as below圖1 灌藥對平均日增重、料肉比、糞便評分和PEDV復制的影響Fig.1 Effect of administration on Average daily gain,feed to meat ratio, fecal score and PEDV replication

為了檢測灌藥對腸道中病毒復制的影響,檢測了PEDVM基因在十二指腸,空腸和回腸中的表達量。結果表明,PEDV感染后M基因在十二指腸、空腸和回腸中均高表達,對照組未檢測到M基因表達。與PEDV組相比,煎劑組和發(fā)酵組M基因表達量顯著降低(P<0.05)。表明灌藥后可顯著抑制PEDV在腸道中的復制。

2.2 對腸道細菌組成的影響

由圖2可知,與對照組相比,PEDV組第5、7、10天大腸桿菌和沙門菌數(shù)量顯著增加,乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著減少(P<0.05),表明感染PEDV仔豬腸道菌群組成遭到破壞,灌藥后腸道菌群組成顯著改善,乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)。發(fā)酵組第10天乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加,與對照組相比也有顯著升高的趨勢(P<0.05)。

表明灌藥后可改善患病仔豬腸道細菌組成,有助于乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖。

A.大腸桿菌的活菌計數(shù);B. 灌藥對沙門菌數(shù)量的影響;C. 灌藥對乳酸桿菌數(shù)量的影響;D. 灌藥對雙歧桿菌數(shù)量的影響A. Live bacteria counts of Escherichia coli; B. Live bacteria counts of Salmonella; C. Live bacteria counts of Lactobacillus; D. Live bacteria counts of Bifidobacterium 圖2 灌藥對試驗第5、7和10天大腸桿菌、沙門菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的影響Fig.2 Effect of administration on the number of Escherichia coli,Salmonella, Lactobacillus and Bifidobacterium on days 5, 7 and 10 of test

2.3 對腸道形態(tài)和屏障功能的影響

由圖3可知,對照組腸道絨毛結構正常,無明顯組織學病變。PEDV感染后組織學病變主要出現(xiàn)在十二指腸、空腸和回腸,表現(xiàn)為腸絨毛萎縮、溶解,腸腺損傷,上皮細胞部分脫落,灌藥后可大量減少組織病變。PEDV組十二指腸、空腸和回腸VH降低,CD增加,灌藥后各腸道組織中VH顯著升高,CD顯著降低,VH/CD顯著升高(P<0.05)(圖4)。表明灌藥后可改善患病仔豬的腸道形態(tài)。

紅箭頭.絨毛溶解,萎縮,損傷,上皮細胞排列不規(guī)則Red arrow. Villus dissolution, atrophy,damage, and epithelial cells arranged irregularly圖3 灌藥對十二指腸,空腸和回腸組織病理學結構的影響(蘇木精-伊紅染色,100×)Fig.3 Effect of administration on the histopathological structure of duodenum, jejunum and ileum (hematoxylin and eosin staining, 100×)

A. 絨毛高度(VH);B. 隱窩深度(CD);C. 絨毛高度/隱窩深度(VH/CD);D. D-木糖、二胺氧化物和腸型脂肪酸結合蛋白水平A. Villus height (VH); B. Crypt depth (CD); C. Villus height/crypt depth (VH/CD); D. D-xylose, diamine oxide (DAO) and intestinal fatty acid binding protein (I-FABP) level圖4 灌藥對絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度以及D-木糖、二胺氧化物(DAO)和腸型脂肪酸結合蛋白(I-FABP)水平的影響Fig.4 Effect of administration on villus height,crypt depth, villus height /crypt depth, D-xylose, diamine oxide and intestinal fatty acid binding protein level

由圖4可知,PEDV感染后血清中D-木糖含量顯著降低(P<0.05),I-FABP和DAO濃度均顯著提高(P<0.05)。相比之下,灌藥后可顯著提高D-木糖含量,降低血漿中I-FABP的濃度(P<0.05),表明灌藥后可增強腸道屏障功能。

2.4 對血清和腸道抗氧化酶的影響

由圖5可知,PEDV組血清中GSH-Px活性以及血清和十二指腸T-SOD活性均顯著降低(P<0.05),十二指腸,空腸和回腸中MDA含量顯著升高(P<0.05)。然而,灌藥后PEDV感染仔豬十二指腸,空腸和回腸中GSH-Px活性以及MDA含量顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,灌藥后回腸GSH-Px活性和空腸MDA含量無顯著性差異(P>0.05)。表明灌藥后可改善患病仔豬血清和腸道中的抗氧化酶水平,提高抗氧化能力。

A. 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性;B. 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性;C. 丙二醛(MDA)含量A. Glutathione peroxidase (GSH-Px) activity; B. Total superoxide dismutase (T-SOD) activity; C. Malondialdehyde (MDA) content圖5 灌藥對谷胱甘肽過氧化物酶活性、總超氧化物歧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的影響Fig.5 Effect of administration on glutathione peroxidase activity,total superoxide dismutase activity, and malondialdehyde content

3 討 論

PEDV感染臨床癥狀包括腹瀉、嘔吐,以及體重減輕,與PEDV引起的腸道功能障礙密切相關[11]。本試驗中,灌服白頭翁散煎劑和發(fā)酵液可顯著提高感染PEDV仔豬的ADG,從而改善患病仔豬的生長性能。白頭翁散對生長性能的有利作用可能是通過增強腸道功能來促進腸道吸收,與此觀點一致的是,感染PEDV仔豬腹瀉減輕,如糞便評分降低所示。值得注意的是,發(fā)酵液治療效果優(yōu)于煎劑,表明發(fā)酵后白頭翁散復方中的活性成分大量釋放,并且添加干酪乳桿菌R有助于減少腹瀉。據(jù)報道,羅氏乳桿菌HY25101治療可降低PEDV引起的腹瀉和死亡率[12]。此外,作者發(fā)現(xiàn)十二指腸中病毒拷貝量最高,這與Jung等[13]的研究結果不一致,Jung等認為空腸和回腸是PEDV復制的主要靶點。這種差異可能是由于檢測方法和毒株的不同,重要的是白頭翁散煎劑及其發(fā)酵液均可降低腸道組織中病毒基因的表達。

PEDV感染與腸道菌群之間存在潛在關聯(lián),調(diào)節(jié)腸道菌群有助于降低PEDV的發(fā)病率和死亡率[14]。中藥可通過增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量改善腹瀉引起的腸道菌群紊亂[15]。作者發(fā)現(xiàn)白頭翁散可提高PEDV感染仔豬腸道益生菌數(shù)量,抑制有害菌群,這與白頭翁皂苷通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成,改善大鼠炎癥的發(fā)現(xiàn)一致。乳酸菌可改善仔豬腹瀉,提高腸道細胞對大腸桿菌的抵抗力[16]。目前尚不清楚腸道中乳酸桿菌數(shù)量的增加是否抑制PEDV感染,但有助于抑制有害菌群增殖,增強腸道免疫。腸道菌群組成對胃腸功能和健康至關重要,調(diào)節(jié)腸道菌群可能是預防或治療PED的一種措施。需要進一步研究來確定菌群物種水平上的具體變化,尤其是乳酸菌群。

PEDV感染易產(chǎn)生大量氧自由基,導致氧化損傷;MDA含量作為氧化應激的標志,可用來判斷細胞的損傷程度[17]。在本試驗中,感染PEDV仔豬十二指腸、空腸和回腸MDA含量顯著升高,這與Wang等[18]的發(fā)現(xiàn)一致。作者發(fā)現(xiàn)灌藥可顯著降低MDA含量,升高血清和十二指腸中T-SOD活性,表明白頭翁散可調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài),減輕氧化損傷。

PEDV感染主要破壞腸道上皮細胞和絨毛形態(tài),可引起肉眼可見和顯微鏡下的組織學病變[19],白頭翁散煎劑和發(fā)酵液可使患病仔豬腸黏膜損傷明顯降低,表明白頭翁散有助于保護感染PEDV仔豬的腸黏膜結構的完整性。此外,PEDV感染顯著降低D-木糖含量,提高DAO活性,引起腸道功能障礙,作者發(fā)現(xiàn)灌藥治療扭轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象,從而增強腸道屏障功能?？紤]到患病仔豬腹瀉率的降低,調(diào)節(jié)腸道菌群組成以及腸道形態(tài)和屏障功能的改善,可認為白頭翁散有利于PEDV感染仔豬的腸道健康。

4 結 論

白頭翁散可增強感染PEDV仔豬的腸道屏障功能,且灌服煎劑發(fā)酵物的治療效果優(yōu)于煎劑,具有改善患病仔豬生長性能、降低腹瀉率,調(diào)節(jié)腸道菌群組成,保護腸黏膜結構的完整性和增強腸道屏障功能,并提高抗氧化能力。