王 倩，劉亮亮

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院科研處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，武漢 430000）

體外受精（In vitro fertilization，IVF）和胚胎移植是一項(xiàng)重要的輔助生殖技術(shù)。生物凈化是利用受精卵透明帶的屏障作用，結(jié)合體外受精和胚胎移植技術(shù)，可以去除目的品系小鼠所感染的細(xì)菌、病毒、體內(nèi)外寄生蟲等病原體，將小鼠微生物等級(jí)提升至SPF 級(jí)及以上，并有效減少或阻止病原體通過一個(gè)活體小鼠傳染給飼養(yǎng)在屏障設(shè)施內(nèi)的其他小鼠［1，2］。因此，科研人員堅(jiān)持不懈研究可以提高體外受精率、胚胎發(fā)育率以及高產(chǎn)仔率的方法。洪勝輝等［3］研究發(fā)現(xiàn)在小鼠體外受精液（HTF）中添加GSH 1 mmol/L 時(shí)，體外受精效果最好。張景鋒等［4］研究發(fā)現(xiàn)帶顆粒的卵母細(xì)胞和不帶顆粒的卵母細(xì)胞的最佳精卵孵育時(shí)間不同。張長(zhǎng)勇等［5］研究發(fā)現(xiàn)妊娠期母鼠添加營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑能夠增加仔鼠的體質(zhì)量，利于仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。也有研究表明母鼠年齡也會(huì)影響其妊娠結(jié)果和仔鼠行為學(xué)［6］。但是對(duì)于胚胎移植時(shí)，代孕母鼠自身體重和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)后續(xù)妊娠率和產(chǎn)仔率的影響卻少有研究。本研究通過比較在移植相同數(shù)量同等質(zhì)量胚胎的情況下，不同體重范圍代孕母鼠的妊娠率、產(chǎn)仔率的差異來探尋最佳狀態(tài)的代孕母鼠；并比較移植后給孕鼠喂食不同飼料對(duì)其產(chǎn)崽造成的影響，以期為優(yōu)化小鼠生物凈化和擴(kuò)繁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究所使用試驗(yàn)動(dòng)物為6～10 周SPF 級(jí)ICR雌性小鼠，體重分為22～27 g、28～33 g、34～39 g 三組。3～4 周C57BL/6J 雌性小鼠和三月齡C57BL/6J雄性小鼠。以上小鼠均購于上海集萃藥康生物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境中，小鼠生長(zhǎng)環(huán)境維持在溫度23～26 ℃，濕度40%～70%，自動(dòng)光控（白晝黑夜各12 h），小鼠自由飲食飲水。小鼠在到達(dá)該中心后均喂養(yǎng)繁殖飼料，代孕ICR 母鼠在接受移植胚胎手術(shù)之后再進(jìn)行分組飼養(yǎng)，一組進(jìn)行繁殖飼料喂養(yǎng)，一組進(jìn)行維持飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

孕馬血清促性腺激素（PMSG）購于北京索萊寶生物科技有限公司，人絨毛膜促性腺激素（HCG，PRS-HOR-250-2.5 mg）購于Prospectbio 博思配生物科技有限公司。精子體外獲能液（HTF，KYD-008-02）購于Cosmo Bio 生物公司，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液（M2MR-015）和礦物油（M8410，500 mL）購于Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇。小鼠麻醉劑三溴乙醇（M2910，10 mL）購于南京愛貝生物科技有限公司。小鼠繁殖飼料和維持飼料均購于武漢萬千佳興生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿購于Corning 康寧公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世兒Thermo Fisher），體視顯微鏡（Leica 徠卡），倒置顯微鏡（Olympus 公司）。

1.3 體外受精

1.3.1 小鼠卵子超排和取卵 將3～4 周C57BL/6J雌性小鼠腹腔注射PMSG，5 IU/只。間隔48 h 后注射HCG，5 IU/只［7］。在注射激素后15 h 取卵，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剪取小鼠輸卵管，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中清洗2 次后用精細(xì)鑷劃開壺腹部，將卵母細(xì)胞釋放入提前6 h 在細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)孵育的HTF 培養(yǎng)液中。每微升HTF 為80～100 個(gè)卵。

1.3.2 小鼠精子采集 將3 月齡C57BL/6J雄性小鼠用頸椎脫臼法處死，剪取小鼠附睪，在M2清洗2 遍，用精細(xì)鑷劃開附睪尾，挑取1 滴精液放入提前孵育過夜的HTF 培養(yǎng)液中，獲能約1 h。

1.3.3 小鼠體外受精 在小鼠精子獲能后，在顯微鏡下觀察精子活力和濃度，采用精子計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在獲能滴邊緣吸取適量精子加入上述孵育的未受精小鼠卵子中，使其最終精子濃度為1×106個(gè)/mL［8］。

在受精6 h 以后，用預(yù)先拉制好的玻璃電極吸取受精卵在干凈的已預(yù)孵的HTF 液滴中清洗2 次，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.4 胚胎移植

1.4.1 假孕鼠的準(zhǔn)備 分別將挑選的3 個(gè)體重范圍（22～27 g、28～33 g、34～39 g）處于發(fā)情周期的SPF級(jí)ICR 雌性小鼠在胚胎移植前1 d 下午5：00 左右與結(jié)扎的ICR 雄鼠合籠。第2 天早上8：00 左右將有陰道栓的雌鼠挑出，用于胚胎移植試驗(yàn)［9］。

1.4.2 雙細(xì)胞受精卵的移植 將有陰道栓的代孕母鼠稱重，按照每10 g 體重腹腔注射0.2 mL 三溴乙醇麻醉劑。待小鼠完全麻醉失去知覺后，用小鼠專用剃毛器剃去小鼠右側(cè)腎部靠背部的毛，75%乙醇消毒后剪開，用鑷子小心牽引出該側(cè)卵巢脂肪墊和輸卵管，找到輸卵管膨大傘口，用拉制的移卵針連接上口吸管吸取分裂均一的雙細(xì)胞受精卵，插入代孕鼠輸卵管傘口，吹入13 顆雙細(xì)胞至輸卵管壺腹部。將卵巢、子宮等復(fù)位，縫合后消毒。將小鼠放在37 ℃熱臺(tái)待其蘇醒。

1.5 已接受移植的小鼠飼養(yǎng)

每組體重范圍的小鼠再分為2 組，一組飼養(yǎng)繁殖飼料，一組飼養(yǎng)普通維持飼料，其他飼養(yǎng)條件相同。

將已經(jīng)接受過胚胎移植手術(shù)的小鼠單籠飼養(yǎng)，待小鼠生產(chǎn)后，統(tǒng)計(jì)各組代孕鼠妊娠率和窩產(chǎn)崽數(shù)，妊娠率=妊娠雌鼠數(shù)/移植總雌鼠數(shù)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析來分析同組體重下不同飼料是否對(duì)其生產(chǎn)產(chǎn)生影響。采用t檢驗(yàn)對(duì)不同體重組間進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。計(jì)量資料均使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料對(duì)代孕鼠生產(chǎn)的影響

在給不同體重組的代孕鼠移植相同數(shù)量、質(zhì)量的胚胎后，將每組體重再分為2 組分別飼養(yǎng)繁殖飼料和維持飼料。如圖1 所示，在相同體重區(qū)間內(nèi)，繁殖飼料組和維持飼料組的窩產(chǎn)崽數(shù)并無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，在代孕母鼠處于相同的體重區(qū)間內(nèi)時(shí)，代孕鼠只在妊娠周期短期內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)差異對(duì)其胚胎發(fā)育和生產(chǎn)影響不顯著。

圖1 繁殖飼料組和維持飼料組窩產(chǎn)崽數(shù)

2.2 代孕母鼠體重對(duì)其生產(chǎn)的影響

由表1 可知，在接受相同數(shù)量和相同質(zhì)量的胚胎移植后，體重為22～27g 代孕母鼠組的窩產(chǎn)崽數(shù)為（3.65±2.81）只，以及其妊娠率均顯著小于28～33 g、34～39 g 代孕母鼠組（P＜0.05）。22～27 g 代孕母鼠組妊娠率為65%±49%，28～33 g 代孕母鼠組的妊娠率為95%±22%，34～39 g 代孕母鼠組的妊娠率為90%±31%。但28～33 g 與34～39 g 代孕母鼠組的窩產(chǎn)崽數(shù)以及妊娠率均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組窩產(chǎn)崽數(shù)和妊娠率比較

3 小結(jié)與討論

生物凈化技術(shù)已經(jīng)成為預(yù)防小鼠引入污染的風(fēng)險(xiǎn)、確保設(shè)施生物安全的重要手段之一［10］。研究表明，移植胚胎的受精率和移植的胚胎數(shù)量會(huì)影響胚胎移植的產(chǎn)仔率和窩產(chǎn)仔數(shù)量［11］。胚胎的品系和背景也會(huì)對(duì)小鼠胚胎移植后的產(chǎn)仔率造成影響［12］。因此，本研究在保證胚胎品系、質(zhì)量均相同的情況下，分析移植時(shí)代孕母鼠的體重對(duì)其產(chǎn)崽和生產(chǎn)情況的影響，結(jié)果表明，28～33 g 代孕母鼠組和34～39 g 代孕母鼠組的移植生產(chǎn)窩產(chǎn)崽數(shù)顯著高于22～27 g 組，并且其妊娠率也相對(duì)較高。但是在34～39 g 代孕母鼠組生產(chǎn)后，發(fā)現(xiàn)偶爾出現(xiàn)鼠崽會(huì)被大體重母鼠壓死的情況，導(dǎo)致小鼠凈化和擴(kuò)繁效率下降。因此，綜合以上結(jié)果考慮，在小鼠體外受精時(shí)，代孕母鼠體重控制在28～33 g 時(shí)，生產(chǎn)效率最高。但是本研究對(duì)代孕母鼠的體重分組還不夠細(xì)致，生產(chǎn)效率最高的母鼠體重還需要后續(xù)繼續(xù)研究。

有研究表示輔酶Q10 聯(lián)合生長(zhǎng)激素用于IVF 患者備孕期營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充效果良好，能顯著改善IVF-ET結(jié)局，提高妊娠成功率［13］。不同的商品飼料對(duì)小鼠繁殖也會(huì)造成不同影響［14，15］。母鼠在產(chǎn)仔后也會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)問題影響其泌乳，泌乳不足則會(huì)出現(xiàn)食仔的現(xiàn)象，母鼠的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)會(huì)影響其生產(chǎn)［16］。但是本研究發(fā)現(xiàn)，只是在妊娠內(nèi)的飼料差異對(duì)其生產(chǎn)的影響并不顯著，不同飼料組間的窩產(chǎn)崽數(shù)并無顯著差異，原因可能是因?yàn)樾∈笤谶M(jìn)行移植手術(shù)前均喂養(yǎng)相同的繁殖飼料，如果只在妊娠期短期內(nèi)飼養(yǎng)不同的飼料可能對(duì)其生產(chǎn)影響不大。本研究只針對(duì)了一個(gè)廠家的飼料進(jìn)行了短期研究，至于長(zhǎng)期喂食不同廠家的飼料試驗(yàn)結(jié)果是否會(huì)出現(xiàn)差異，以及具體是何種成分對(duì)其造成影響還需要后續(xù)深入研究。

綜上所述，本試驗(yàn)探究了在體外受精的生物凈化中，不同體重區(qū)間的代孕母鼠對(duì)其生產(chǎn)效率的影響，發(fā)現(xiàn)28～33 g 組代孕母鼠的生產(chǎn)效率最高，最適宜用作胚胎移植的代孕母鼠。并且本研究也發(fā)現(xiàn)只在妊娠期喂食不同飼料，繁殖飼料與維持飼料對(duì)其生產(chǎn)影響差異不顯著。通過研究在小鼠體外受精后，代孕母鼠體重及其攝入飼料類型對(duì)其生產(chǎn)效率的影響，為小鼠凈化系統(tǒng)的優(yōu)化提供了參考。

致謝：感謝華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院科研處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心余其林老師對(duì)試驗(yàn)的指導(dǎo)和支持。