李熹翀 巫玉婷 孟祥榮 劉建珍 鞠愛萍 覃燕齡（廣州市花都區(qū)婦幼保健院，廣東廣州 510800）

隨著我國生活水平不斷提高，生育政策的調(diào)整以及人口結(jié)構(gòu)和婚育觀念的改變，35歲及以上的高齡孕婦在孕婦群體所占的比例呈上升趨勢，有文獻報道約占20%以上，高齡孕婦在占產(chǎn)前診斷比例則高達50%以上［1-2］，而胎兒染色體異常與孕婦年齡呈正相關(guān)關(guān)系［3］，高齡孕婦已然成為產(chǎn)前診斷的主要對象。目前G顯帶染色體核型分析技術(shù)仍然是產(chǎn)前診斷細胞遺傳學檢測的“金標準”。但染色體核型分析只能檢測出染色體片段≥10Mb的異常，無法判斷染色體上的微缺失、微重復(fù)以及亞端粒區(qū)的微小重排［4］，存在一定局限性。染色體微陣列分析（chromosome microarray，CMA）是通過陣列比較基因組雜交或使用單核苷酸多態(tài)性陣列進行分析［5］，在染色體微缺失、微重復(fù)等方面，與傳統(tǒng)的核型分析相比，具有優(yōu)勢。兩種方法聯(lián)合診斷，對提高產(chǎn)前診斷效率和準確性有積極意義［6］。為了進一步分析高齡孕婦胎兒染色體異常的發(fā)生情況，本研究通過對CMA聯(lián)合核型分析在廣州市花都區(qū)高齡孕婦檢出效率進行評估分析，為遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷提供資料和臨床診斷技術(shù)的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年1月至2023年3月在廣州市花都區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（廣州花都區(qū)唯一具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)院）經(jīng)羊膜腔穿刺采集羊水、臍帶血或絨毛進行染色體核型分析或染色體微陣列芯片的孕婦共2175例（羊水1904例、臍帶血17例、絨毛254例），均簽署知情同意書，其中35歲及以上高齡孕婦共969例（羊水919例、臍帶血1例、絨毛49例）。

1.2 研究方法

1.2.1 染色體核型分析 對羊水、絨毛、臍帶血標本進行雙線培養(yǎng)，收獲以及制片，行G顯帶檢測，染色體異常的分析和描述標準依照《人類細胞遺傳學國際命名標準2016版》。

1.2.2 CMA檢測 將羊水、絨毛、臍帶血樣本外送到廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，行DNA提取后用PCR方法擴增，隨后對羊水、絨毛、臍帶血DNA進行酶切消化、純化以及片段化處理，行雜交、標記和洗滌，采用美國Affymetrix公司的Cytoscan 750K Array微陣列芯片對拷貝數(shù)變異進行分析，以≥100kb（Marker≥50）分辨率分析基因組拷貝數(shù)變異（CNV）；以≥5Mb（Marker≥50）分析純合區(qū)域（ROH），通過本地化數(shù)據(jù)庫、文獻報道和公共在線公共數(shù)據(jù)對染色體異常情況進行分析。對所檢出CNVs的結(jié)果判讀根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會指南分為5級：①致病性CNVs（pathogenic CNVs，pCNVs）；②可能致病性CNVs（likelypathogenic CNVs）；③臨床意義不明CNVs（variants of unknown significance CNVs，VOUS CNVs）；④可能良性CNVs（1ikely benign CNVs）；⑤良性CNVs（benign CNVs）。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 使用Excel表格對初始數(shù)據(jù)進行錄入和整理，采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）［n（%）］描述，組間比較使用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 所收集的948例高齡孕婦胎兒染色體核型分析正常為859例，異常核型為39例，多態(tài)性為50例，核型異常檢出率為4.11%（39／948），染色體多態(tài)性為5.27%（50／948），詳見表1。

表1 高齡孕婦不同類型標本的染色體核型分析異常結(jié)果檢出率情況［例（%）］

2.2 染色體核型分析異常結(jié)果情況 將89例染色體核型異常結(jié)果按標本類型和染色體異常分類列出，羊水和絨毛標本的染色體數(shù)目異常共23例、嵌合體異常共3例、羅氏易位共2例、平衡性易位共6例，染色體多態(tài)性共50例，其他結(jié)構(gòu)異常共5例，詳見表2。

表2 89例染色體核型分析異常結(jié)果情況

2.3 CMA結(jié)果 所收集的607例高齡孕婦胎兒CMA正常為561例，異常為46例，異常檢出率為7.58%（46／607），其中羊水標本6.91%（39／564）、臍帶血0.00%（0／0）、絨毛16.28%（7／43），詳見表3。

表3 高齡孕婦不同類型標本的CMA異常結(jié)果檢出率情況［例（%）］

2.4 高齡孕婦胎兒核型分析與CMA異常檢出率染色體核型分析異常檢出率（4.11%）低于CMA異常檢出率（7.58%），兩者差異具有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.595，P＝0.003）。

2.5 高齡孕婦胎兒CMA聯(lián)合核型分析異常檢出率 染色體微陣列芯片聯(lián)合核型分析用于586例高齡孕婦產(chǎn)前診斷的異常檢出率為8.53%（50／586），詳見表4，高于染色體核型分析的異常檢出率（4.11%，詳見表1），這兩者差異具有統(tǒng)計學意義（χ2＝12.937，P＝0.000）。染色體微陣列芯片聯(lián)合核型分析用于高齡孕婦產(chǎn)前診斷的異常檢出率（8.53%，詳見表4）高于染色體微陣列芯片的異常檢出率（7.58%，詳見表3），這兩者差異不具有統(tǒng)計學意義（χ2＝0.367，P＝0.545）。

表4 高齡孕婦不同類型標本的CMA聯(lián)合染色體核型分析異常結(jié)果檢出率情況［例（%）］

2.6 CMA正常但核型分析異常和多態(tài)性的胎兒檢測結(jié)果 在586例高齡孕婦胎兒CMA聯(lián)合核型分析檢測中，有6例CMA正常但核型分析異常的胎兒結(jié)果均是平衡性易位、倒位、羅氏易位等異常，有35例CMA正常但染色體多態(tài)性，詳見表5。

表5 41例CMA正常但核型分析異常和多態(tài)性的胎兒檢測結(jié)果情況

2.7 CMA異常但核型分析正常的胎兒檢測結(jié)果 在586例高齡孕婦胎兒CMA聯(lián)合核型分析檢測中果，，有其1中7 1例6 C例M異A常異是常片但段核大型小分均析正是常在的10胎9k兒b結(jié)～3.38Mb之間的微缺失和微重復(fù)，還有1例異常是片段大小20.4Mb的重復(fù)，詳見表6。

表6 17例CMA異常但核型分析正常的胎兒檢測結(jié)果情況

2.8 CMA和核型分析檢測均異常的胎兒檢測結(jié)果 在586例高齡孕婦胎兒CMA聯(lián)合核型分析檢測中，有27例CMA和核型分析檢測均異常的胎兒結(jié)果，其中染色體21三體（9例）、18三體（5例）、13三體（2例）、克氏綜合癥（2例）、超雌綜合征（1例）、性染色體嵌合體（1例）、＞10M缺失與重復(fù)（3例）兩種方法結(jié)果基本一致，還有4例異常結(jié)果不一致，詳見表7。

表7 27例CMA和核型分析檢測均異常的胎兒檢測結(jié)果情況

3 討論

在2020年1月至2023年3月間收集的產(chǎn)前診斷標本中臍帶血標本只有1例高齡病例，可能原因是高齡是做產(chǎn)前診斷重要的高危因素，而臍帶血標本基本上都是孕晚期才采集，一般有高齡這一高危因素的孕婦大部分會在孕12周到26周時選擇做絨毛或羊水的產(chǎn)前診斷檢測。本研究中35歲及以上的高齡孕婦占花都區(qū)產(chǎn)前診斷孕婦的比例為44.55%（969／2175），其中高齡孕婦胎兒的染色體核型分析異常檢出率為4.11%，低于唐艷［7］等人研究的8.2%，染色體微陣列芯片分析的異常檢出率為7.58%，高于文獻報道的2.89%［8］。高齡孕婦胎兒染色體多態(tài)性和異常結(jié)果中的平衡性易位、倒位、羅氏易位等異常占6.12%（58／948），超過核型分析異常率4.11%，說明染色體多態(tài)性、平衡性易位、倒位、羅氏易位在高齡孕婦群體中染色體異常較為常見，而CMA無法檢測這些異常［9］，染色體多態(tài)性、平衡性易位、倒位、羅氏易位等異常也與生殖、不孕不育、不良孕產(chǎn)等都有一定關(guān)系［10-11］，因此，核型分析在這一方面上能很好彌補CMA的局限性，它們聯(lián)合使用能顯著提高染色體異常檢出率及準確率。

本研究中，在586例高齡孕婦不同類型標本的CMA聯(lián)合染色體核型分析中，有6例CMA正常但核型分析結(jié)果異常均是平衡性易位、倒位、羅氏易位等，有35例CMA正常但染色體多態(tài)性，詳見表4、表5，與文獻報道的CMA無法檢測出染色體多態(tài)性、平衡性易位、倒位、羅氏易位相符合［9］。在CMA檢測異常但核型分析結(jié)果正常的17例中，我們可以看到其中16例的異常片段大小是在109kb～3.38Mb之間，與Wang J［4］等人研究報道相符合，核型分析無法檢測低于5Mb的片段。但有1例是廣東省婦幼保健院CMA檢測出致病性CNV，在染色體20p12.3-p11.1位置發(fā)生重復(fù)，片段大小約20.4Mb，而核型分析沒檢測出來，詳見表6。隨后該孕婦去中山大學附屬第一醫(yī)院行臍血染色體核型檢查（47，XN，＋mar［30］／46，XN［30］）和羊水CMA檢測（arr［GRCh37］20p12.3p11.1（5505817＿26305566）×2.6～2.8，提示嵌合，嵌合比例約為60%～80%）。該病例中染色體核型分析和CMA檢測手段的主要區(qū)別是核型分析對羊水進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，會出現(xiàn)細胞優(yōu)勢生長等情況。細胞優(yōu)勢生長指如果原始羊水中存在兩種不同核型，而且比例不同的兩種細胞時候，細胞生長多和快的就成為優(yōu)勢細胞，在培養(yǎng)過程中優(yōu)勢生長，而比例較少的另一種細胞受到抑制，出現(xiàn)了兩種細胞核型培養(yǎng)前后比例不一致的情況，該病例中羊水46，XN核型細胞為優(yōu)勢生長細胞，異常核型細胞由于生長過少，在細胞收獲與制片過程中無法得到異常核型，因此造成羊水染色體核型分析技術(shù)對嵌合異常的漏檢，而臍帶血染色體檢測出來的嵌合的準確率更高，且一般為真性嵌合［12］，所以中山大學附屬第一醫(yī)院的臍血染色體能檢測出嵌合異常。而CMA對未經(jīng)培養(yǎng)的羊水細胞進行檢測，較需要進行培養(yǎng)的羊水染色體核型分析更能反映羊水細胞的真實情況，但該技術(shù)對嵌合體也存在一定的局限性，該技術(shù)對≤30%的低比例嵌合容易漏診。所以廣東省婦幼保健院CMA與本院的核型分析雖然各自對該病例的嵌合異常都發(fā)生了漏檢，但由于這兩種方法聯(lián)合檢測，給臨床醫(yī)生和實驗室進行互相驗證與提醒，從而避免了遺傳缺陷患兒的出生，該病例的孕婦最終選擇了引產(chǎn)。如果只做其中一項，尤其是如果當時只做核型分析的話，就很容易發(fā)生漏檢，使得該遺傳缺陷的患兒出生。如果該患兒出生，對于醫(yī)院、對于患兒、對于孕婦家庭來說都是相當沉重的打擊。

在27例CMA和核型分析檢測均異常的病例中，染色體21三體（9例）、18三體（5例）、13三體（2例）、克氏綜合癥（2例）、超雌綜合征（1例）、性染色體嵌合體（1例）、＞10M缺失與重復(fù)（3例）等異常在CMA與核型分析兩個檢測方法中結(jié)果是基本一致的，剩余4例異常結(jié)果不一致的病例中，CMA均沒檢測出染色體多態(tài)性、平衡易位與羅氏易位等異常，與張金花［13］等人研究相符，詳見表7。而在4例核型分析沒檢測出的異常中，有2例分別是2.8Mb大小的CNVs和609kb大小的CNVs，染色體微缺失／微重復(fù)改變了正?；蚪M部分片段的拷貝數(shù)，＜10Mb的重復(fù)核型分析無法測出，而CMA技術(shù)可以一次性分析大量的基因組序列，實現(xiàn)了對全基因組的均勻覆蓋，可對全基因組內(nèi)的微缺失／微重復(fù)區(qū)域同時進行檢測，對于CNVs的診斷存在明顯優(yōu)勢［14］。有1例是CMA檢測出12p四體嵌合體，而染色體核型分析沒發(fā)現(xiàn)嵌合異常，很可能也是因為培養(yǎng)過程中絨毛細胞選擇性生長原因，造成漏檢。還有1例是CMA提示16號染色體單親二體（LOH／UPD），而核型分析由于單親二體只是部分片段均遺傳自父母中的一方，不攜帶另一方的拷貝，導(dǎo)致隱性遺傳病患病風險增加，在染色體形態(tài)學中并無肉眼可見的異常變化，因而無法測出，這與王曄［15］等人研究中2例16號染色體單親二體（LOH／UPD）核型分析正常相符，因此CMA是單親二體等異常檢測的一種準確有效的診斷方法，也大大提高了UPD在產(chǎn)前胎兒中的檢出率。最后該胎兒正常分娩，經(jīng)隨訪小孩發(fā)育良好，并無明顯異常。

染色體微陣列芯片聯(lián)合核型分析用于高齡孕婦產(chǎn)前診斷的異常檢出率（8.53%）分別高于染色體核型分析、染色體微陣列芯片的異常檢出率（4.11%，7.58%）。染色體核型分析主要檢測＞10Mb以上的大片段結(jié)構(gòu)畸變，并可發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性、平衡性易位、倒位、羅氏易位等異常；而CMA可檢查＞50kb以上的微重復(fù)／微缺失，并可識別嵌合體、LOH／UPD等，這兩者各有優(yōu)勢和局限性。

綜上所述，隨著高齡孕婦比例不斷上升，染色體微陣列芯片＋核型分析聯(lián)合診斷高齡孕婦胎兒顯得至關(guān)重要。這兩種方法對較高比例嵌合體及非整倍體染色體異常均可以檢出，臍帶血標本的核型分析技術(shù)在鑒別真假嵌合方面更優(yōu)于羊水和絨毛標本的核型分析技術(shù)［12］。對于在高齡孕婦染色體異常中占比超過一半的多態(tài)性、平衡性易位、倒位、羅氏易位則只有核型分析可以檢出，而微缺失、微重復(fù)、單親二體（LOH／UPD）等異常只有CMA可以檢出，因此兩種方法聯(lián)合應(yīng)用能互為驗證，互相補充不同種類的異常核型，使檢測結(jié)果更加準確與精確，能顯著提高產(chǎn)前診斷的異常核型檢出率，從而避免了漏診風險，為胎兒預(yù)后評估及夫妻再生育提供科學依據(jù)，對降低出生缺陷患兒具有重大的社會效益。