黃如純 柯華玲 皮回春* 劉維強(qiáng) 吳麗萍 吳思琪 劉金星

（1.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院／汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院龍崗婦幼臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科；2.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院／汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院龍崗婦幼臨床學(xué)院超聲影像科；3.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院／汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院龍崗婦幼臨床學(xué)院中心實驗室，廣東深圳518172）

胎兒骨骼發(fā)育異常（skeletal dysplasia，SD）是一組影響骨和軟骨生長發(fā)育的疾病，包括骨形狀、大小、密度的異常［1］，是較為常見的出生缺陷，在胎兒結(jié)構(gòu)畸形中占10%，其在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率約為0.36／10000～3.2／10000［2-4］。過去人們認(rèn)為，骨骼發(fā)育異常僅僅與環(huán)境致畸因素暴露、藥物、母體自身免疫性疾病等［1］有關(guān)，近年來，隨著細(xì)胞和分子遺傳技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到遺傳因素在骨骼發(fā)育異常胎兒中起著重要的作用，遺傳學(xué)診斷也成為胎兒產(chǎn)前診斷的主要手段［5］。遺傳因素主要包括染色體非整倍體、染色體微缺失／微重復(fù)和基因突變等。本研究系統(tǒng)回顧了75例產(chǎn)前超聲診斷的骨骼發(fā)育異常胎兒的遺傳學(xué)檢測結(jié)果，探討遺傳因素在骨骼發(fā)育異常胎兒中的作用，為臨床遺傳咨詢提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月1日至2022年12月30日在深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)骨骼發(fā)育異常至醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科行遺傳學(xué)檢測的75例胎兒為研究對象，62例局部畸形（包括馬蹄內(nèi)翻足、并指／趾、疊指、上／下肢體骨部分缺如、鉤狀手等），9例短肢畸形（股骨、肱骨小于2個標(biāo)準(zhǔn)差），4例骨形態(tài)學(xué)異常（長骨彎曲、胸廓發(fā)育不良、骨密度改變等），其中47例行介入性產(chǎn)前診斷進(jìn)行染色體核型分析、染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA），部分羊水核型分析及CMA檢測陰性者進(jìn)一步行全外顯子測序（whole exome sequencing，WES），28例超聲診斷骨骼發(fā)育異常后孕婦要求直接終止妊娠，經(jīng)同意后取引產(chǎn)胎兒組織進(jìn)行CMA檢測，部分結(jié)果陰性者與其簽訂《科研檢測知情同意書》后，進(jìn)一步行WES，回顧性分析以上病例的遺傳學(xué)檢測結(jié)果。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（審批號：LGFYYXLLL-2020-002），所有孕婦均接受檢測前咨詢并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查 使用Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率4.0～5.0MHz。檢查醫(yī)生均經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)，按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行早孕期NT、中孕期II級及III級超聲檢查，全面觀察胎兒各系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)育情況，參照李勝利等［6］《胎兒畸形產(chǎn)前超聲診斷學(xué)》診斷胎兒常見的骨骼發(fā)育異常。

1.2.2 分組 根據(jù)骨骼發(fā)育異常的復(fù)雜程度及是否合并其他系統(tǒng)異常進(jìn)行分組，A組為單純性骨骼發(fā)育異常，即胎兒只存在與骨骼發(fā)育相關(guān)的超聲異常；B組為骨骼發(fā)育異常合并其他系統(tǒng)超聲異常。

1.2.3 羊水細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析 按照G顯帶染色體核型分析技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作對48例胎兒羊水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片及G顯帶染色體核型分析，每例標(biāo)本使用Leica SL120全自動核型掃描儀掃描100個分裂相。核型診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2016年人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體系（ISCN2016）。

1.2.4 DNA提取和染色體微陣列檢測（CMA）染色體核型結(jié)果正常的羊水標(biāo)本及27例引產(chǎn)胎兒組織，提取DNA后，采用Agilent公司生產(chǎn)的8×60k芯片或美國Affymetrix公司CytoScanTMHD芯片進(jìn)行全基因組掃描，數(shù)據(jù)分析參照OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 DNA提取及全外顯子測序（WES） 染色體微陣列分析陰性的4例羊水標(biāo)本和5例引產(chǎn)胎兒組織提取基因組DNA，進(jìn)行文庫構(gòu)建，按流程獲得最終的測序文庫。文庫QC檢測合格后即上機(jī)測序（Illumina NovaSeq 6000測序系統(tǒng)），測得的數(shù)據(jù)使用配套的科諾安數(shù)據(jù)分析軟件（杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司）進(jìn)行分析。對發(fā)現(xiàn)的變異采用Sanger測序進(jìn)行位點(diǎn)驗證及家系驗證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定性資料用率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析及微陣列分析結(jié)果 47例進(jìn)行了羊膜腔穿刺術(shù)的SD胎兒，染色體核型分析檢出4例非整倍體：包括3例18三體、1例45，X／del（X）嵌合。發(fā)現(xiàn)1例染色體多態(tài)，未列入陽性病例統(tǒng)計。CMA額外檢出6例致病性拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。28例AD胎兒引產(chǎn)后行CMA檢測，檢出8例非整倍體：包括8例18三體，1例13三體。非整倍體總檢出率為：16%（12／75）；CMA額外檢出6例致病性CNVs（8%，6／75），綜上總檢出率為24%（18／75）（圖1）。

圖1 75例骨骼發(fā)育異常胎兒遺傳學(xué)檢測結(jié)果

2.2 全外顯子測序（WES） 9例染色體正常胎兒進(jìn)行了WES檢測，3例檢出致病突變，2例檢出疑似致病突變，2例為臨床意義不明的突變（VOUS），2例陰性結(jié)果；將檢出的VOUS也納入陽性病例統(tǒng)計，檢出率77.8%（7／9）（圖2）。

圖2 SD致病性CNVs Xp22.33微缺失的染色體微陣列分析結(jié)果

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 75例AD胎兒中A組47例（62.7%，47／75），B組28例（37.3%，28／75），遺傳學(xué)檢測陽性病例共25例（表1），陽性檢出率為32.9%（25／75），其中A組、B組陽性檢出率分別為21.3%（10／47）、53.6%（15／28），2組間檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.846，P＝0.009＜0.01）（表2）。

表1 不同骨骼發(fā)育異常胎兒與染色體、基因異常的關(guān)系

表2 A組、B組骨骼發(fā)育異常胎兒遺傳學(xué)陽性檢出情況（例）

3 討論

骨骼發(fā)育異常與染色體病相關(guān)，從以往研究結(jié)果顯示，產(chǎn)前超聲篩查骨骼畸形的染色體核型檢出率為4.65%～6%［7-8］，而染色體微陣列技術(shù)將SD胎兒基因組致病性CNVs的檢出率比傳統(tǒng)染色體核型分析提高了9%～21.95%，并識別和鑒定了一些可能導(dǎo)致胎兒骨骼發(fā)育異常表型的候選基因［8-10］。本研究中共檢測出12例非整倍體，10例18三體，1例13三體，1例mos 45，X／del（X），染色體非整倍體檢出率16%（12／75），比既往報道檢出率高，可能與18三體及13三體除骨骼發(fā)育異常外往往合并其他結(jié)構(gòu)畸形，在早孕期11～13＋6周NT超聲檢查及孕中期16～18周II級產(chǎn)前超聲篩查可以發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的表型有關(guān)。CMA額外檢出8%（6／75）致病性CNV，略低于既往報道，可能與產(chǎn)前胎兒行CMA分析檢測的表型譜相對比較狹窄和局限，超聲對某些骨骼異常的診斷存在偏差，且本研究樣本量較小等因素有關(guān)。

不同骨骼發(fā)育異常與不同染色體病相關(guān)，18三體胎兒會出現(xiàn)拇指短小、并指（趾）、馬蹄內(nèi)翻足、搖椅足、橈骨缺如；13三體胎兒會出現(xiàn)軸后性多指（趾）、手指彎曲伴疊壓、馬蹄內(nèi)翻足、小骨盆；Turner綜合征產(chǎn)前超聲也會有股骨短等表現(xiàn)。本研究中，9例（編號1-9）超聲提示鉤狀手胎兒中有6例18三體，其中4例（編號6-9）合并橈／尺骨缺如；9例（編號10-18）部分骨缺如的胎兒中，僅編號10超聲發(fā)現(xiàn)橈骨缺如合并小下頜提示18三體；1例重疊指（編號19）合并脊柱發(fā)育異常提示18三體；5例（編號20-24）多指／趾畸形，4例單純多指／趾畸形未發(fā)現(xiàn)染色體異常，僅有1例（編號24）合并左心室強(qiáng)光點(diǎn)發(fā)現(xiàn)16p13.11微缺失，為致病性CNV；36例（編號25-60）馬蹄內(nèi)翻足病例中，6例合并其他系統(tǒng)異常，檢出2例18三體，1例13三體，剩余30例單純馬蹄內(nèi)翻足，檢出3例（編號58-60）致病性CNVs，分別為16p13.11微缺失、16p11.2微缺失、7q11.23微重復(fù)。16p13.11微缺失可表現(xiàn)為智力障礙、先天性多發(fā)畸形、癲癇等，該缺失區(qū)域包含NDE1、MYH11、PDXDC1、ABCC6等13個蛋白編碼基因，其中ABCC6是一種ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在肝和腎中表達(dá)，其通過調(diào)節(jié)具有抗礦化活性的基因，調(diào)節(jié)骨骼系統(tǒng)的鈣化過程，參與骨骼發(fā)育的發(fā)展過程［11］，但目前沒有明確的證據(jù)證明與馬蹄內(nèi)翻足、多指／趾畸形相關(guān)；16p11.2微缺失可導(dǎo)致“16p11.2微缺失綜合癥”，該區(qū)域包含CLN3、TUFM、ATP2A1、CD19等17個蛋白編碼基因，癥狀主要表現(xiàn)為肥胖、輕度發(fā)育遲緩和行為問題等；7q11.23微重復(fù)可導(dǎo)致“7q11.23重復(fù)綜合征”，該區(qū)域包含ELN、NCF1等27個蛋白編碼基因，主要表現(xiàn)為語言延遲、輕微的顱面畸形、認(rèn)知障礙、先天性心臟病等先天發(fā)育異常，但馬蹄內(nèi)翻足在上述綜合癥中均未見報道，是否與之有關(guān)仍待進(jìn)一步研究。

骨骼發(fā)育異常調(diào)控基因眾多，在2019年修訂的遺傳性骨骼疾病的病理學(xué)及分類中［12］提到遺傳性骨病有461種，涉及437個基因。由于SD的遺傳異質(zhì)性，臨床表型可從相對輕微到致命性，對于臨床表現(xiàn)無特異性的病例，胎兒結(jié)構(gòu)異常的表型可能僅是某些遺傳性疾病的一組癥狀之一，因此通過產(chǎn)前超聲明確診斷具有一定的挑戰(zhàn)性。近年來，越來越多的研究者報道目標(biāo)區(qū)域外顯子捕獲檢測或全外顯子測序，可以提高SD患兒的致病基因檢出率［2、13］。本研究中9例（編號62-70）四肢骨短的胎兒，發(fā)現(xiàn)3例染色體異常，4例基因突變，陽性檢出率為77.8%（7／9），其中1例mos 45，X／del（X），2例Xp22.33微缺失，該區(qū)域涉及基因SHOX（圖2），該基因的表達(dá)僅限于胎兒腎臟、骨骼肌和骨髓成纖維細(xì)胞，在骨髓成纖維細(xì)胞中的表達(dá)最高，為單倍劑量敏感基因，單倍劑量不足可導(dǎo)致身材矮小、手腳短、脊柱側(cè)彎、Leri-Weill軟骨發(fā)育不良等［14］，相關(guān)文獻(xiàn)報道［15-16］SHOX基因單倍劑量不足時，胎兒可在孕中、晚期表現(xiàn)出長骨短，與本研究受檢胎兒表型相符。另外4例四肢骨短胎兒行WES檢測均發(fā)現(xiàn)異常，涉及基因有FGFR3、COL2A1、TRIP11，F(xiàn)GFR3基因變異與軟骨發(fā)育不全有關(guān)，其中第8號外顯子的c.1138G＞A（Gly380Arg）（編號67）為是FGFR3基因中已知的熱點(diǎn)突變，是軟骨發(fā)育不全患者中最常見的變異位點(diǎn)［17］，編號68胎兒提示FGFR3基因c.2005C＞G（p.Arg669Gly）新發(fā)突變，經(jīng)檢索均為目前尚未報道過的致病位點(diǎn)，雖評定為臨床意義不明，但該例胎兒超聲提示股骨-4SD、肱骨-3SD，股骨長／足長＝0.75（＜0.8），符合軟骨發(fā)育不全臨床表型；編號69提示COL2A1基因c.3472G＞A（p.Gly1158Ser）新發(fā)突變，評為疑似致病突變，與軟骨生成不全2型有關(guān)；編號70提示TRIP11基因c.2632C＞T（p.R878*）純合突變，與軟骨發(fā)育不全I(xiàn)A型相關(guān)。1例（編號71）超聲表現(xiàn)為三葉草型頭顱、并指／趾畸形胎兒，發(fā)現(xiàn)FGFR2基因c.755C＞G（p.Ser252Trp）新發(fā)突變，與Pfeiffer綜合征疾病相關(guān)；編號72-72均為骨形態(tài)學(xué)異常胎兒，2例發(fā)現(xiàn)SOX9基因，主要與彎肢發(fā)育異常相關(guān)，其中編號37超聲發(fā)現(xiàn)胎兒肋骨縮短、胸腔明顯狹窄、胸圍縮小、四肢長骨明顯短小彎曲、馬蹄內(nèi)翻足、小下頜，發(fā)現(xiàn)SOX9基因c.1452＿1453del TG（p.Val486Profs*91）經(jīng)檢索為目前尚未報道過的致病位點(diǎn)，豐富了胎兒骨骼異常的基因型與表型的關(guān)系。上述WES檢測發(fā)現(xiàn)基因突變均進(jìn)行一代驗證，除了TRIP11基因為純合突變外，其余突變均為新發(fā)突變，呈常染色體顯性遺傳，夫婦雙方均不攜帶致病基因，再發(fā)的概率較低，但是不能完全排除雙親生殖細(xì)胞的嵌合造成再發(fā)的可能性。編號70胎兒TRIP11基因突變分別遺傳自雙親（圖3），呈常染色體隱性遺傳，再生育時有25%的概率再發(fā)，再次妊娠時可在妊娠早期行絨毛膜穿刺術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，或選擇胚胎植入前遺傳學(xué)診斷避免反復(fù)生育畸形胎兒。

圖3 1例SD胎兒的WES檢測結(jié)果（TRIP11基因c.2632C＞T（p.R878*）純合突變，分別遺傳自雙親）

本研究發(fā)現(xiàn)，單純SD和SD合并其他超聲異常的胎兒比單純性SD的胎兒有更高的遺傳學(xué)陽性檢出率。2例SD合并其他超聲異常胎兒，在染色體核型、CMA結(jié)果未見異常后加做WES的結(jié)果仍為陰性，致畸原因不明?？赡艿脑虬ǎ孩賅ES檢測技術(shù)無法做到100%覆蓋，有可能遺漏致病基因突變［18］；②不排除基因外顯子區(qū)域以外的DNA序列異常，如非編碼區(qū)和內(nèi)含子突變，從而影響了蛋白質(zhì)的表達(dá)，導(dǎo)致疾病發(fā)生；③其他因素：環(huán)境、藥物因素等。對病因未明的骨骼發(fā)育異常胎兒我們可進(jìn)一步增加測序深度或應(yīng)用全基因組測序進(jìn)行重測序?qū)ふ抑虏≡颉?/p>

綜上所述，胎兒SD與染色體非整倍體、染色體微缺失微重復(fù)綜合征及基因突變關(guān)系密切，應(yīng)建議介入性產(chǎn)前診斷，并進(jìn)行詳細(xì)的超聲檢查。本研究為回顧性分析，具有一定的局限性，一是樣本量較小，結(jié)果可能存在偏倚；二是對胎兒研究不夠深入，大部分SD胎兒尤其是SD合并其他超聲異常胎兒未進(jìn)一步行WES檢測。進(jìn)一步的研究應(yīng)該繼續(xù)收集更多病例，對染色體陰性結(jié)果胎兒進(jìn)行WES檢測，分析其相關(guān)性及可行性，從而提供更加精準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷，為產(chǎn)前遺傳咨詢、預(yù)后判斷及再發(fā)風(fēng)險評估提供依據(jù)。