楊潔霞 王東梅 侯亞萍 郭芳芳 彭海山 胡聽聽 吳菁*

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州，511442）

自從1997年Lo提出發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA（cell free fetalDNA，cffDNA）以來［1］，基于胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測打開了產(chǎn)前篩查新路徑，改變了傳統(tǒng)產(chǎn)前血清學(xué)篩查模式。NIPT檢測明顯提高了產(chǎn)前篩查效率降低假陽性率，對常規(guī)21三體／18三體／13三體-綜合征復(fù)合陽性預(yù)測值可達(dá)66.73%以上［2-3］，假陽性率小于0.3%，漏診風(fēng)險(xiǎn)約0.01%［4］。有報(bào)道NIPT的敏感性和陽性預(yù)測值與cffDNA濃度有明顯相關(guān)性，隨著cffDNA濃度升高敏感性和陽性預(yù)測值也隨之增高。為減少漏診，大部分實(shí)驗(yàn)室設(shè)置了cff DNA濃度最低報(bào)告范圍，一般以cff DNA濃度＞3%或4%為最低可報(bào)告下限［5］。當(dāng)cffDNA濃度低于這些水平時(shí)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)將結(jié)果歸類為不可報(bào)告，從而歸類為檢測失敗。

胎兒cfDNA是由胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡釋放到母體外周血，其數(shù)量和質(zhì)量反映了胎盤的生長和功能；一個(gè)小的或功能不良的胎盤可能與非整倍體和一些不良的產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局有關(guān)，如高血壓、胎兒生長受限和早產(chǎn)。子癇前期、胎兒生長受限等胎盤源性疾病可能影響胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡釋放cf DNA，從而導(dǎo)致外周血cffDNA濃度低，導(dǎo)致NIPT檢測失敗，隨著血漿cfDNA的研究與技術(shù)的發(fā)展，血漿cfDNA已被發(fā)現(xiàn)與妊娠相關(guān)疾病如子癇前期、胎兒生長受限等相關(guān)，甚至可以作為疾病是否發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)［6-7］。

也有研究認(rèn)為cffDNA濃度低可能增加潛在胎兒非整倍體風(fēng)險(xiǎn)，最近的一項(xiàng)系統(tǒng)綜述發(fā)現(xiàn)，近四分之一的非報(bào)告結(jié)果與潛在的胎兒非整倍體或三體相關(guān)。除了妊娠并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)外，cffDNA濃度低檢測結(jié)果也與胎兒非整倍體本身的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。例如，在13三體和18三體，以及X單倍體和三倍體的妊娠中，cffDNA濃度水平較低，盡管在所有研究中并不一致。Rava等人在他們的研究中發(fā)現(xiàn)，與整倍體胎兒相比，胎兒有21三體時(shí)的平均cffDNA濃度更高，而當(dāng)胎兒有13三體、18三體或X單體時(shí)的平均cffDNA濃度更低［8］。Peter等的回顧和薈萃分析結(jié)果認(rèn)為應(yīng)重視cffDNA濃度低不可報(bào)告結(jié)果的產(chǎn)前管理。面對cffDNA濃度低不可報(bào)告結(jié)果的孕婦應(yīng)被告知胎兒染色體畸變的風(fēng)險(xiǎn)增加，但不應(yīng)告知21三體［9］。

本研究擬總結(jié)分析cffDNA濃度低NIPT檢測失敗樣本的相關(guān)因素和妊娠結(jié)局，為該類病例的臨床遺傳咨詢提供參考證據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧性收集2017年1月至2022年7月期間選擇本院產(chǎn)前診斷中心接受NIPT檢測孕婦。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)兩次采血均因cffDNA濃度低檢測失敗樣本，排除標(biāo)準(zhǔn)為妊娠結(jié)局失訪樣本。符合入組標(biāo)準(zhǔn)孕婦均接受了詳細(xì)的臨床遺傳咨詢并建議進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷和定期超聲監(jiān)測胎兒生長發(fā)育。收集孕婦臨床資料、產(chǎn)前診斷情況、孕期超聲檢查結(jié)果、孕期并發(fā)癥、妊娠結(jié)局等資料綜合分析。該研究得到了廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)（ID 2013102301）的正式批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理 孕婦知情同意后，EDTA抗凝管采集其外周血10ml，6h內(nèi)分離血漿，具體流程為：4℃、1600G離心10min，取上清血漿，16000 G離心10min，分離上清血漿至EP管中。按照試劑盒說明書提取血漿中游離DNA并構(gòu)建文庫，在末端修復(fù)后進(jìn)行DNA富集技術(shù)構(gòu)建文庫［10］，選用胎兒染色體非整倍體試劑盒（T21，T18，T13）試劑盒在BioelectronSeq 4000高通量測序儀采用半導(dǎo)體技術(shù)進(jìn)行檢測［11］。測序數(shù)據(jù)經(jīng)處理后（去低質(zhì)量、去重復(fù)、GC校正等）獲得不低于90M的有效reads數(shù)（每個(gè)樣本不低于3M的uniquereads）。比對到人類基因組參考序列圖譜經(jīng)生物信息學(xué)分析分別計(jì)算出目標(biāo)疾病染色體的Z值，男胎根據(jù)Y染色體唯一比對條數(shù)進(jìn)行胎兒DNA濃度計(jì)算，女胎則基于SeqFF算法建立高維回歸模型，使用劃分為50kb基因組區(qū)域的常染色體序列計(jì)數(shù)來計(jì)算。NIPT檢測失敗的標(biāo)準(zhǔn)cffDNA濃度＜4%。

1.2.2 介入性產(chǎn)前診斷、孕期超聲監(jiān)測及妊娠結(jié)局隨訪 對選擇介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，經(jīng)充分告知和知情同意后，抽取羊水或臍血進(jìn)行染色體核型分析／染色體微陣列分析（CMA）檢測。隨訪所有入組病例的產(chǎn)前診斷結(jié)果、妊娠結(jié)局和新生兒情況。我們記錄了以下人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征：年齡、BMI、胎兒數(shù)、孕婦的藥物使用情況和受孕類型；同時(shí)記錄了孕中晚期超聲檢查結(jié)果，妊娠或分娩期間的產(chǎn)婦并發(fā)癥和新生兒情況。所有病例均獲得了妊娠結(jié)局。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將研究數(shù)據(jù)錄入Excel表格中進(jìn)行匯總、整理、統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 2017年1月至2022年7月期間選擇本院接受NIPT檢測孕婦共68581例，其中經(jīng)兩次采血均因濃度低標(biāo)本39例（0.057%），收集孕婦年齡、BMI、孕婦的藥物使用情況和受孕類型、產(chǎn)前診斷情況、孕期超聲檢查結(jié)果、孕期并發(fā)癥、妊娠結(jié)局等資料（表1）。孕婦年齡分布（31.62±5.533）歲，BMI分布（24.51±4.39），其中通過試管嬰兒受孕19例（48.72%），雙胎妊娠10例（25.64%），預(yù)產(chǎn)期高齡妊娠15例（38.46%），唐氏篩查結(jié)果異常9例（23.08%）。我們同時(shí)記錄了第一次和第二次采血孕周和cffDNA濃度（表2），第一次采血孕周（15.95±2.32）周，cffDNA濃度（3.30±0.92）%；第二次采血孕周（18.03±2.48）周，cffDNA濃度（3.42±0.87）%，兩次采血間隔時(shí)間（14±1.15）d。

表1 39例檢測失敗病例基本情況

表2 兩次采血孕周及cffDNA濃度情況

2.2 產(chǎn)前診斷和孕期超聲情況及妊娠結(jié)局 孕期超聲檢查發(fā)現(xiàn)異常9例（23.08%）（表1），其中NT增厚合并孕晚期FGR 2例，均接受產(chǎn)前診斷行染色體核型分析和／或CMA檢測未檢出胎兒染色體異常。孕晚期超聲發(fā)現(xiàn)單純FGR 4例，均接受產(chǎn)前診斷，1例染色體核型分析檢出46，XN，inv（9）（p12q13）mat，提示胎兒9號染色體臂間到位，評估可能是多態(tài)，經(jīng)驗(yàn)證母系遺傳，其余均未見異常。所有病例均進(jìn)行妊娠結(jié)局追蹤隨訪，孕中期發(fā)生難免流產(chǎn)2例，早產(chǎn)10例，其余均足月正常分娩，未發(fā)現(xiàn)其他異常，所有胎兒均存活。另發(fā)現(xiàn)孕期母體并發(fā)癥10例，包括妊娠期糖尿病8例，妊娠期高血壓2例。

2.3 雙胎／三胎其中一胎減胎或停育病例NIPT結(jié)果、孕期情況、妊娠結(jié)局 39例病例中有7例為多胎妊娠早期發(fā)生其中一胎停育或選擇減胎（表3），NIPT結(jié)果兩次檢測結(jié)果均提示男胎，Y染色體z值很低，妊娠結(jié)局隨訪為女性胎兒。造成檢測失敗原因可能為早期發(fā)生停育或減胎的胎兒為男胎，剩余存活胎兒均為女胎，停育男胎持續(xù)釋放低濃度Y染色體到母血從而引起NIPT檢測結(jié)果表現(xiàn)為cffDNA濃度低。孕晚期超聲2例出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩表現(xiàn)，1例出現(xiàn)羊水過多，1例出現(xiàn)胎兒雙側(cè)腦室增寬，其中3例接受產(chǎn)前診斷結(jié)果未見異常。6個(gè)病例7個(gè)胎兒成功分娩，新生兒篩查正常，1例病例發(fā)生難免流產(chǎn)。

表3 雙胎／三胎其中一胎減胎或停育病例NIPT結(jié)果、孕期情況、妊娠結(jié)局

3 討論

隨著NIPT技術(shù)臨床使用越來越成熟，NIPT檢測失敗病例相關(guān)研究日益受到重視，cffDNA濃度低是導(dǎo)致檢測失敗最常見原因［12］。本研究針對因cffDNA濃度低導(dǎo)致NIPT檢測失敗的病例展開研究，在我們兩次采血NIPT檢測失敗病例管理方案中，常規(guī)提供侵入性產(chǎn)前診斷，但如本研究所示，在臨床實(shí)踐中，只有少數(shù)孕婦33.33%（13／39）接受了這一方案，13例均未檢出胎兒染色體異常。孕中晚期超聲發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)育異常9例（23.08%），胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩6例（15.38%），羊水量異常2例（5.13%），胎兒雙側(cè)腦室增寬1例（2.56%），沒有檢出結(jié)構(gòu)畸形病例，所有病例均接受了產(chǎn)前診斷但未檢出胎兒染色體異常。表明檢測失敗病例孕期超聲出現(xiàn)胎兒發(fā)育異常孕婦更容易接受侵入產(chǎn)前診斷，孤立的超聲軟指標(biāo)異常的胎兒與遺傳異常的發(fā)生率沒有增加。

在我國2016年發(fā)布的NIPT技術(shù)規(guī)范中雙胎人群屬于慎用人群，表明在給予詳細(xì)的遺傳咨詢后可以進(jìn)行NIPT檢測，但是當(dāng)時(shí)NIPT對于雙胎檢測效能和失敗概率還缺乏大數(shù)據(jù)文章報(bào)道。近年來雙胎NIPT檢測研究越來越多，證實(shí)雙胎檢測效能與單胎基本相近，但是檢測失敗率較單胎高［13］。本研究中檢測失敗樣本中涉及雙胎病例有16例（41.03%），其中包括孕早期雙胎／三胎之一停育／減胎7例（17.95%）（表3），雙胎妊娠兩個(gè)胎兒性別不一致9例（23.08%）。與Darine報(bào)道一致［14］，該研究也提出雙胎性別不一致增加檢測失敗風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及本研究結(jié)果標(biāo)明雙胎人群是NIPT檢測失敗的“高?！比巳海R床醫(yī)師在檢測前咨詢過程中也應(yīng)注意告知相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)7例孕早期雙胎／三胎之一停育／減胎病例，NIPT檢測結(jié)果提示為男性胎兒，但Y染色體Z值均小于15（表3），妊娠結(jié)局隨訪均為女性胎兒?？赡茉?yàn)樵性缙谕Ｓ瘻p胎胎兒為男胎，存活胎兒為女胎，停止發(fā)育男性胎兒持續(xù)釋放較低濃度Y染色體到母血，導(dǎo)致NIPT檢測結(jié)果為男性胎兒，與最終分娩胎兒性別不一致。Jacintha報(bào)道也提出了類似論點(diǎn)［15］，因此對于孕早期雙胎／多胎之一停育／減胎病例，在進(jìn)行NIPT檢測前應(yīng)告知相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，增加檢測失敗概率。另外，本研究中通過輔助生殖技術(shù)受孕的病例19例，占比48.72%，以往有研究報(bào)道輔助生殖技術(shù)受孕孕婦外周血cffDNA濃度較自然受孕情況低［16］，但仍需要更大樣本數(shù)據(jù)來證明。

眾所周知，孕婦外周血cffDNA主要來源于凋亡的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)過胎盤屏障時(shí)受母體免疫攻擊破裂的胎兒細(xì)胞或胎盤細(xì)胞凋亡進(jìn)入母血后自然降解成DNA片段。一些妊娠期的母體及胎兒并發(fā)癥均可能影響cffDNA濃度，已經(jīng)證實(shí)某些并發(fā)癥可以使cffDNA濃度升高，比如子癇前期、胎兒生長受限、早產(chǎn)、前置胎盤和妊娠劇吐等。本研究中，有25.64%（10／39）病例發(fā)生了早產(chǎn)，但是其中7例是雙胎妊娠，不排除是雙胎妊娠本身原因引起的早產(chǎn)。根據(jù)體重與cffDNA濃度的負(fù)相關(guān)性推測臨床上常伴有肥胖的疾病如激素治療的自身免疫性疾病和糖尿病也可能會(huì)導(dǎo)致cffDNA濃度降低，使NIPT失敗的發(fā)生率增加。本研究有20.51%（8／39）孕晚期出現(xiàn)妊娠期糖尿病和5.13%（2／39）出現(xiàn)了妊娠期高血壓等并發(fā)癥。但是妊娠期糖尿病和高血壓是否與cffDNA濃度相關(guān)聯(lián)，目前的研究結(jié)果尚未證實(shí)這一觀點(diǎn)。Maeve等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并妊娠孕婦的cff DNA濃度與正常孕婦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［17］。Mary等報(bào)道，cffDNA濃度低可能有更高的不良產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)，臨床醫(yī)生應(yīng)該意識到妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加［18］。因此，對于因cffDNA濃度低NIPT檢測失敗孕婦，在給予詳細(xì)的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷同時(shí)應(yīng)建議定期超聲監(jiān)測胎兒生長發(fā)育及監(jiān)測母體并發(fā)癥，避免發(fā)生不良妊娠結(jié)局。

本研究局限性，首先雖然納入總樣本量68581例病例，但是經(jīng)兩次采血均因濃度低標(biāo)本只有39例（0.057%），可能不夠全面，未檢出遺傳異常病例。其次對于檢測失敗病例孕期用藥情況收集不足，只收集到1個(gè)病例孕婦早期使用肝素。Joshua等報(bào)道證實(shí)了母體孕期使用肝素和低劑量阿司匹林增加與cffDNA濃度低風(fēng)險(xiǎn)［19］。但是Yohann報(bào)道孕期使用肝素與cffDNA濃度低沒有明顯相關(guān)性［20］。

總之，對于NIPT檢測失敗的病例，應(yīng)明確原因，孕期出現(xiàn)母體并發(fā)癥和不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加，應(yīng)建議接受進(jìn)一步的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和定期超聲監(jiān)測胎兒生長發(fā)育和母體并發(fā)癥。