魏立翔,袁 婷,高之煜,曹鑫艷,張彥兵,2*,孫延鳴*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子 832003;2.新疆泰昆集團(tuán)股份有限公司,新疆昌吉 831203)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)是引起小反芻動(dòng)物呼吸道疾病的重要病原體,可導(dǎo)致綿羊和山羊的傳染性肺炎[1]。Mo對(duì)不同年齡品種的羊都有致病性,患畜會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性消瘦和間質(zhì)增生性肺炎等癥狀[2-3]。此外,Mo感染羊體后,可繼發(fā)溶血性曼氏桿菌、D型流感病毒等感染,最終導(dǎo)致患畜死亡,其中羔羊感染率和病死率最高,給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4-5]?？刂芃o感染主要通過(guò)抗菌治療, Mo沒有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),對(duì)靶向細(xì)胞壁的抗微生物藥物,如β-內(nèi)酰胺類、糖肽類具有天然耐藥性,而土霉素、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物只能夠減輕患畜的臨床癥狀,不能根除Mo感染[6]。因此,需要研發(fā)針對(duì)Mo感染的高效疫苗和治療藥物,然而開發(fā)藥物和疫苗必須完成臨床免疫評(píng)估及藥物療效試驗(yàn),所以建立該病的人工發(fā)病模型是迫切需要解決的問(wèn)題。

建立Mo人工感染模型需要毒力合適的Mo菌株。Besser T E等人使用不同毒力的Mo對(duì)盤羊進(jìn)行攻毒,感染較弱毒力Mo的盤羊肺臟出現(xiàn)輕微的病理?yè)p傷,無(wú)顯著的呼吸道疾病癥狀[7],感染強(qiáng)毒力Mo的盤羊肺臟出現(xiàn)顯著的病理變化,甚至發(fā)生死亡[8]。Mo菌株之間存在高度表型和基因型異質(zhì)性,菌株的致病性也有強(qiáng)弱差異[1]。Mo致病性的強(qiáng)弱表現(xiàn)為對(duì)羊呼吸道上皮細(xì)胞黏附力高低[9],黏附是支原體感染的關(guān)鍵步驟,通過(guò)突變失去黏附能力的支原體不再具有致病性[10]。間接免疫熒光技術(shù)(indirect immunofluorescence assay,IFA)的原理是將處理好的樣品與特異性一抗結(jié)合,然后用被熒光標(biāo)記后的二抗和一抗反應(yīng),在熒光顯微鏡下觀察熒光,來(lái)檢測(cè)樣品抗原。該技術(shù)因?yàn)榕c臨床癥狀相關(guān)性好,常用于病原體致病機(jī)制的研究[11]。SPF雞胚常被用于細(xì)菌和病毒毒力檢測(cè),袁婷將不同毒力的Mo菌株接種雞胚后,雞胚致死率不相同[12]。

因此,本試驗(yàn)將6株Mo與山羊氣管上皮細(xì)胞(goat tracheal epithelial cell,GTEC)共孵育,通過(guò)IFA檢測(cè)黏附力強(qiáng)弱,進(jìn)一步將Mo接種雞胚,檢測(cè)和觀察雞胚致死率和病理變化,綜合篩選出致病性強(qiáng)的菌株,為Mo人工感染模型建立和疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 Mo分離株XJ15、XJ13、XJ22、1412、XJN均由本實(shí)驗(yàn)室保存;標(biāo)準(zhǔn)株Y98、Mo高免兔血清,山羊氣管上皮細(xì)胞,由蘭州獸醫(yī)研究所儲(chǔ)岳峰研究員惠贈(zèng);SPF雞胚,購(gòu)自新疆恒朝生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG,購(gòu)自Abcam公司;馬血清,胎牛血清,胰酶,RPMI1640培養(yǎng)基,購(gòu)自Gibco公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器 Micro21低溫高速離心機(jī),ABI-2720 PCR擴(kuò)增儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品;Alpha紫外凝膠成像儀,美國(guó)ProteinSimple公司產(chǎn)品;Leica DMI6000B倒置熒光顯微鏡,德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品;PowerPac基礎(chǔ)型核酸電泳儀,美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱,Thermo Fisher生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Mo和GTEC培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)室凍存的Mo菌株按1∶10比例接種入含200 ml/L馬血清的Thiaucourt's培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d,待培養(yǎng)基顏色變黃,傳代3次同時(shí)測(cè)定CCU,4 ℃保存。GTEC用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶時(shí),使用胰酶消化、洗滌,按1.5×105～3.5×105接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.2.2 Mo黏附細(xì)胞 Mo菌液以12 000 r/min離心15 min,收集沉淀并用PBS洗滌2次,用含4%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸沉淀并調(diào)整菌液濃度為108CCU/mL,備用。24孔板內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的GTEC用PBS洗1次,接種重懸的Mo菌液,37 ℃、5% CO2黏附2 h。37 ℃預(yù)熱PBS洗滌未黏附的Mo,4%多聚甲醛室溫固定30 min。

1.2.3 間接免疫熒光檢測(cè) 多聚甲醛固定后的24孔板用4℃PBS洗滌3次,每次5 min;10%脫脂奶粉(250 μL/孔)37 ℃封閉30 min;PBS洗滌3次,每次5 min;加入Mo高免兔血清,37 ℃、5% CO2孵育1.5 h ;PBS洗滌3次,每次5 min;加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG,37 ℃、5% CO2避光孵育1 h;棄二抗,4 ℃PBS洗滌3次,每次5 min。其中一抗、二抗工作濃度參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行稀釋。用倒置熒光顯微鏡觀察黏附情況。

1.2.4 Mo和雞胚培養(yǎng) Mo菌株培養(yǎng)方法與1.2.1一致,培養(yǎng)好的Mo菌液用0.85%生理鹽水離心洗滌,并調(diào)整菌液濃度為109CCU/mL,備用。將SPF雞胚氣室向上置于37 ℃孵化箱,培養(yǎng)7日,每日定時(shí)翻蛋,照蛋檢測(cè)雞胚生長(zhǎng)情況,篩去死胚,生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雞胚用做接種。

1.2.5 Mo雞胚接種 將6株Mo通過(guò)卵黃囊注射方式接種于雞胚,0.2 mL/只(109CCU/mL),其中Mo的接種劑量和濃度參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行調(diào)整,每株Mo接種10只雞胚,并設(shè)空白對(duì)照組和生理鹽水注射組,接種后雞胚繼續(xù)培養(yǎng)至21日齡,每日照蛋檢查雞胚生長(zhǎng)情況,并剖檢死亡雞胚觀察病理變化,取死亡雞胚尿囊液,記錄感染組雞胚死亡率。

1.2.6 尿囊液Mo檢測(cè) 無(wú)菌取死亡雞胚尿囊液,與0.85%生理鹽水等體積混合,2 000 r/min離心10 min,取上清按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。根據(jù)Mo16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物,上游引物:5′-TGGCAAAAGTCACTAGCACAG-3′,下游引物:5′-ACCTAACATCTCACGACACGA-3′,產(chǎn)物大小258 bp。反應(yīng)體系為20 μL:2×ESTaqmix 10 μL,DNA 2 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 7 μL;反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 40 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher's精確檢驗(yàn),以P<0.05 表示差異顯著; 雞胚死亡率=死亡雞胚數(shù)/各感染組雞胚數(shù),使用GraphPad Prism 8.0繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 不同Mo對(duì)GTEC的黏附

不同Mo黏附GTEC結(jié)果見圖1,陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)熒光,其余Mo黏附GTEC有明顯的熒光,說(shuō)明6株Mo均能黏附GTEC,其中XJ15的黏附力高于其他Mo分離株。

A.XJ15;B.XJ13;C.XJ22;D.Y98;E.1412;F.XJN;G.陰性對(duì)照;H.空白對(duì)照A.XJ15;B.XJ13;C.XJ22;D.Y98;E.1412;F.XJN;G.Negative control;H.Blank control圖1 不同Mo對(duì)GTEC的黏附作用Fig.1 The adhesion of different Mo to GTEC

2.2 不同Mo對(duì)雞胚的感染

死亡雞胚剖檢結(jié)果表明,生理鹽水和空白對(duì)照雞胚胚體粉嫩,無(wú)明顯變化。Mo感染組雞胚胚體呈血紅色,有典型的充血和出血現(xiàn)象。其中XJ15、XJ13、XJ22組胚體充血情況嚴(yán)重,1412、XJN組胚體各處有出血點(diǎn),充血情況較輕。

2.3 不同Mo感染組雞胚卵黃囊液和死亡率以及死亡數(shù)比較

取各感染組卵黃囊液進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果均為陽(yáng)性。各組死亡率不同,其中死亡率高的是XJ15組, 1412和XJN組死亡率較低。各感染組雞胚死亡數(shù)差異顯著(P<0.05),其中XJ15組雞胚死亡數(shù)與XJ22組差異不顯著,但顯著高于其他Mo感染組死亡雞胚數(shù)(表1)。

表1 雞胚感染試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of chicken embryo infection test

2.4 不同Mo感染組生存曲線

各個(gè)Mo感染組雞胚生存曲線結(jié)果表明,Mo感染雞胚后,雞胚死亡發(fā)生在1周內(nèi),雞胚感染Mo 8天后不再出現(xiàn)死亡,6組Mo感染組中, XJ15株感染組存活率最低,1412、XJN株感染組存活率最高。

2.5 尿囊液Mo檢測(cè)

將死亡雞胚尿囊液短暫離心取上清,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取Mo DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明,尿囊液樣品均為陽(yáng)性,在258 bp處出現(xiàn)特異性條帶,與預(yù)期大小一致(圖2、3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照;2.陽(yáng)性對(duì)照;3～11.XJ15組尿囊液樣品;12～17.XJ22組尿囊液樣品M.DNA marker DL 2 000;1.Negative control;2.Positive control;3-11.Allantoic fluid samples of XJ15 group;12-17.Allantoic fluid samples of XJ22 group圖2 雞胚尿囊液PCR結(jié)果Fig.2 PCR result of allantoic fluid

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照;2.陽(yáng)性對(duì)照;3～5.XJ13組尿囊液樣品;6～9.Y98組尿囊液樣品;10～13.1412、XJN組尿囊液樣品M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.Positive control;3-5.Allantoic fluid samples of XJ13 group;6-9.Allantoic fluid samples of Y98 group;10-13.Allantoic fluid samples of 1412,XJN group圖3 雞胚尿囊液PCR結(jié)果Fig.3 PCR result of allantoic fluid

3 討論

支原體是最小、能夠自我復(fù)制的細(xì)菌細(xì)胞,其通過(guò)黏附到上皮細(xì)胞纖毛而定植呼吸道上皮,引起宿主病理?yè)p傷[14]。同樣的,Mo常定植于暴露在污染空氣的綿羊呼吸道上皮細(xì)胞中,是引起綿羊原發(fā)性非典型肺炎的主要病原體[15-16]。Mo黏附并定植羊氣管上皮細(xì)胞后,可通過(guò)細(xì)胞外凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶介導(dǎo)的線粒體途徑引起宿主細(xì)胞的凋亡和氧化損傷[17]。與Mo黏附性相關(guān)的表面莢膜多糖,也被證明能夠引起羊體Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)[18]。因此,Mo黏附能力可能是其致病性的主要因素。

蔡亞婷[19]利用IFA技術(shù),證明了人工感染山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)后獲得的山羊血清能阻斷Mccp黏附GTEC。李明霞等[20]為研究不同毒力牛支原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附差異,建立了相應(yīng)的IFA。Mo不僅感染山羊,還可以感染綿羊,本試驗(yàn)通過(guò)IFA,以6株Mo和GETC為對(duì)象,篩選黏附力強(qiáng)的Mo,結(jié)果表明6株支原體均能黏附GETC,但黏附力有強(qiáng)弱差異,其中XJ15株黏附力最好。車巧林利用IFA技術(shù),發(fā)現(xiàn)不同毒力豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)均能黏附宿主細(xì)胞,這一結(jié)果和本研究一致[21]。Mo作為致病性病原體,不易感染小鼠和雛雞[22],直接使用試驗(yàn)羊進(jìn)行Mo毒力篩選,不僅財(cái)力耗費(fèi)高,實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng) ,而且Mo感染效果可能不明顯[23]。雞胚是支原體常見的人工感染對(duì)象,范媛用6株不同牛支原體分離株感染雞胚,篩選了毒力較強(qiáng)的牛支原體[24]。隋兆峰等通過(guò)對(duì)SPF雞胚人工感染雞毒支原體,比較了不同雞毒支原體的致病力強(qiáng)弱[25]。袁婷將3株Mo接種雞胚,從接種方式、接種劑量、接種濃度進(jìn)行了篩選,成功構(gòu)建了Mo人工感染SPF雞胚模型[12]。本研究采用Mo人工感染SPF雞胚來(lái)對(duì)6株Mo進(jìn)行致病力篩選,對(duì)各個(gè)Mo感染組的卵黃囊液進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果均為陽(yáng)性,這說(shuō)明成功將Mo接種到SPF雞胚的卵黃囊中,人工感染完成。有研究表明,雞胚的尿囊膜可儲(chǔ)存代謝產(chǎn)物,孵化過(guò)程中排出的代謝產(chǎn)物積聚在尿囊液中[26]。對(duì)死亡雞胚的尿囊液進(jìn)行Mo PCR檢測(cè),均有特異性條帶,這表明Mo在雞胚中發(fā)生了增殖。雞胚的死亡發(fā)生在接種Mo后一周內(nèi),隨著雞胚日齡增加,死亡數(shù)減少,可能是因?yàn)殡u胚的胚體逐漸發(fā)育完整,對(duì)Mo的抵抗力增加。吳翠蘭用不同牛支原體分離株感染雞胚,發(fā)現(xiàn)感染后死亡雞胚胚體有充血和出血,且不同分離株之間雞胚致死率不同[27]。本研究雞胚致死率最高的是XJ15株,致死率最低的是1412和XJN株,國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Y98致死率為40%,可能是因?yàn)镸o經(jīng)過(guò)了實(shí)驗(yàn)室的多次傳代,毒力發(fā)生了減弱,這也是Rohana P D等[4]未能重復(fù)誘導(dǎo)持續(xù)的Mo發(fā)病的原因。接種Mo的死亡雞胚胚體表面有出血和充血現(xiàn)象,這一結(jié)果與前人的結(jié)果一致。雖然Mo對(duì)宿主細(xì)胞的黏附力和感染組雞胚致死率的高低,在一定程度上反應(yīng)Mo本身毒力的大小,但決定Mo致病力的因素還有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)IFA和實(shí)驗(yàn)室人工感染雞胚實(shí)驗(yàn),初步篩選出一株毒力較強(qiáng)的Mo分離株,為后期疾病預(yù)防疫苗和治療藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。