李 志,孟 茹,王淑琴,馬怡雋,沈秀英,郭志宏,朵 紅*

(1.青海大學/省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室/青海省動物疫病病原診斷與綠色防控技術研究重點實驗室/青海省畜牧獸醫(yī)科學院,青海西寧 810016;2．西寧市動物疫病預防控制中心,青海西寧 810003)

牛的環(huán)形泰勒蟲病是由璃眼蜱的蜱傳播的環(huán)形泰勒蟲寄生于牛的單核巨噬系統細胞和紅細胞而引起的血液原蟲病[1]。該病主要在熱帶和亞熱帶國家發(fā)生和流行,每年造成110多萬頭牛死亡,損失達數億美元[2]。在亞洲、非洲和南歐,大量的牛受到媒介蜱的感染;同時全球變暖造成媒介蜱分布范圍擴大;再加上新發(fā)泰勒蟲病原的生物學特性和經濟重要性并未闡明,從而使該病的發(fā)生與流行愈加嚴重[3-5]。盡管抗泰勒蟲藥物-布帕伐醌和細胞弱毒疫苗在預防和控制該病過程中發(fā)揮了重要作用,但是目前已出現布帕伐醌抗性蟲株,并且該疫苗需要冷鏈運輸,同時疫苗免疫后宿主均為帶蟲狀態(tài)[6]。因此,亟需對蟲體分泌關鍵分子進行深入、系統研究,以期獲得潛在藥物靶點或者疫苗候選分子。

與其他頂復門寄生蟲一樣,環(huán)形泰勒蟲也進化出了復雜的策略,重塑其在宿主細胞中的生態(tài)位,從而實現增殖和生存。然而,這種由媒介蜱傳播的原蟲是目前發(fā)現的唯一一類可誘導哺乳動物細胞發(fā)生永生化的真核生物,因此又被稱為轉化型泰勒蟲。此類泰勒蟲還包括小泰勒蟲(T.parva)和萊氏泰勒蟲(T.lestoquardi)。目前研究最多的是環(huán)形泰勒蟲和小泰勒蟲,前者可轉化牛的巨噬細胞、B淋巴細胞和樹突狀細胞,而小泰勒蟲能使宿主的T和 B淋巴發(fā)生永生化。盡管小泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲都可使牛的B淋巴細胞發(fā)生永生化,但是這兩種蟲體轉化B細胞的機制是否一致仍有待探究。更重要的是,泰勒蟲裂殖體轉化的細胞具有癌細胞的某些細胞表型,如無限增殖、能量代謝失調、入侵和轉移激活以及免疫逃逸[1]。在蟲體感染宿主后可將裂殖體轉化的細胞分離出來,進而建立體外培養(yǎng)細胞系。因此,體外永生化細胞系極利于在細胞水平和分子水平對蟲體與宿主細胞的相互作用進行研究。同時,在體外用布帕伐醌處理泰勒蟲轉化的細胞后,伴隨寄生蟲的清除,宿主細胞轉化特性隨之消失,細胞停止增殖,恢復至正常的程序性凋亡,說明泰勒蟲誘導的細胞轉化具有可逆性特征[2],這為研究胞內寄生蟲與宿主細胞的相互作用提供了強有力的模型。Witschi M等通過蛋白質組學技術鑒定了環(huán)形泰勒蟲轉化巨噬細胞后蟲體蛋白組成,并對確定的蟲體蛋白進行了分類和功能預測,為泰勒蟲-宿主細胞的互作關系和細胞永生化研究提供了重要數據基礎。之前的研究主要集中在泰勒蟲劫持宿主細胞信號通路方面,尤其是細胞轉化相關信號,如c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和宿主核因子c-Myc、核轉錄因子-κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)和激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)等[7-8]。在本研究中,我們聚焦于已知的環(huán)形泰勒蟲分泌蛋白與宿主細胞間的相互作用;并且這些已研究的分子可能是潛在的藥物靶標,甚至疫苗候選基因,從而為牛泰勒蟲病致病機制研究以及防控方面奠定基礎。

1 環(huán)形泰勒蟲表面蛋白

環(huán)形泰勒蟲表面蛋白(T.annulatasurface protein,TaSP)是一個單拷貝基因,在蟲體子孢子和裂殖體階段均有表達。該蛋白含有3個跨膜區(qū),且C端具有3個高度磷酸化的絲氨酸(S303,S304和S305),并且蟲體轉化細胞S期S303和S305的磷酸化程度遠高于M期[9]。TaSP與宿主細胞的微管蛋白α和γ均發(fā)生相互作用,這表明該分子可能參與微管組裝,從而在調控細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。此外,近期研究發(fā)現,TaSP可與細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)結合;用CDK1抑制劑處理環(huán)形泰勒蟲感染細胞后,可抑制蟲體增殖,說明該蛋白可能參與細胞轉化[10]。除與宿主細胞發(fā)生相互作用外,該基因也是環(huán)形泰勒蟲病的診斷標識和亞單位疫苗候選分子[6]。

2 環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面蛋白p104

環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面蛋白p104(T.annulatamajor schizont surface protein p104,Ta-p104)主要定位于環(huán)形泰勒蟲的微線體。該分子結構高度無序,富含脯氨酸,含有SxIP、SH3基序以及泰勒蟲感染的高頻率結構域(domain of frequently associated inTheileriainfection,FAINT)。Woods K等[11]證明,Ta-p104將宿主末端結合蛋白1(end binding protein 1,EB1),蛋白招募至裂殖體表面,使其磷酸化進而調控微管動態(tài);也發(fā)現宿主CLIP-170相關蛋白1(CLIP-170-associating protein 1,CLASP1)[12]、CD2相關蛋白(CD2 associated protein,CD2AP)[13]也與Ta-p104發(fā)生相互作用。盡管已發(fā)現,蟲體分子Ta-p104、TaSP與宿主細胞微管具有緊密的關聯,但是仍有許多問題有待解釋,如在蟲體感染的細胞中細胞分裂如何調控?盡管蟲體增殖與宿主細胞分裂周期同步[32],但是宿主細胞有絲分裂過程中是否驅動蟲體DNA的合成?在泰勒蟲轉化宿主細胞過程中可引起JNK信號通路持續(xù)激活,其中Ta-p104招募JNK2至裂殖體表面,形成復合體,抑制JNK2的功能,進而促進蟲體增殖[14]。但是,該分子是否操控其他宿主細胞信號,進而維持細胞永生化狀態(tài)尚不清楚。

3 環(huán)形泰勒蟲脯氨酰異構酶1

環(huán)形泰勒蟲脯氨酰異構酶1(T.annulataprolyl isomerase 1,TaPin1)是一個高度保守的分子,該蛋白具有肽基脯氨酸順反異構酶結構域,分布于宿主細胞的胞漿和細胞核中;研究發(fā)現,TaPin1分子主要調控宿主細胞轉錄因子c-Jun和缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF1α),進而引起細胞轉化:1)TaPin1通過劫持含F-box/WT重復域蛋白7(F-box/WD repeat-containing protein 7,FBW7)泛素連接酶,激活c-Jun轉錄因子,調控onco-miR-155表達,促進宿主細胞增殖[7,15];2)TaPin1通過穩(wěn)定M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isoform M2,PKM2),激活HIF1α因子,促使葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)和己糖激酶(Hexokinase 2,HK2)表達,從而影響宿主細胞表型[2,16-17]。但是,TaPin1穩(wěn)定宿主PKM2蛋白以及降解FBW7的分子機制尚不清楚。

4 環(huán)形泰勒蟲富含脯氨酸的微管和SH域互作蛋白

環(huán)形泰勒蟲富含脯氨酸的微管和SH域互作蛋白(T.annulataproline rich microtubule and SH-domain interaction protein,TaMISHIP)只在轉化型泰勒蟲中表達,含有一個信號肽序列和蛋白裂解位點,以及兩個核定位信號序列和一個核輸出信號序列[3,18]。在蟲體子孢子階段,TaMISHIP與p104部分共定位;在裂殖體階段,TaMISHIP分子以點狀形式表達,且與p104分布緊密相連[12]。Pull Down實驗證明TaMISHIP與宿主CD2AP、CLASP1結合,同時免疫沉淀方法證實該分子與宿主EB1也存在較弱的相互作用[3,13,18]。因此,蟲體與宿主細胞互作的復合物(EB1/CLASP1/p104/TaMISHIP/CD2AP)可能會通過其他方式招募宿主細胞分子至裂殖體表面,進而調控宿主細胞功能。

5 環(huán)形泰勒蟲GPI錨定裂殖體蛋白34

環(huán)形泰勒蟲GPI錨定裂殖體蛋白34 (T.annulataGPI anchored schizont protein34,Tagp34)是泰勒蟲所獨有的分子,因其蛋白分子質量為34 ku而得名。該分子是一個GPI錨定蛋白,以點狀形式分布于小泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面。和TaMISHIP一樣,gp34在蟲體感染和未感染細胞中都可轉移至細胞核,誘導細胞雙核化[18]。而在COS7細胞中,過表達gp34時,發(fā)現該蛋白定位于細胞中體和中央紡錘體,說明其可與微管發(fā)生結合[3]。有數據證明,gp34是微管調節(jié)器復合體CLASP1和EB1的組分,表明這兩種蛋白可能在宿主細胞分裂過程中發(fā)揮作用。Huber S等[13]證明,gp34與宿主細胞CD2AP發(fā)生相互作用,進而影響蟲體入侵。弓形蟲可重新排列宿主的微管網絡,以促進細胞內細胞器的重新排列,以利于蟲體生存[18]。雖然此結論尚未在泰勒蟲感染的細胞中得到證實,但是某些蟲體分子有可能對宿主細胞器,例如內質網、高爾基體、線粒體或內溶酶體囊泡進行招募,進而實現其增殖。

6 環(huán)形泰勒蟲分泌蛋白

環(huán)形泰勒蟲分泌蛋白(T.annulatasecretory protein,TaSE)在轉化型泰勒蟲都有表達,是一個保守的單拷貝基因。該基因只在裂殖體和梨形蟲階段表達,而在子孢子階段并不表達。而在裂殖體階段,該蛋白在裂殖體內外層均有分布,并且在裂殖體表面表達[3]。TaSE可與宿主微管蛋白α-tubulin發(fā)生結合,因此TaSE可能在寄生蟲和宿主細胞中都發(fā)揮著作用。

7 環(huán)形泰勒蟲半胱氨酸蛋白酶

在頂復門寄生蟲中,半胱氨酸蛋白酶是一個蛋白酶家族,分為9個亞類,可能在寄生蟲毒力、宿主入侵、營養(yǎng)和宿主免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用。在環(huán)形泰勒蟲中,其半胱氨酸蛋白酶(T.annulatacysteine proteinase,TaCP)被歸類為C1家族,C1A亞家族,并且在其催化中心無半胱氨酸殘基。Zhao S等[19]通過酵母雙雜交技術發(fā)現,TaCP可與宿主B細胞腦膜轉錄因X2 (cereblon transcript variant X2,CRBN)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶4C(protein serine/threonine protein phosphatase 4,PPP4C)都發(fā)生相互作用,并表明TaCP可能參與調控宿主信號通路,但其具體機制尚不清楚。同時,該蛋白是否與宿主細胞其他分子發(fā)生結合仍有待解析。

8 環(huán)形泰勒蟲環(huán)孢素蛋白1

與TaPin1一樣,該蛋白是泰勒蟲基因組中的另一個脯氨酸異構酶,只存在于轉化型泰勒蟲。該蛋白含有228個氨基酸,在其 N端含有一個信號肽序列和一個異構酶結構域。免疫熒光實驗發(fā)現,該蛋白主要分布于環(huán)形泰勒蟲裂殖體周圍[20],表明其可與宿主細胞發(fā)生互作。酵母雙雜交和Pull Down 技術證實,環(huán)形泰勒蟲環(huán)孢素蛋白1(T.annulatacyclophilin1,TaCyp1)與宿主RNA聚合酶II亞單位21中介體(mediator of RNA polymerase II transcription subunit 21,MED21)蛋白發(fā)生直接相互作用,并且在蟲體感染細胞中,通過SiRNA干擾宿主分子后,宿主細胞中NF-κB1/κB2 轉錄水平顯著下降,而P105和P52基因水平并未發(fā)生變化[20],說明其他分子可能參與MED21的調控。但是TaCyp1分子在宿主細胞永生化過程中的分子基礎仍是未知的。

9 環(huán)形泰勒蟲亞端粒編碼的可變蛋白多基因家族

小泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲基因組含有四條染色體,其中小泰勒蟲基因組大小為8.3 mb,而環(huán)形泰勒蟲基因組大小為8.5 mb;并且,在這兩個轉化型泰勒蟲存在一個多基因家族,即環(huán)形泰勒蟲亞端粒編碼的可變蛋白多基因家族(T.annulatasubtelomere-encoded variable secreted proteins multigene family,TaSVSP-family)家族,此家族是泰勒蟲基因組中最大的基因家族。在小泰勒蟲中,該家族含有85個基因;而在環(huán)形泰勒蟲中SVSP家族具有51個成員,重要的是,該家族基因具有進化中立、非典型密碼子使用、核酸序列高度缺失和插入的特征,這就意味著SVSP分子間結構具有較大差異,可能參與不同的生物學過程。同時,先前研究發(fā)現,該基因家族大部分基因含有信號肽序列、PEST基序以及FAINT結構域,并且主要在蟲體裂殖體階段表達,這表明其可能在宿主細胞永生化過程中扮演重要角色。在U2OS細胞中,轉染小泰勒蟲SVSP基因(TP03-0882)后,發(fā)現其分布于細胞核,但在蟲體感染細胞中,并未檢測到該分子,說明該分子可能存在某種體內降解機制。關于該家族基因是否與宿主細胞發(fā)生互作及其作用機制研究很少,目前我們在環(huán)形泰勒蟲中發(fā)現,SVSP449、SVSP454和SVSP455分子主要表達于蟲體裂殖體階段,并且在環(huán)形泰勒蟲感染細胞的細胞核和胞漿中都有分布[21],說明上述分子可能與宿主細胞蛋白結合,從而執(zhí)行其生物學功能。我們研究發(fā)現,蟲體分子SVSP449與宿主細胞X-鏈接2-樣RNA結合基序(RBMX2-Like:RNA binding motif protein-X-linked 2-like,RBMX2-Like)蛋白發(fā)生互作[22];SVSP454蛋白與宿主分子卷曲螺旋域181(coiled-coil domain 181,CCDC181)和線粒體核糖體蛋白L30(mitochondrial ribosomal protein L30,MRPL30)均具有相互作用[23];同時,也證明SVSP455與宿主細胞熱休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)發(fā)生相互作用,進而調控線粒體信號通路,有助于蟲體生存[24]。雖對蟲體幾個SVSP蛋白與宿主細胞互作進行了探究,但是這些分子在泰勒蟲誘導宿主細胞轉化中的分子機制并不清楚。

10 環(huán)形泰勒蟲裂殖體AT-hook蛋白家族

環(huán)形泰勒蟲裂殖體AT-hook蛋白家族(T.annulata schizont AT-hook protein family,TashAT-family)含有17個基因,并且預測發(fā)現很多TashAT蛋白含有信號肽序列、DNA結合基序、核定位信號和FAINT結構域。蟲體分泌的一些TashAT蛋白定位于宿主細胞核中,并且發(fā)現TashAT2蛋白可調控宿主細胞干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)表達。在環(huán)形泰勒蟲中,TashAT的DNA結合域序列具有高度的一致性。然而,在小泰勒蟲中并未發(fā)現DNA結合域同系物。那么在這兩種蟲體中這些蛋白是否與宿主細胞結合?在功能上是否存在差異?以及這些結構域在宿主細胞表型中扮演怎樣角色?這些問題仍有待深入研究。

11 展望

在泰勒蟲與宿主細胞互作研究中,一直存在著一個令人著迷的問題:哪些寄生蟲分子(蛋白、脂質、RNA、其他因子)直接參與,或者對宿主細胞癌樣化表型是必需的?盡管目前已解析了某些蟲體分子可通過劫持宿主細胞信號進而維持永生化狀態(tài),但是這只是蟲體功能蛋白的冰山一角。同時,截至目前環(huán)形泰勒蟲中仍有近一半基因功能是未知的。因此,需結合先進的生物學方法,如液相色譜-質譜、高通量功能基因篩選技術以及生物物理學方法,同時,結合生物信息學技術,如AlphaFold2等對環(huán)形泰勒蟲編碼蛋白進行深入分析與研究。更重要的是,建立環(huán)形泰勒蟲的Crispr-Cas基因編輯系統可為病原基因功能研究提供強有力的技術工具,可精確解析蟲體關鍵分子在病原-宿主互作以及致病機制中的分子基礎,同時為疫苗研發(fā)提供關鍵候選分子。