付雷明,張欣達(dá),張 偉,李道穩(wěn),楊琳燕*,李 存*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300392;2.天津市北大港濕地自然保護(hù)區(qū)管理中心,天津 300270)

畜牧業(yè)的快速發(fā)展,獸藥在預(yù)防、治療動物疾病及促進(jìn)生長方面發(fā)揮著越來越重要的作用。獸藥濫用導(dǎo)致的藥物殘留對環(huán)境安全、人類身體健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。因而對獸藥殘留檢測提出了更高的要求,因此建立快速準(zhǔn)確的獸藥殘留檢測方法具有重要意義。色譜法是獸藥殘留分析中常用的方法,但部分獸藥的特性以及基質(zhì)的復(fù)雜性導(dǎo)致難以被分離及檢測。利用化學(xué)衍生化技術(shù)改變殘留物的理化性質(zhì),使之宜于分離檢測,目的通常有如下幾種:①增強(qiáng)待測分析物穩(wěn)定性,利于氣相分析;②提高選擇性,降低雜質(zhì)的干擾;③加快反應(yīng)速度,縮短反應(yīng)時間;④提高檢測靈敏度。本文綜述了國內(nèi)外化學(xué)衍生化技術(shù)在檢測常見獸藥殘留的中的應(yīng)用,在此基礎(chǔ)上對其在獸藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 化學(xué)衍生化技術(shù)

化學(xué)衍生化是將待測分析物與含有特定功能基團(tuán)的衍生化試劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),生成含有特定功能的衍生化產(chǎn)物,通過衍生化產(chǎn)物間接測出待測物含量[1]。在衍生化過程中待測分析物的活性官能團(tuán)被修飾,反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度、極性、沸點(diǎn)等理化性質(zhì)隨之改變,新的理化性質(zhì)可以用來分離或量化。衍生化試劑通常由反應(yīng)基團(tuán)和改性增敏基團(tuán)構(gòu)成。反應(yīng)基團(tuán)與待測物中的特定基團(tuán)發(fā)生化合反應(yīng),而改性增敏基團(tuán)可以優(yōu)化色譜行為、增加信號強(qiáng)度等。

1.1 衍生化試劑

根據(jù)衍生化試劑不同可分為硅烷化、烷基化、?；?、熒光化、紫外化等。硅烷化是利用硅烷基取代羧基、巰基、氨基、亞氨基等基團(tuán)中活性氫原子的化學(xué)反應(yīng),衍生產(chǎn)物為硅烷基醚或硅酯。最常見的試劑是三甲基甲硅烷基。色譜法中硅烷基化主要目的是降低分析物的極性,增加其穩(wěn)定性。例如,壯觀霉素和林可霉素是具有高沸點(diǎn)和強(qiáng)極性的高分子化合物,對其進(jìn)行衍生化降低極性后可通過氣相色譜(gas chromatography,GC)進(jìn)行分析[2-3]。?；苌档蜆O性、提高揮發(fā)性外,還可用于取代分析物中的活性氫,使分析物的分子量升高,以增加電子捕獲檢測器(electron capture detector,ECD)的靈敏度[4]。?；ǔＳ糜趲в蠩CD或質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)檢測的GC以提高響應(yīng)。烷基化衍生使用烷基類基團(tuán)取代分析物中的活性氫。如利用三甲基甲硅烷基重氮甲烷衍生化使青霉素G揮發(fā),以達(dá)到氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)分析條件[5]。

1.2 衍生化技術(shù)的常見類型

1.2.1 柱前衍生化 在色譜之前進(jìn)行衍生化反應(yīng)稱為柱前衍生。柱前衍生法具有試劑消耗量低、反應(yīng)速度快、選擇性和分辨率高等特點(diǎn)。可與多種檢測器聯(lián)用,不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。衍生化反應(yīng)產(chǎn)物中可能會存在未能發(fā)生反應(yīng)的衍生化試劑殘留,但因分析是在通過色譜柱分離后進(jìn)行的,所以對結(jié)果影響甚微[6]。柱前衍生化可選擇衍生化試劑較多,已被廣泛應(yīng)用于多種生物基質(zhì)中的獸藥殘留分析。房艷等[7]采用柱前衍生結(jié)合熒光檢測法測定牛奶中乙酰氨基阿維菌素殘留量,簡化了復(fù)雜的前處理過程,提高了產(chǎn)物回收率及增加了反應(yīng)速率。Rashed N等[8]采用柱前衍生化結(jié)合紫外檢測法用于快速測定蜂蜜中頭孢噻呋,無需提取或預(yù)處理步驟,檢測限(limit of detection,LOD)為3.29 ng/mL,定量限(limit of quantification,LOQ)為10.97 ng/mL。

1.2.2 柱后衍生化 與用于增強(qiáng)目標(biāo)分析物的分離程度或提高檢測靈敏度的柱前衍生法不同,因已經(jīng)發(fā)生分離,柱后衍生避免了與目標(biāo)分析物共洗脫可能產(chǎn)生的干擾,僅用于增強(qiáng)待測物。來自色譜柱的洗脫液與衍生化試劑進(jìn)行混合,將分析物轉(zhuǎn)化為具有不同理化性質(zhì)(紫外-可見吸光、熒光)的物質(zhì),從而提高靈敏度和特異性[9-12]。柱后化學(xué)衍生反應(yīng)在獸藥殘留分析中主要以熒光分析為主。

1.2.3 微波輔助衍生化 在分析物為極性物質(zhì)的情況下,微波所攜帶的能量可以明顯縮短衍生化時間,以達(dá)到快速分析的目的。微波輔助衍生化具有設(shè)備簡單易得、可重復(fù)性高等特點(diǎn)。Xu X等[13]將微波輔助衍生化與分散液萃取技術(shù)相結(jié)合分析牛奶樣品中的氨基糖苷類藥物得到了較高的精密度。微波輔助衍生結(jié)合固相萃取技術(shù)對海產(chǎn)品中的硝基呋喃代謝物做到精確定量分析[14]。該方法因采用微波輔助衍生化技術(shù),使衍生化反應(yīng)在20 min以內(nèi)完成,極大縮短了衍生化時間。

1.2.4 超聲輔助衍生化 超聲輔助衍生化是一種新型綠色方法,近年來有相關(guān)文獻(xiàn)報道該技術(shù)應(yīng)用在有機(jī)、無機(jī)分析等不同領(lǐng)域[15]。超聲輔助衍生化加速不溶兩相之間的物質(zhì)傳遞效率,從而縮短衍生時間以達(dá)到提高衍生效率的目的[16]。該方法具有所需設(shè)備易得、操作簡單、節(jié)省時間等特點(diǎn)。Yu F等[17]使用超聲輔助濁點(diǎn)萃取法 (ultrasonic assisted cloud point extraction,UA-CPE)對蜂蜜樣品中磺胺類藥進(jìn)行分析,縮短了分離時間并且獲得了更高的回收率。Silveira A L 等[18]采用超聲輔助衍生法對牛尿液中的類固醇進(jìn)行分析,顯著縮短了衍生化時間并減少了衍生化試劑的使用。

1.2.5 光化學(xué)衍生化 光化學(xué)衍生化是所有衍生化方法中最環(huán)保、通用、直接的,也是在獸藥殘留分析中最常用的衍生化方法。光化學(xué)衍生的原理是利用待測分析物在特定的條件下吸收紫外光引起其性質(zhì)或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,形成熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。這種方法與紫外-可見分光光度法,電化學(xué),化學(xué)發(fā)光,熒光法等傳統(tǒng)的檢測方法相結(jié)合,提升了選擇性與靈敏度,廣泛應(yīng)用于藥品或食品分析領(lǐng)域[19]。將紫外光化學(xué)衍生化結(jié)合在線柱后衍生可實(shí)現(xiàn)對雞肉和雞蛋中8種磺胺類抗生素的快速分析[20]。利用光化學(xué)衍生也可實(shí)現(xiàn)對動物乳制品中黃曲霉毒素的定量分析[21],與其他方法相比具有更高的靈敏度,避免了使用危險的氯化溶劑,進(jìn)一步降低了檢測成本。

2 衍生化技術(shù)在獸藥殘留分析中的應(yīng)用

色譜技術(shù)是獸藥殘留檢測的基本手段。然而由于獸藥種類繁多,不同類型的獸藥理化性質(zhì)有顯著差異,部分獸藥殘留物不利于使用色譜分離檢測。通過化學(xué)衍生化技術(shù)將其定量轉(zhuǎn)化為易于色譜檢測的化合物,以達(dá)到可被檢測或增加檢測靈敏度的目的。

2.1 青霉素類

青霉素G是一種天然窄譜抗生素,抗菌作用很強(qiáng),用于治療各種敏感病原體所致感染。在家禽養(yǎng)殖業(yè)主要用于控制禽流感和治療家禽卵巢炎。適當(dāng)合理的使用青霉素G可以刺激畜禽生長及提高飼料利用率。青霉素G在養(yǎng)殖行業(yè)中常被部分企業(yè)和個體養(yǎng)殖戶濫用,直接導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品獸藥殘留超標(biāo)。由于青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不包含強(qiáng)生色團(tuán)或發(fā)光團(tuán),因此液相色譜(liquid chromatography,LC)通常結(jié)合質(zhì)譜或紫外檢測器,但較低的波長(接近或低于250 nm)可能會受到來自樣品基質(zhì)的背景信號的干擾,所以很少有使用LC測定青霉素的報道。Castillo M L等[22]采用波長較長的鈰類化合物作為柱后衍生化試劑,降低了來自樣品基質(zhì)背景信號的干擾,實(shí)現(xiàn)了對6種青霉素類抗生素定量分析。因青霉素G的非揮發(fā)性,Liu C[5]在使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)時用重氮甲烷對青霉素進(jìn)行衍生,增加了青霉素G的揮發(fā)性,用于檢測禽蛋中青霉素G的含量, LOD和LOQ分別為1.70～3.20 μg/kg和6.10 ～8.50 μg/kg。

2.2 酰胺醇類

氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素在內(nèi)的酰胺醇類藥物為廣譜抗生素,能夠抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌,曾被廣泛應(yīng)用到畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[23]。但因其可能會抑制骨髓造血機(jī)能,食用動物中禁止使用氯霉素[24]。甲砜霉素會抑制紅細(xì)胞的生成,氟苯尼考具有胚胎毒性[25]。直接使用GC技術(shù)分析氯霉素類化合物非常困難,部分原因是這類分析物會吸附在色譜柱的涂層上。因此,需要對氯霉素類化合物進(jìn)行衍生化以適應(yīng)GC分析。Liu W L等[26]將衍生化試劑直接引入萃取室,以避免基質(zhì)和甲硅烷基化試劑之間的副反應(yīng),大大提高了衍生化效率。Yikilmaz Y等[3]將三甲基甲硅烷基化合物作為衍生化試劑與分析物中的羥基反應(yīng),成功用于鮭鱒魚中的氟苯尼考?xì)埩魷y定。鮭鱒魚中氟苯尼考的LOD和LOQ分別為1.64 μg/kg和4.9 μg/kg。

2.3 磺胺類

磺胺類藥物具有廣譜抑菌活性,在獸醫(yī)臨床領(lǐng)域主要用于防治畜禽的微生物感染、球蟲病等?；前奉惖乃幬餁埩羰且粋€非常重要的問題,因?yàn)檫@類藥物具有致癌性并且易產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)磺胺類藥物在人體內(nèi)蓄積超過一定濃度,會導(dǎo)致肝腎、泌尿系統(tǒng)等損傷,甚至某些磺胺類藥物可能導(dǎo)致癌變。磺胺類藥物沒有發(fā)光團(tuán),將含有發(fā)光基團(tuán)的衍生化試劑與其本身含有的光化學(xué)活性基團(tuán)反應(yīng),產(chǎn)生帶有熒光物質(zhì)衍生產(chǎn)物,從而可用熒光檢測器直接檢測[27]。Zotou A等[28]用熒光胺作為衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生,用于同時測定雞蛋和雞肉中12種磺胺類藥物,在雞肉和雞蛋樣品中LOD分別為2 μg/kg～17 μg/kg和2 μg/kg～15 μg/kg。在牛奶的常規(guī)檢測過程中,大部分樣品不會受到磺胺類藥物的污染。Dmitrienko S G[29]等開發(fā)了一種“是/否”二元響應(yīng)檢測法,該方法基于磺胺與對二甲基氨基肉桂醛形成紫紅色縮合產(chǎn)物的比色反應(yīng),用于磺胺藥物的定量和肉眼半定量篩選。這種方法可以在常規(guī)條件下每天以極低成本檢測大量樣品。王曉茵等[30]將磺胺類藥物與熒光胺進(jìn)行衍生,應(yīng)用于豬肉中11種磺胺類藥物測定,有效降低其他組分的干擾,提高檢測的靈敏度和可靠性。目前磺胺類藥物與熒光胺的衍生化產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定,容易分解,解決這類問題是今后開發(fā)新型衍生化試劑所努力的方向。

2.4 氨基糖苷類

氨基糖苷類是一類廣譜抗生素,用于治療細(xì)菌感染或促進(jìn)生長,在我國畜牧生產(chǎn)行業(yè)廣泛應(yīng)用。由于氨基糖苷的耳毒性和腎毒性,其在食用動物組織殘留可能給人體健康帶來嚴(yán)重的危害。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)是測定氨基糖苷類的主要分析方法。由于氨基糖苷類不包含發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán),通常需要進(jìn)行衍生化。將氨基糖苷類分析物與衍生化試劑反應(yīng)生成帶有紫外或熒光吸收的衍生產(chǎn)物,進(jìn)而進(jìn)行紫外或熒光檢測。房亮等[31]用鄰苯二甲醛與鏈霉素進(jìn)行衍生化反應(yīng),生成具有特定波長紫外吸收的衍生產(chǎn)物,采用紫外-分光法檢測牛奶中殘留的鏈霉素。與傳統(tǒng)高效液相色譜法對比該方法操作簡單、檢測速度更快而且檢測費(fèi)用低。Xu X等[13]采用微波輔助衍生化結(jié)合熒光檢測器用于測定牛奶樣品中的氨基糖苷類藥物,妥布霉素、新霉素、慶大霉素的LOD在0.11～0.50 ng/mL。該方法檢測氨基糖苷類藥殘留與傳統(tǒng)方法相比具有快速、簡單、環(huán)境友好等特點(diǎn)。

2.5 喹諾酮類

喹諾酮類藥物是一類人工合成的廣譜殺菌性抗菌藥物。氟喹諾酮類是第三代喹諾酮類藥物,其具有廣譜、高效、低毒性以及與其它抗菌藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床領(lǐng)域,在維持動物福利方面發(fā)揮著重要作用。但這類藥物的殘留會對人類健康造成一些不良影響,例如過敏性超敏反應(yīng)、毒性作用以及抑制敏感菌群破壞微生物動態(tài)平衡。Yánez-Jácome G S等[9]采用氧化鋱納米粒子作為柱后衍生試劑用于牛奶樣品中七種喹諾酮類藥物殘留的測定。此方法改進(jìn)了樣品前處理流程,僅需簡單的脫蛋白步驟,并且縮短了色譜分離時間。Xia Q等[32]采用二惡唑?qū)ΨZ酮進(jìn)行衍生,改變目標(biāo)分析物的極性提高了檢測靈敏度,提高超聲輔助濁點(diǎn)萃取(ultrasonic assisted cloud point extraction,UACPE)效率。四種氟喹諾酮類藥物的LOD在0.2～0.4 μg/kg。

2.6 頭孢菌素類

頭孢噻呋為第三代動物專用半合成頭孢菌素。具有廣譜抗菌、耐青霉素酶、低毒、臨床療效高等優(yōu)點(diǎn)。廣泛用于治療家禽、奶牛和蜜蜂等呼吸道細(xì)菌感染,在全球范圍內(nèi)用于治療呼吸道疾病。極低劑量下可能引起部分人群發(fā)生過敏反應(yīng),并且可能在人類病原體中產(chǎn)生耐藥菌株[33]。Rashed N等[8]使用1,2萘醌4磺酸鹽與頭孢噻呋中的一個伯氨基反應(yīng)以產(chǎn)生分光光度法可檢測的衍生物,LOD為3.29 ng/mL。El-Rabbat N A等[34]將頭孢吡肟與Hg(I)離子進(jìn)行衍生,提高了選擇性并增加了靈敏度,成功用于分析復(fù)雜基質(zhì)(山羊血漿和牛奶)中的頭孢吡肟。

2.7 阿維菌素類

阿維菌素類藥物是畜牧獸醫(yī)業(yè)中防治寄生蟲的首選藥物,包括伊維菌素、多拉菌素、阿維菌素等。這類藥物的優(yōu)點(diǎn)是有效劑量小,但因其較高的脂溶性,導(dǎo)致體內(nèi)殘留時間長,以被世衛(wèi)組織列為高毒化合物[35]。雖然阿維菌素具有能實(shí)現(xiàn)紫外吸收的共軛二烯結(jié)構(gòu),但受限于紫外檢測的低靈敏度和低選擇性并不能滿足檢測需求[36]。因此對阿維菌素進(jìn)行熒光衍生成了近些年來的主要研究方向。譚梅[37]等對農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中的高效液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化,為了提高了衍生化效率增加冰乙酸和三乙胺兩種衍生試劑。在衍生產(chǎn)物中加入甲醇,使產(chǎn)物更加穩(wěn)定。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中,乙酰氨基阿維菌素是的第一個不需要休藥期的廣譜抗寄生蟲藥。毒理學(xué)試驗(yàn)表明,不能排除其對人類健康的潛在威脅。最新生效的GB 31650-2019對乙酰氨基阿維菌素最高殘留限量做出了規(guī)定。房艷[7]等將?；噭┤宜狒痛呋瘎┑谆溥蚝瓦M(jìn)行混合衍生,得到含有熒光活性的乙酰氨基阿維菌素衍生產(chǎn)物。該方法方便快捷,滿足牛奶中痕量殘留的檢測要求。張玉潔[36]等著重對衍生化反應(yīng)過程中的溫度、時間及光照參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使其在牛、羊奶中的LOQ均為0.5 μg/kg。

2.8 硝基呋喃類

硝基呋喃是一類人工合成廣譜抗菌藥物,曾被廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。這類藥物和其代謝產(chǎn)物有致突變、致畸、致癌等可能,我國規(guī)定動物性食品中不得檢出硝基呋喃。盡管法律禁止,但由于其抗菌活性高且成本低,硝基呋喃仍在使用。硝基呋喃類藥物會在動物體內(nèi)迅速代謝,其代謝物會存在幾周,因此通常檢測其代謝物。盡管現(xiàn)存多種檢測方法,但由于硝基呋喃類代謝物有很高的極性,使得很難從反相色譜柱上分離。而且這些代謝物的分子量低且不含發(fā)色團(tuán),紫外和質(zhì)譜檢測器對其靈敏度較低。Melekhin A O等[38]使用5-硝基-2-糠醛作為衍生劑,結(jié)合液相-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)用于測定蜂蜜中四種硝基呋喃代謝物,LOD為0.1～0.3 μg/kg。Luo X等[14]合成了一種新型衍生化試劑,結(jié)合微波輔助衍生法,對蝦中4種硝基呋喃代謝物同時快速測定,可在7.2 min內(nèi)完成,節(jié)省了大量時間、試劑和材料的消耗。盧義博等[39]針對硝基呋喃類代謝物的膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay,GICA)存在的缺陷,對不同基質(zhì)樣品進(jìn)行水解并衍生化。提高了檢測準(zhǔn)確率,滿足膠體金快速檢測需要。四種硝基呋喃類代謝物的LOD都為0.50 μg/kg。

2.9 β-腎上腺素受體激動劑

鹽酸克侖特羅俗稱瘦肉精,具有增強(qiáng)肌肉和減少脂肪堆積的特性,在畜牧業(yè)中常被非法使用,導(dǎo)致了許多中毒事件。因鹽酸克侖特羅是一種非揮發(fā)極性化合物,不能直接通過GC分析。因此,需要通過衍生化來改變鹽酸克侖特羅的極性和揮發(fā)性。Ye D等[40]采用六甲基二硅氮烷作為衍生化試劑結(jié)合GC-MS分析豬肉中的克侖特羅,極大地縮短了分析時間。萊克多巴胺是一種典型的β腎上腺素能激動劑,喂養(yǎng)動物可以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)重新分配到肌肉中,增加平均日增重,提高飼料效率,增加氮保留并減少上市天數(shù)。在美國和部分國家用作豬、牛和禽類的飼料添加劑。萊克多巴胺的濫用導(dǎo)致藥物殘留,可能對消費(fèi)者健康構(gòu)成威脅。鑒于萊克多巴胺的潛在副作用,中國和歐洲的一些國家已經(jīng)禁止在食品動物中使用萊克多巴胺作為飼料添加劑。Ding G等[41]用4-氯-3,5-二硝基三氟化物對萊克多巴胺進(jìn)行衍生為紫外檢測器提供足夠的靈敏度,LOD和LOQ分別為0.045 μg/kg和0.149 μg/kg。帶有紫外檢測器的HPLC具有穩(wěn)定性高、通用性強(qiáng)及維護(hù)成本低等特點(diǎn),在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中比GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS和UPLC-MS/MS 更有優(yōu)勢。

3 展望

化學(xué)衍生化技術(shù)是提高樣品分離效率和增加分析靈敏度的常用方法,在獸藥殘留分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用?；瘜W(xué)衍生化技術(shù)的缺點(diǎn)就是在樣品制備過程中多了額外的步驟,增加了試劑的種類和時間的消耗,但諸如超聲波輔助、光化學(xué)衍生、微波輔助衍生等新技術(shù)的出現(xiàn),以及穩(wěn)定、專一、活性高的新型衍生化試劑的開發(fā),為減少試驗(yàn)時間及環(huán)境污染等問題提供了新的可能。此外,與昂貴的質(zhì)譜檢測器相比經(jīng)過衍生化后使用紫外、熒光等低成本檢測器也能滿足分析要求,大大降低了殘留檢測成本。未來隨著綠色、高效的新型衍生化試劑和新方法的開發(fā),化學(xué)衍生化技術(shù)將在獸藥殘留分析領(lǐng)域達(dá)到更廣泛的應(yīng)用。