蘇俊賢,張譽,王志朝,羅倩,許志強,李凌瑤,鄭雙雙

(甘肅省慶陽市第二人民醫(yī)院,慶陽 745000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為常見的慢性關(guān)節(jié)炎疾病,主要危害關(guān)節(jié)滑膜引起滑膜炎[1],造成軟骨組織的磨損,嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,喪失全部功能[2]。目前該疾病主要通過抗炎藥物以及抗風(fēng)濕藥物進行治療,治療目的主要在于緩解和減輕關(guān)節(jié)炎癥,保護關(guān)節(jié),抑制病情的發(fā)展,而新的治療方法還有待探索[3-4]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎受多條信號通路的影響,Toll樣受體4(Tolllike receptor 4,TLR4)協(xié)同髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)以及下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factorreceptor associated factor 6,TRAF6)是參與其發(fā)生發(fā)展的重要影響因子[5]。TLR4屬于模式識別受體,常作用于免疫細(xì)胞表面,參與識別病原相關(guān)分子,在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。MyD88作為Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游蛋白,在傳遞上游信息后直接誘發(fā)疾病[7],同時也可與TRAF6結(jié)合,激活致病因子,誘發(fā)炎癥疾病、過敏性疾病、自身免疫性疾病等[5]。

隨著臨床醫(yī)學(xué)的進一步發(fā)展,近年來電針干預(yù)逐漸被醫(yī)學(xué)界認(rèn)可,并得到廣泛的關(guān)注和支持[8]。電針能明顯改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)疼痛,還能抑制大鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞[9-10]。由于電針干預(yù)可以有效改善炎癥反應(yīng),抑制炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生,因此已被應(yīng)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種炎癥疾病[11],但其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時對滑膜組織具有怎樣的作用及其作用機制還有待探索[12]。本研究基于TLR4/MyD88/TRAF6信號通路觀察電針干預(yù)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織的影響,探究TLR4/MyD88/TRAF6信號通路作為電針干預(yù)新靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

實驗動物為SPF級健康成年Wistar大鼠[購于北京祥瑞生物制品有限公司,許可證號SYXK(京)2018-0029],體質(zhì)量(200±10)g,共計48只。大鼠在恒定的溫度(25±2)℃,濕度50%～70%和12 h光/12 h暗循環(huán)的環(huán)境下飼養(yǎng),隨意進食標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。所有動物實驗均在甘肅省慶陽市第二人民醫(yī)院動物實驗中心進行。48只大鼠隨機分為健康組、模型組、電針組和電針通路激活組,每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

Ⅱ型膠原酶(Gibco公司,貨號C21901),血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(上海邦景實業(yè)有限公司,貨號BJ-S965453),白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號ml112819),增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)ELISA檢測試劑盒(上海滬崢生物科技有限公司,貨號HS2297),TLR4/MyD88/TRAF6通路激活劑脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(北京百奧萊博生物科技有限公司,貨號YT332),TLR4抗體(貨號ab13556)、MyD88抗體(貨號ab219413)、TRAF6抗體(貨號ab40675)和GADPH抗體(貨號ab9485)均購于abcam公司。

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(ABI公司,7500),凝膠成像系統(tǒng)(上海生工生物有限公司,HE-120),溫?zé)犭娋木C合治療儀(蘇州好博醫(yī)療器械股份有限公司,HB-WZ1)。

1.3 干預(yù)方法

模型組、電針組和電針通路激活組大鼠根據(jù)參考文獻[13-14]提供的方法在背部皮下多點注射1 mL Ⅱ型膠原酶乳制劑(1 g/L,完全弗氏佐劑均勻乳化),此為初次免疫;1周后在大鼠尾根部注射0.2 mL Ⅱ型膠原酶乳制劑以加強免疫,進而構(gòu)建膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型。健康組注射等量的生理鹽水。初次免疫后第14天進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分[關(guān)節(jié)部位出現(xiàn)部分炎癥反應(yīng)為0分,小趾關(guān)節(jié)一并出現(xiàn)炎癥反應(yīng)為1分,小趾延伸至足部均出現(xiàn)炎癥為2分,踝關(guān)節(jié)附近連同下部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)為3分,踝關(guān)節(jié)及以下各部位均呈炎癥狀態(tài)為4分],模型組、電針組和電針通路激活組關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥3分時即為構(gòu)建模型成功[14]。加強免疫后,模型組不做處理,電針組和電針通路激活組用0.25 mm×12 mm針灸專用針刺入大鼠雙側(cè)四關(guān)穴(“合谷”和“太沖”),針頭平刺進入2.5 mm,接通溫?zé)犭娋木C合治療儀導(dǎo)入電流(“合谷”接正極,“太沖”接負(fù)極,同側(cè)穴位連一組電極),強度2 mA,疏密波,頻率為5 Hz/15 Hz,治療20 min。每日1次,持續(xù)10 d。電針通路激活組每次電針結(jié)束后,腹腔內(nèi)注射1 mL LPS溶液(1 mg/mL,生理鹽水稀釋);電針組注射等量的生理鹽水。末次干預(yù)后進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。

1.4 踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化

末次干預(yù)后,麻醉大鼠,剖開足部露出踝關(guān)節(jié),向關(guān)節(jié)腔中注射1 mL生理鹽水,回抽關(guān)節(jié)液1 mL凍存?zhèn)溆?取出踝關(guān)節(jié),部分用于制備切片樣品,剩余部分液氮處理凍存?zhèn)溆谩Ｇ衅瑯悠凡捎眉兹┕潭?骨組織脫鈣液脫鈣處理,常規(guī)方法制作切片,厚度5 μm。嚴(yán)格按照染色試劑盒說明書方法染色處理,顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5 關(guān)節(jié)處病理學(xué)指標(biāo)檢測

1.5.1 滑膜組織

取出預(yù)先凍存的關(guān)節(jié)液,3 000 r/min離心4 min,取上層液體,按照試劑盒說明書方法檢測IL-1β和TNF-α含量。取出部分預(yù)先液氮處理的踝關(guān)節(jié)滑膜組織,研磨成粉,加入組織裂解液充分裂解,靜置5 min,取上層清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法檢測PCNA含量。

1.5.2 軟骨組織

踝關(guān)節(jié)處剝離軟骨組織,剪碎后加入胰蛋白酶消化1 h,接著加入Ⅱ型膠原酶過夜消化,3 000 r/min離心4 min,棄上清,加入80 μL結(jié)合緩沖劑重懸細(xì)胞,加入10 μL碘化丙啶和Annexin V-FITC的混合溶液,孵育15 min,加入500 μL結(jié)合緩沖劑,充分清洗,上機檢測軟骨細(xì)胞凋亡情況。

1.6 熒光定量PCR檢測

取出部分預(yù)先液氮處理的踝關(guān)節(jié)滑膜組織,研磨成粉,用總RNA提取試劑(total RNA extraction reagent,TRIZOL)提取總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,上機檢測TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平。引物序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。GAPDH Sense primer為AGTTCAACGGCACAGTCAAG,Antisense primer為TACTCAGCACCAGCATCACC; TLR4 Sense primer為CGCTCTGGCATCATCTTCAT,Antisense primer為CGAGGTAGGTGTTTCTGCTAAG; MyD88 Sense primer為CTTGTTCTCTCTACCGTTGGTC,Antisense primer為CCAAGTACTCGAAACCCATCTC; TRAF6 Sense primer為GCGCTGTGCAAACTACATTT,Antisense primer為AAGGATCGTGAGGCGTATTG。采用2-ΔΔCt法計算TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA相對表達量。

1.7 蛋白印跡(Western blot,WB)法檢測

取部分大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織,液氮處理研磨成粉,加入裂解液,提取蛋白并測定其濃度,變性處理后加入12% SDS-PAGE凝膠孔道,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜處理,TBST清洗3次,每次10 min,5%脫脂奶粉于水平搖床封閉2 h,加入一抗(TLR4抗體、MyD88抗體、TRAF6抗體、GAPDH抗體,1:500),4 ℃下過夜。棄封閉液,TBST清洗3次,每次10 min。加入二抗(1:1 500),室溫下孵育40 min,TBST清洗3次,每次10 min,風(fēng)干后倒入混合顯色液,浸泡1 min,將膜取出,吸干多余液體,置于凝膠成像系統(tǒng)上進行條帶灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異比較用單因素方差分析,數(shù)據(jù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組干預(yù)前后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較

干預(yù)前和干預(yù)后,模型組、電針組和電針通路激活組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均顯著高于健康組(P＜0.05);電針組和電針通路激活組干預(yù)后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分較干預(yù)前顯著降低(P＜0.05);電針組和電針通路激活組干預(yù)后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均低于模型組(P＜0.05);電針通路激活組干預(yù)后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分較電針組顯著升高(P＜0.05)。詳見表1。

表1 4組干預(yù)前后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較(±s) 單位:分

表1 4組干預(yù)前后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較(±s) 單位:分

注:與健康組比較1)P＜0.05;與同組干預(yù)前比較2)P＜0.05;與模型組比較3)P＜0.05;與電針組比較4)P＜0.05。

組別 n 干預(yù)前 干預(yù)后健康組 12 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 12 6.58±0.551) 6.63±0.511)電針組 12 6.65±0.521) 4.72±0.431)2)3)電針通路激活組 12 6.62±0.531) 6.21±0.351)2)3)4)

2.2 干預(yù)后4組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化比較

健康組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整,無炎性細(xì)胞浸潤,組織表面光滑平整,滑膜組織及軟骨組織細(xì)胞排列緊密;模型組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)不完整,出現(xiàn)嚴(yán)重磨損,軟骨組織存在大量炎性細(xì)胞,滑膜組織增厚明顯;電針組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)輕度破壞,破壞程度較模型組輕,有少量炎性細(xì)胞浸潤,滑膜組織厚度趨于正常;電針通路激活組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞較電針組嚴(yán)重,有部分炎性細(xì)胞浸潤,滑膜組織增生加重。詳見圖1。

2.3 4組關(guān)節(jié)處病理學(xué)指標(biāo)比較

與健康組比較,其余3組關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β和滑膜組織中PCNA的含量以及軟骨細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,電針組和電針通路激活組關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β和滑膜組織中PCNA的含量以及軟骨細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P＜0.05);與電針組比較,電針通路激活組關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β和滑膜組織中PCNA的含量以及軟骨細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05)。詳見圖2和表2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測4組軟骨細(xì)胞凋亡情況圖

表2 4組大鼠TNF-α、IL-1β和PCNA含量及軟骨細(xì)胞凋亡率比較(±s)

表2 4組大鼠TNF-α、IL-1β和PCNA含量及軟骨細(xì)胞凋亡率比較(±s)

注:與健康組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05。

組別 n TNF-α/(pg·mL-1) IL-1β/(ng·mL-1) 健康組 12 64.57±17.81 0.78±0.17 模型組 12 124.62±14.721) 1.89±0.261) 電針組 12 79.65±23.241)2) 1.23±0.311)2) 電針通路激活組 12 107.73±15.411)2)3) 1.58±0.231)2)3) PCNA/(ng·mL-1) 細(xì)胞凋亡率(%)4.92±1.74 5.16±1.83 20.78±2.321) 21.04±2.311)8.62±1.411)2) 11.65±4.161)2)14.52±1.841)2)3) 16.72±2.311)2)3)

2.4 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平比較

模型組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平顯著高于健康組(P＜0.05),電針組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平顯著低于模型組(P＜0.05),電針通路激活組TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平顯著高于電針組(P＜0.05)。詳見表3。

表3 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平比較(±s)

表3 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平比較(±s)

注:與健康組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05。

組別 n TLR4 mRNA MyD88 mRNA TRAF6 mRNA健康組 12 1.00±0.04 1.00±0.06 1.00±0.23模型組 12 3.37±0.141) 3.74±0.311) 8.25±0.751)電針組 12 1.34±0.231)2) 1.41±0.171)2) 3.26±0.341)2)電針通路激活組 12 2.87±0.211)2)3) 2.64±0.261)2)3) 6.14±0.571)2)3)

2.5 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達水平比較

模型組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達水平均顯著高于健康組(P＜0.05),電針組滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達水平均顯著低于模型組(P＜0.05),電針通路激活組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達水平顯著高于電針組(P＜0.05)。詳見圖3和表4。

圖3 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達條帶圖

表4 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達水平比較(±s)

表4 4組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表達水平比較(±s)

注:與健康組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05。

組別 n TLR4/GAPDH MyD88/GAPDH TRAF6/GAPDH健康組 12 0.59±0.09 0.64±0.05 0.67±0.06模型組 12 2.65±0.171) 3.27±0.411) 2.74±0.141)電針組 12 0.74±0.111)2) 1.27±0.241)2) 1.04±0.221)2)電針通路激活組 12 2.06±0.131)2)3) 2.13±0.261)2)3) 1.86±0.231)2)3)

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬全身性自身免疫疾病,以慢性危害關(guān)節(jié)為特征,伴有淋巴結(jié)腫大、皮下結(jié)節(jié),滑膜組織病變殘缺等特征,嚴(yán)重時會導(dǎo)致畸形,造成不同程度的殘疾?；そM織參與了病變的整個過程,近年來滑膜組織病理學(xué)不斷完善,滑膜病變程度也被認(rèn)為是判斷關(guān)節(jié)炎病情的重要指標(biāo)[15-16]。西藥與中藥在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時,具有較多的不良反應(yīng),使患者難以堅持治療干預(yù)[17],而電針干預(yù)具有安全、便利等特點,因此已被廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療中[18]。既往研究顯示,四關(guān)穴在臨床上常作為主穴用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,且能有效減輕全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的術(shù)后疼痛[19-20]。故本研究以四關(guān)穴為針刺腧穴,旨在探討TLR4、MyD88和TRAF6通路作為電針干預(yù)靶點的可能性。

本研究結(jié)果顯示,健康組大鼠具有正常的關(guān)節(jié)及滑膜組織,且關(guān)節(jié)炎指數(shù)均為0;模型組出現(xiàn)明顯的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病征;通過電針干預(yù),局部病征消退,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)輕度破壞,有少量炎性細(xì)胞,滑膜組織增生減輕,關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著下降,這說明電針干預(yù)可以有效緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎伴隨關(guān)節(jié)軟骨的破壞以及骨質(zhì)增生,在這一病理過程中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α起著至關(guān)重要的作用[21]。在患者滑膜及軟骨間會有高表達的TNF-α和IL-1β產(chǎn)生,而正常關(guān)節(jié)間IL-1β和TNF-α的表達量極低,且兩者與軟骨損傷呈正相關(guān),滑膜組織中PCNA含量的上升也加劇了關(guān)節(jié)炎的癥狀[22]。PCNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中表達升高,PCNA又與細(xì)胞增殖相關(guān),說明PCNA表達的增高導(dǎo)致滑膜增生,從而使關(guān)節(jié)破壞,加速病情進展[23]。因此,為進一步驗證電針干預(yù)對滑膜組織的影響,通過試劑盒檢測IL-1β、TNF-α和PCNA含量,發(fā)現(xiàn)患病大鼠IL-1β、TNF-α和PCNA含量顯著上升,而電針干預(yù)后IL-1β、TNF-α和PCNA含量明顯下降,這與過往文獻[24]報道一致,進一步證明了電針干預(yù)對關(guān)節(jié)炎疾病的作用。

有研究表明,關(guān)節(jié)炎作為炎癥疾病,受多種炎癥因子的調(diào)控,TLR4、MyD88、TRAF6等蛋白的高表達會激活炎癥因子,誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[5]。本研究結(jié)果顯示,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA及蛋白的表達均顯著高于健康大鼠,而電針干預(yù)后滑膜組織中TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA及蛋白的表達均顯著降低。為進一步驗證電針干預(yù)對TLR4/ MyD88/TRAF6通路的調(diào)控作用,在電針干預(yù)的同時向大鼠腹腔內(nèi)注射通路激活劑,研究發(fā)現(xiàn)加入TLR4/ MyD88/TRAF6通路激活劑后,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的緩解程度明顯降低,且干預(yù)后關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降程度低于電針組,IL-1β、TNF-α和PCNA含量下降被有效緩解。TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA及蛋白表達較電針組顯著升高,這說明通路激活劑緩解了電針干預(yù)對通路的抑制作用,使關(guān)節(jié)炎改善變緩,進一步證明電針干預(yù)確實通過調(diào)節(jié)TLR4、MyD88、TRAF6等參與調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病。

綜上所述,電針干預(yù)可有效抑制TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA和蛋白的表達,改善關(guān)節(jié)及滑膜組織的結(jié)構(gòu),抑制炎癥因子的表達,促進滑膜組織細(xì)胞增生和軟骨組織細(xì)胞凋亡,降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分,從而起到緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用?？梢?電針干預(yù)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有很好的干預(yù)效果,有很大的應(yīng)用空間,同時有多個通路參與調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,電針干預(yù)是否還通過其他通路參與緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,仍需要進一步的實驗加以說明。