陶奇波，郄西虎，張倩，高宇軒，張亞锜，張瑞真，陳曉菲，牛天秀，孫小同，聶宇婷，劉雅如，胡珈齊，鐘尚志，孫娟*

（1. 黃河三角洲草地資源與生態(tài)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，青島市灘涂鹽堿地特色植物種質(zhì)創(chuàng)制與利用重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人工草地生物災(zāi)害監(jiān)測與綠色防控重點實驗室，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山東 青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

種子在植物學(xué)上指由胚珠發(fā)育而來的繁殖器官，是植物遺傳信息和世代繁殖的載體［1］。在草牧業(yè)生產(chǎn)中，種子是最基本的生產(chǎn)資料，起到“芯片”的關(guān)鍵作用［2-3］。高質(zhì)量的牧草種子是人工草地建植、退化天然草地改良、提升我國草牧業(yè)發(fā)展水平的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是城市綠地建設(shè)及生態(tài)環(huán)境脆弱地區(qū)開展生態(tài)修復(fù)工程的重要基礎(chǔ)材料［4-5］。相較于農(nóng)作物，牧草種子往往體積細小、重量較輕，且常被種植于一些寒旱地區(qū)以及水肥條件較差的邊際土地，因此在草牧業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)修復(fù)實踐中，須選用高質(zhì)量牧草種子以確保在復(fù)雜環(huán)境下的成功出苗和建植［6］。另外隨著草業(yè)機械化水平的快速提升和牧草/農(nóng)作物間作、套作等創(chuàng)新栽培模式的廣泛應(yīng)用，對牧草種子質(zhì)量的要求也與日俱增［7-9］。

種子活力（seed vigor）是描述種子質(zhì)量的綜合性指標，是指種子在萌發(fā)和幼苗生長期間活性水平和特性的綜合表現(xiàn)，反映了種子在廣泛田間條件下迅速整齊出苗和長成茁壯幼苗的潛力［10］。高活力牧草種子在生產(chǎn)實踐中具有如下幾方面的優(yōu)勢：1）良好的田間發(fā)芽、出苗能力，建植整齊迅速且幼苗茁壯；2）更強的抗逆性，可在田間更加廣泛的逆境條件下保障出苗和建植；3）耐儲性更好，種子壽命和商品種子的儲藏年限更長［11-12］。因此，開展精確而快速的牧草種子活力評價，有助于在生產(chǎn)上選擇高活力種子用于播種，并預(yù)測種子在田間條件下的出苗建植表現(xiàn)和幼苗生長發(fā)育的活性水平，是實現(xiàn)生態(tài)草牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)［13］。此外，高效的牧草種子活力評價方法也可為高活力牧草種質(zhì)資源的挖掘、篩選、評價及新品種遺傳選育奠定基礎(chǔ)［14］。

鑒于開展種子活力評價的重要意義，牧草種子活力評價相關(guān)研究一直是草業(yè)和種業(yè)科技工作者重點關(guān)注的領(lǐng)域。國際種子檢驗協(xié)會（International Seed Testing Association，ISTA）已推薦了電導(dǎo)率法、人工加速老化法、控制劣變法、胚根突出法和四唑法等5 種活力評價方法［15］，然而目前絕大部分標準化的方法均是針對農(nóng)作物和園藝作物，而適用于牧草種子的標準化方法較少。不同牧草種子，往往適用的活力評價方法和條件存在較大差異，同一物種的不同品種間也可能存在差異，這種差異主要受到不同物種和品種的遺傳背景、種子結(jié)構(gòu)、化學(xué)組分和品種特性等多方面因素影響［6，16-17］。本研究在系統(tǒng)查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，從種子活力的概念及其發(fā)展、牧草種子活力評價方法的研究進展等方面進行綜述，重點介紹活力評價方法的原理及其在牧草種子上的研究現(xiàn)狀，并提出未來的研究展望，以期為開展牧草種子劣變與活力基礎(chǔ)研究提供重要理論基礎(chǔ)，為活力評價的實踐提供科學(xué)依據(jù)與指導(dǎo)，推動我國生態(tài)草牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

1 種子活力的概念及其發(fā)展

一直以來，標準發(fā)芽試驗的結(jié)果是檢驗種子質(zhì)量的重要標準。然而有研究發(fā)現(xiàn)，即使是擁有市場上可以接受的高發(fā)芽率的種批，在更廣泛的田間條件下出苗和形成正常幼苗的能力方面可能依然存在較大不同，其原因在于實驗室最適的發(fā)芽條件掩蓋了種子的真實質(zhì)量水平［18］。因此人們試圖尋找可以更加精準反映種子質(zhì)量的綜合性指標。早在1876 年，種子學(xué)創(chuàng)始人德國Friedrich Nobbe 教授就觀察到種子個體間在萌發(fā)和幼苗生長能力上的差異，并將這種差異的原因歸結(jié)為“Triebcraft”，意為“驅(qū)動力”［19］。“驅(qū)動力”的概念經(jīng)過反復(fù)討論和發(fā)展，以“活力”一詞而被廣泛接受，以至于ISTA 在1953 年成立了活力委員會［20］。1957 年，Isely［21］首次定義了種子活力，即在不良的田間條件下成苗的一切特性的總和。Perry［22］將種子活力定義為決定種子或種批在萌發(fā)和出苗階段內(nèi)在活性以及表現(xiàn)性能潛在水平的所有特性的總和，該定義已被 ISTA 采用。北美官方種子分析家協(xié)會（Association of Official Seed Analysts，AOSA）于1983 年將種子活力定義為在廣泛的田間條件下，決定種子迅速整齊出苗以及幼苗正常生長的潛力［23］。我國著名種子生理學(xué)家鄭光華先生也于 1980 年提出了種子活力的定義：種子的健壯度，包括迅速整齊萌發(fā)的發(fā)芽潛力、生長潛勢和生產(chǎn)潛力［24］。2006 年，顏啟傳教授更加詳細地描述了種子活力，認為種子活力是指充分成熟、充實飽滿、健康無病蟲、完整無損傷、耐貯性好的非休眠種子，在廣泛環(huán)境條件下，表現(xiàn)出抗逆性強、發(fā)芽、出苗快速整齊、茁壯生長、正常發(fā)育等特點，能長成健壯整齊的、正常的幼苗，具有實現(xiàn)高產(chǎn)量和品質(zhì)的潛在能力［25］。

綜合上述概念可知，除了常規(guī)的種子發(fā)芽特性外，種子活力更關(guān)注在更加廣泛而不可預(yù)知的田間條件下出苗和長成茁壯植株的能力，這也更加貼近于牧草種子本身的種用價值，對于牧草豐產(chǎn)和草地生態(tài)修復(fù)具有重大意義。另外種子活力也十分強調(diào)種子本身的抗逆性和耐儲藏等特性，使其成為一項描述牧草種子質(zhì)量的全面的性能指標。這也意味著種子活力無法同種子發(fā)芽率一樣定量地表示，而是需要采取適宜的活力檢測方法間接地反映。

2 基于牧草種子物理性狀的測定方法

牧草種子形態(tài)特征多樣，基于牧草種子物理性狀如色澤和大小等的活力測定方法，具有經(jīng)濟性好、操作簡便和迅速等優(yōu)勢，在牧草種子活力評價中具有較為廣泛的應(yīng)用。

2.1 牧草種子色澤

基于種子色澤開展的牧草種子活力評價，主要集中在豆科牧草。種子色澤的差異往往是因為種子成熟度的不同，而種子成熟度又是影響種子活力的重要因素［26］。Delouche［27］認為依據(jù)種子顏色是評價絳車軸草（Trifolium incarnatum）種子活力的最有效方法。有研究表明，亮橄欖綠色的紫花苜蓿（Medicago sativa）種子活力要顯著高于干褐色種子［28］。不同顏色的紫云英（Astragalus sinicus）種子活力具有顯著差異，從大到小依次為黃綠色種子、淺綠色種子、原樣種子、紅棕色種子［29］。張震東等［30］通過模糊隸屬函數(shù)法研究發(fā)現(xiàn)不同顏色黃花草木樨（Melilotus officinalis）種子活力由高到低依次是黃色種子、紅色種子、混樣種子、綠色種子。多葉羽扇豆（Lupinus polyphylla）綠色種子的活力要顯著高于黃色和褐色種子［31］。在黃花苜蓿（Medicago falcata）上的研究表明，黃褐色種子的活力要顯著高于褐色與暗綠色種子，這和種子的成熟程度息息相關(guān)［32］。也有一些研究表明，應(yīng)用種子顏色評判牧草種子活力應(yīng)該綜合考慮多因素的影響，如Stanisavljevi? 等［33］認為灰白色箭筈豌豆（Vicia sativa）種子適合在儲藏9 或21 個月后進行播種，而儲藏33 個月以后，黑色種子的活力更高。非豆科牧草，如禾本科的羊草（Leymus chinensis），種子活力隨種子顏色的加深而顯著降低，以淺黃色羊草種子活力最高［34］。然而，種子顏色在評價牧草種子活力方面也有一定局限性，如顏色是一個感官指標，受到主觀因素影響較大，且不同牧草種子顏色不同，缺乏標準的顏色劃分體系，在不同研究中結(jié)果變異也較大，導(dǎo)致在實踐中應(yīng)用受到限制。例如，采用種子顏色評價紅三葉（Trifolium pratense）種子活力，存在數(shù)套推薦的顏色劃分體系，呂鵬輝等［35］認為種子活力由高到低依次為黃色、褐色、混色、黃褐色，亦有研究將紅三葉種子分為黃色、紫色、褐色和混色4 類，其中黃色種子活力最高，褐色種子活力最低，紫色和混色種子活力相近［36］。而Velijevi? 等［37］僅將紅三葉種子按照顏色分為亮色、深色以及混色3 類，認為亮色種子活力顯著高于其他種子?？梢姴煌芯恐袑ΨN子顏色的認定差異較大，且研究結(jié)果并不一致，如此對實踐的指導(dǎo)意義則不大。

2.2 牧草種子大小和重量

牧草種子大小和重量與種子活力的關(guān)系已有廣泛研究，多數(shù)報道集中在20 世紀（表1）。在羊草［38］、多年生黑麥草（Lolium perenne）［39］、箭筈豌豆［33］、紫花苜蓿［40］以及許多牧草種子上的研究均表明，在遺傳背景相同的前提下，大粒種子由于成熟度高、營養(yǎng)物質(zhì)貯藏量大，可以為種子萌發(fā)、出苗以及幼苗早期生長階段提供更多的養(yǎng)分與能量，因而種子活力較小粒種子高。然而，也有研究表明牧草種子大小和重量與種子活力沒有必然聯(lián)系，如Cooper 等［41］指出紫花苜蓿種子大小對種子活力和出苗率無顯著影響。也有研究表明百脈根（Lotus corniculatus）種批間種子大小與幼苗生長狀況無顯著相關(guān)性，這可能是因為種子儲藏年限與條件的不同所致［42］。由此可見，依據(jù)牧草種子大小與重量進行種子活力評價，有一定不確定性和不穩(wěn)定性，因而近20 年來相關(guān)研究逐漸減少。如要運用種子大小與重量開展牧草種子活力評價，需要保證種子遺傳背景、儲藏年限和條件的一致性和穩(wěn)定性，另外針對種子大小和重量的分級也需進一步細化。

表1 種子大小和重量應(yīng)用于牧草種子活力評價的物種相關(guān)信息Table 1 Research carried out to apply seed size and mass to estimate seed vigor of forage species

2.3 牧草種子吸水速率

種子吸水速率是一種主要用于豆科牧草種子活力測定的物理性狀，也稱快速吸漲法（quick swell）［12］。其原理在于活力低的豆科牧草種子種皮破損程度高、吸水快，從而導(dǎo)致子葉受損和種子內(nèi)含物滲漏［81］。在小冠花（Coronilla varia）上的研究表明，種子吸水和膨脹的時間越長，則其產(chǎn)生的腐爛和不正常幼苗比例越低［82］。在鷹嘴紫云英［83］、絳車軸草［84］、白三葉［85］和紅三葉［85］等豆科牧草上亦有類似結(jié)果。然而，在檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）和細枝巖黃耆（Hedysarum scoparium）上的研究表明，種子膨脹吸水率與種子活力無關(guān)，這可能歸結(jié)于這些豆科牧草的種子硬實以及果莢難與種子分離等原因［86］。

3 基于牧草種子萌發(fā)特征的測定方法

3.1 種子萌發(fā)相關(guān)指標

由于標準發(fā)芽率（standard germination percentage）是在實驗室的最適萌發(fā)條件下測得的，無法全面反映種子在更廣泛條件下的出苗及幼苗生長表現(xiàn)，因此絕大部分情況下無法精確表征種子活力水平，前人在紫花苜蓿［87］、燕麥［88］和垂穗披堿草（Elymus nutans）［88］等牧草種子上的研究均驗證了上述結(jié)論。而基于其他種子萌發(fā)特征，包括平均發(fā)芽時間（mean germination time，MGT）、基于胚根剛突破種皮的平均發(fā)芽時間（mean just germination time，MJGT）、發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）和發(fā)芽勢（germination energy，GE）等指標，則被廣泛認為可以準確反映牧草種子活力并預(yù)測田間出苗（表2）。與最終發(fā)芽率不同，上述萌發(fā)特征指標更加強調(diào)對牧草種子萌發(fā)過程，尤其是萌發(fā)速度的描述，而多數(shù)研究認為萌發(fā)速度與種子活力呈正相關(guān)。MGT 或MJGT 也可認為是一批種子從吸水到萌發(fā)（胚根突破種皮）的平均滯緩期（lag period）長度，基于種子老化/修復(fù)假說，高活力種子在萌發(fā)過程中損傷修復(fù)時間更短，因此萌發(fā)的滯緩期更短［89-90］。滯緩期長度最初用于玉米（Zea mays）種子活力的測定［91］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多花黑麥草［92］、紫云英［93］以及箭筈豌豆［94］等牧草種子的活力測定。

表2 種子萌發(fā)相關(guān)指標用于牧草種子活力評價的物種、萌發(fā)溫度以及萌發(fā)標準等信息Table 2 Information on application of seed germination characteristics on forage seed vigor estimation： Species，germination temperature and criteria of germination

采用萌發(fā)相關(guān)性狀測定種子活力，應(yīng)注意遵照ISTA 規(guī)程或國家標準，使種子萌發(fā)的條件標準化，以利于測定結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。同時，如果測定牧草種子的萌發(fā)對光照無嚴格需求，應(yīng)在黑暗條件下開展試驗，以便于消除不同設(shè)備間光照條件的差異性。此外，目前的種子活力測定，常用的種子萌發(fā)標準有3 種，即正常苗、胚根≥2 mm、胚根剛突破種皮（肉眼可見），其中正常苗是標準發(fā)芽試驗的萌發(fā)計數(shù)標準（表2）。研究表明，以不同標準作為萌發(fā)計數(shù)的依據(jù)，牧草種子活力的測定結(jié)果也有所不同，如以胚根肉眼可見為標準計算的紫花苜蓿MJGT 與田間出苗率的相關(guān)性要高于以胚根≥2 mm 為標準計算的MGT［95］。Mao 等［96］也發(fā)現(xiàn)燕麥的MJGT 與出苗率的相關(guān)性較MGT 更高。因此在基于牧草種子萌發(fā)性狀開展種子活力測定中，尤其需要注意萌發(fā)計數(shù)標準的選擇，在條件允許時，可以采用多標準統(tǒng)計萌發(fā)指標，并比較不同標準下的評價效果。

3.2 胚根突出法

基于萌發(fā)性狀的牧草種子活力評價需要統(tǒng)計連續(xù)時間間隔內(nèi)的種子萌發(fā)數(shù)，在實踐上可能耗費時間過多。標準發(fā)芽率雖然無法精確反映種子活力，但是種子吸水萌發(fā)早期的胚根突出或者萌發(fā)率，則對種子活力較為敏感［111］。胚根突出法（radicle emergence，RE）是ISTA 推薦的活力測定方法，最早也是應(yīng)用于玉米種子活力評價［112］。同時這種方法也在油菜（Brassica napus）和萊菔（Raphanus sativus）中實現(xiàn)了標準化，收錄入ISTA 種子檢驗國際規(guī)程［113］。

應(yīng)用 RE 評價牧草種子活力需要從與田間出苗率的相關(guān)性高低和花費時間長短等方面入手，尋找適宜的胚根突出率統(tǒng)計時間點。該方法相比于其他萌發(fā)性狀，往往精確度更高、也更加省時，一般統(tǒng)計的時間節(jié)點為20～72 h，而對于一些萌發(fā)較慢的物種或萌發(fā)溫度較低的情況下，統(tǒng)計時間點可能會更晚（表3）。RE 的另一大優(yōu)勢在于可以作為標準發(fā)芽試驗的一部分，可在一次試驗中完成2 種活力測定。在牧草上絕大部分研究選擇胚根≥2 mm 作為胚根突出的標準（表3）。

表3 應(yīng)用胚根突出法評價牧草種子活力的試驗溫度、胚根突出標準以及統(tǒng)計時間點等試驗條件相關(guān)信息Table 3 Research establishing conditions to apply the radicle emergence test to estimate seed vigor of forage species：Temperature，criteria of radicle emergence，and timing for radicle emergence count

高活力種子在胚根突出種皮前所需要的損傷修復(fù)，如生物膜、DNA 修復(fù)時間更短，即從開始吸水到胚根突出的時間（滯緩期）更短，從而在特定時間點的胚根突出率更高［114-115］。在眾多牧草及飼用植物上的研究均已篩選了針對特定物種的適宜胚根突出統(tǒng)計時間點，同時通過計算回歸分析決定系數(shù)（R2），發(fā)現(xiàn)該時間點的胚根突出率和田間出苗率有緊密且顯著的正相關(guān)關(guān)系（表3），為牧草種子的活力研究和生產(chǎn)實踐提供了重要理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。此外隨著自動化技術(shù)的進步，將RE 試驗和自動拍照技術(shù)相結(jié)合，可實現(xiàn)更加高通量的牧草種子活力評價。

4 基于牧草幼苗生長的測定方法

由于種子活力的概念包含幼苗生長潛勢及茁壯生長等內(nèi)涵，因此基于幼苗生長狀況同樣可開展牧草種子活力的測定。植物幼苗的鮮重、干重、幼苗長、胚根長、胚芽長等均是常用的指標［123］。在相同條件下，產(chǎn)生的幼苗結(jié)構(gòu)完整、長勢好，則種子活力高；若產(chǎn)生的幼苗長勢弱，或不正常苗率高，則種子活力差［124］。Pereira 等［125］的研究表明大黍（Panicum maximum）根長和苗長均與田間出苗率顯著正相關(guān)，可以準確反映種子活力水平。也有研究表明萌發(fā)第3 天的幼苗長度是評價百脈根種子活力的精確快速方法［126］。但Wang 等［127］的研究認為胚根長度與紫花苜蓿、光葉紫花苕、蘇丹草和老芒麥等牧草種子活力無顯著相關(guān)性。

此外，通過幼苗長勢計算出的活力指數(shù)（vigor index），既涵蓋了發(fā)芽速度相關(guān)信息，又反映了植物幼苗長勢，也在牧草種子的活力測定方面有著廣泛的應(yīng)用（表2）。如Venuste 等［121］研究表明中華羊茅（Festuca sinensis）種子活力指數(shù)和2 年的田間出苗率顯著正相關(guān)，因此可以精確評價種子活力。

5 基于逆境試驗的牧草種子活力測定

依據(jù)不同活力水平的牧草種子對各種不良環(huán)境的抵抗性，可檢測種子活力的高低。眾多研究表明這種檢測方法具有較強可靠性和可重復(fù)性?；谀婢吃囼灥幕盍z測主要包括人工加速老化法以及抗逆萌發(fā)法等。

5.1 人工加速老化法

人工加速老化法（accelerated ageing，AA）是在人工控制的高溫（ISTA 推薦41～45 ℃）和高濕（100%相對濕度）條件下加速種子老化，從而可以在較短時間內(nèi)模擬出種子在自然條件下的老化過程，體現(xiàn)出牧草種子活力的差異。高活力牧草種子對人工加速老化的抵抗性更強，從而在處理后依然可以表現(xiàn)出更高的發(fā)芽率和幼苗生長表現(xiàn)。人工加速老化可為評價牧草種子的田間出苗性能和耐儲藏性提供重要參考信息［128］。此外人工加速老化也是牧草種子活力基礎(chǔ)研究的常用手段［129］。此法簡便易行，且不需要昂貴精密的儀器和試劑，因此局限性小、應(yīng)用范圍廣［123］。應(yīng)用AA 評價牧草種子活力，多年來已有了廣泛研究，不同牧草種子人工加速老化的適宜溫度和時間通常不同，因此需要對老化條件進行優(yōu)化（表4）。同種牧草可能在不同研究中，篩選的適宜老化溫度和時間也不同，這可能是因為所用品種、儲藏年限以及老化后測定指標的不同導(dǎo)致的，在研究及生產(chǎn)實踐中需要根據(jù)實際情況選擇適宜的方法開展人工加速老化處理。

表4 人工加速老化法用于牧草種子活力評價的物種、適宜老化溫度和時間信息Table 4 Information on application of accelerated ageing test on forage seed vigor estimation： Species，optimum ageing temperature and time

5.2 飽和鹽溶液加速老化法

在AA 的基礎(chǔ)上，Jianhua 等［178］提出了飽和鹽溶液加速老化法（saturated salt accelerated ageing，SSAA），該方法在操作上和AA 的區(qū)別在于用飽和鹽溶液（一般是NaCl）替代水。由于飽和鹽溶液對水分的固定作用更強，降低了水分蒸發(fā)，因此與AA 相比，SSAA 的種子老化環(huán)境相對濕度較低，一般是75%左右，從而使牧草種子在老化過程中吸水速率和劣變程度降低，使老化過程更為柔和，結(jié)果更加準確和穩(wěn)定［131］。飽和鹽溶液加速老化還可抑制牧草種子老化過程中微生物的繁殖和生長［20］。由于牧草種子相對于傳統(tǒng)農(nóng)作物往往更加細小，在老化過程中需要注重調(diào)控種子含水量增加的速率，防止吸水過快，因此SSAA 在牧草種子活力研究和檢測中有重要的應(yīng)用潛力［179］，目前在柳枝稷［131］、狗牙根［180］、籽粒莧（Amaranthus cruentus）［181］等牧草種子中都有所報道（表5）。

表5 飽和鹽溶液加速老化法用于牧草種子活力評價的物種、適宜老化溫度和時間信息Table 5 Information on application of saturated salt accelerated ageing test on forage seed vigor estimation： Species，optimum ageing temperature and time

5.3 控制劣變法

控制劣變法（controlled deterioration，CD）又稱催腐劣變，這種人工老化方法最早用于小粒蔬菜種子活力測定［194］，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于牧草和飼料作物的種子活力測定與評價（表6）。該方法一般是將調(diào)整至特定含水量的種子密封入鋁箔袋，置于高溫條件（一般是40 或45 ℃）進行老化。CD 原理和人工加速老化、飽和鹽溶液加速老化類似，均是通過高溫高濕條件加速牧草種子老化，并測定老化后的萌發(fā)率等指標，從而探究種子活力。但是CD需要更加嚴格地控制被老化牧草種子的含水量（表6），更加適合小粒牧草種子活力的測定［12］。有研究表明CD 可以準確檢測豆科牧草紫花苜蓿和光葉紫花苕，禾本科牧草老芒麥和蘇丹草的種子活力并準確預(yù)測其田間出苗表現(xiàn)［127］。然而在多花黑麥草上的研究表明CD 評價種子活力的結(jié)果并不穩(wěn)定［195-196］。這可能與劣變處理后所測定的指標有關(guān)，Wang 等［197］研究發(fā)現(xiàn)在紅三葉種子活力測定中，控制劣變處理后統(tǒng)計正常苗率的檢測精度要高于統(tǒng)計胚根萌發(fā)率。未來有必要擴大研究牧草物種范圍以及探索溫度、種子含水量等相關(guān)影響因素，使CD 評價牧草種子活力更加精準與可靠。

表6 控制劣變法用于牧草種子活力評價的物種、種子含水量、適宜劣變溫度和時間信息Table 6 Information on application of controlled deterioration test on forage seed vigor estimation： Species，seed moisture content，optimum deterioration temperature and time

5.4 抗逆萌發(fā)法

基于不同活力的牧草種子抵御干旱、鹽堿、冷凍、低溫、壓力以及復(fù)合等逆境脅迫方面的顯著差異，可利用抗逆萌發(fā)法來評價牧草種子活力。如十分經(jīng)典的希爾特納試驗（磚礫）就是模擬種子在萌發(fā)出苗期間遭受的土壤黏性、板結(jié)等機械壓力，高活力牧草種子頂出磚礫能力強，而低活力種子反之，有研究表明希爾特納試驗是紫花苜蓿和扭花車軸草（Trifolium resupinatum）的種子活力適宜測定方法［201］。Chen 等［202］利用10 個紫花苜蓿種批在不同滲透勢（PEG-6000）下的萌發(fā)表現(xiàn)，建立了水勢模型，發(fā)現(xiàn)水勢中位值［Ψb（50）］與田間出苗率顯著負相關(guān)，可以用于評價種子活力，而水勢時間值（θH）和水勢中位值的標準差（σφb）則和田間出苗率無顯著相關(guān)性。干旱低溫（-0.2 MPa+15 ℃）復(fù)合脅迫下的冷地早熟禾［119］和中華羊茅［121］種子發(fā)芽率和田間出苗率顯著正相關(guān)，可以用于評價其種子活力。低溫脅迫下的披堿草（20 ℃）［119］和百脈根（5 ℃）［118］種子萌發(fā)率同樣和田間出苗率顯著正相關(guān)。干旱脅迫下紅三葉（-0.15 MPa）和貓尾草（-0.6 MPa）種子發(fā)芽率是評價種子活力的適宜指標［105］。

6 基于生理生化指標的牧草種子活力測定

6.1 電導(dǎo)率法

電導(dǎo)率法（electrical conductivity，EC）是目前研究與應(yīng)用最為廣泛的種子活力評價方法之一，該方法具有測定精確、操作簡便、成本低、時效性強和適用范圍廣等優(yōu)勢［25］。其原理在于測定種子吸脹初期的細胞內(nèi)氨基酸、有機酸以及可溶性糖等電解質(zhì)滲漏程度，以評估細胞膜重建和損傷修復(fù)能力，高活力牧草種子往往能夠更快進行膜重建和損傷修復(fù)，以最大程度降低電解質(zhì)滲漏量，從而使種子浸出液電導(dǎo)率降低［127］。因此，牧草種子浸出液電導(dǎo)率和種子活力一般呈負相關(guān)。應(yīng)用EC 測定牧草種子活力需要優(yōu)化浸種溫度、浸種時間、每重復(fù)用種數(shù)量、所有容器體積和每重復(fù)加水體積等參數(shù)，使測定結(jié)果更加精確和可重復(fù)（表7）。目前此法已收錄入ISTA 種子檢驗國際規(guī)程，并在鷹嘴豆、大豆（Glycine max）、豌豆（Pisum sativum）等植物的活力評價中實現(xiàn)了標準化［113］。

表7 電導(dǎo)率法用于牧草種子活力評價的物種、浸種溫度、浸種時間、每重復(fù)用種數(shù)量以及每重復(fù)用水體積等信息Table 7 Information on application of electrical conductivity test on forage seed vigor estimation： Species，seed soaking temperature，seed soaking time，number of seed per replication，and volume of water per replication

有研究表明，EC 尤為適宜豆科牧草種子活力評價［203］，但是針對禾本科牧草的活力測定，結(jié)果并不穩(wěn)定和一致，如燕麥種子浸出液電導(dǎo)率可以準確反映種子活力，但多年生黑麥草、垂穗披堿草和羊草的種子浸出液電導(dǎo)率則和田間出苗率不相關(guān)，原因在于這些禾本科牧草種子種皮存在半透層（semipermeable layer），阻礙了種子內(nèi)含物的滲出，當刺破種皮后再測定電導(dǎo)率，則電導(dǎo)率和田間出苗率呈顯著負相關(guān)，即可以用于開展活力評價［204］。因此運用電導(dǎo)率測定禾本科牧草種子活力，必須注意該物種有無半透層，如存在則需要在浸種前刺破種皮或橫切種子，以利于種子內(nèi)含物滲漏。雖然已有眾多研究涉及EC 測定牧草種子活力（表7），但是目前尚無物種經(jīng)過ISTA的標準化。

6.2 DNA 復(fù)制速率

近年來，隨著細胞生物學(xué)技術(shù)的進步，采用流式細胞術(shù)測定種子吸水早期的 DNA 復(fù)制速率，用于評價牧草種子活力已有報道。Cheah 等［236］認為，種子萌發(fā)過程中DNA 的復(fù)制，即4C 型細胞核的增加，是在DNA 損傷修復(fù)完成后才開始的，由于高活力牧草種子所需的損傷修復(fù)時間更短，因此在種子吸水早期的4C 核比例應(yīng)更高，即4C/2C 也更大；而低活力種子則由于 DNA 復(fù)制等代謝活動緩慢，特定時間點的4C 核比例較低，萌發(fā)滯緩期也更長。Lv 等［87］報道稱紫花苜蓿和白三葉種子吸水24 h 的4C/2C 與田間出苗率顯著正相關(guān)，可用于種子活力的測定。而Cheshmi 等［117］認為吸水18 h 的4C/2C 可更加精確反映紫花苜蓿種子活力。采用流式細胞技術(shù)測定牧草種子活力，應(yīng)該注重解離液的選擇，如紫花苜蓿種子適宜的解離液為LB01［88］。

6.3 呼吸速率與ATP 含量

有研究表明牧草種子活力與種子呼吸速率和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量等生理指標緊密相關(guān)。草地雀麥種子呼吸速率和草產(chǎn)量顯著正相關(guān)［149］。Ching［237］也發(fā)現(xiàn)絳車軸草和多花黑麥草種子吸水初期的 ATP 含量與種子活力顯著正相關(guān)。然而孫麗萍等［234］認為呼吸速率無法準確測定紅豆草和伏地膚種子活力。

其他生理生化及分子生物學(xué)手段如測定脂肪酸、蛋白質(zhì)、激素、酚醛類物質(zhì)含量、Ca2+流速、代謝酶活性和關(guān)鍵基因表達量等目前主要用于農(nóng)作物的種子活力評價，在牧草中研究和應(yīng)用較少。原因可能在于這些方法操作較為煩瑣且成本高昂，重復(fù)性差，此外牧草種子生物學(xué)基礎(chǔ)研究滯后于主要農(nóng)作物，缺乏相關(guān)活力測定方法的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

7 基于計算機和光學(xué)成像技術(shù)的牧草種子活力測定

隨著計算機和光學(xué)成像等新技術(shù)的快速發(fā)展和推廣利用，國內(nèi)外許多學(xué)者將這些技術(shù)與種子活力測定結(jié)合起來，實現(xiàn)了種子活力的快速和無損檢測。國內(nèi)外常用的光學(xué)檢測技術(shù)主要包括多光譜、近紅外光譜、高光譜成像、X 光光譜以及紅外熱成像等技術(shù)［238］。運用計算機和光學(xué)成像技術(shù)有檢測耗時短、分辨率高、對種子無損以及精確度高等顯著優(yōu)勢，尤為適合對數(shù)量稀少、珍貴的種質(zhì)資源進行檢測。目前光學(xué)成像技術(shù)在活力測定上的應(yīng)用主要集中在農(nóng)作物以及蔬菜種子。在牧草方面，韓亮亮等［239］運用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合主成分-馬氏距離模式鑒別了3 種不同活力燕麥種子，鑒別率達到了 100%。Zhang 等［240］利用多光譜成像系統(tǒng)收集了不同波長下紫花苜蓿種子形態(tài)和光譜信息，并結(jié)合線性判別分析和規(guī)范化典型判別分析，在鑒別高活力種子和預(yù)測種子發(fā)芽率方面準確率高達95.7%。Wang 等［241］也發(fā)現(xiàn)多光譜成像系統(tǒng)可無損地鑒定紫花苜蓿種批中的老化和低活力種子。

目前計算機和光學(xué)成像技術(shù)在牧草種子活力檢測方面依然有較大發(fā)展空間，當前的研究主要集中在光譜數(shù)據(jù)的處理、模型建立與算法選擇等方面，較少開展光學(xué)檢測機理的研究。此外目前依然缺乏特定牧草種及品種的光譜數(shù)據(jù)與活力的定量關(guān)系，在運用該方法進行種子活力測定前，需要針對特定種或品種，建立光譜數(shù)據(jù)與活力指標的相關(guān)性。另外近紅外、多光譜等成像系統(tǒng)普遍價格昂貴，限制了這些方法的充分應(yīng)用。

8 牧草種子活力測定與評價研究展望

當前在全球氣候變化、保障食物安全、生態(tài)文明建設(shè)以及實行種業(yè)創(chuàng)新國家戰(zhàn)略的大背景下，牧草種子作為人工草地建植和天然草地改良的基礎(chǔ)材料，其種子活力的基礎(chǔ)研究和測定評價愈發(fā)突顯出重大的意義。然而目前相較于農(nóng)作物，牧草種子活力的形成調(diào)控、種子老化機制（自然老化、人工老化及其差異）基礎(chǔ)研究較為單薄。在農(nóng)作物上，諸如水稻（Oryza sativa）OsIAGLU［242］、OsPER1A［243］，玉米ZmGOLS2［244］，小麥（Triticum aestivum）TaNAC2［245］等基因均已被證明在調(diào)控種子活力中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而相關(guān)研究在牧草中則較少。應(yīng)重視借鑒農(nóng)作物上的研究基礎(chǔ)與經(jīng)驗，開展牧草種子發(fā)育和活力形成調(diào)控機制的生物學(xué)基礎(chǔ)研究，這可為提高牧草種子產(chǎn)量質(zhì)量，開辟活力測定的新方法提供重要理論基礎(chǔ)。同時，可采用種子引發(fā)、包衣和丸?；燃夹g(shù)手段進行牧草種子活力的人為調(diào)控，以確保生產(chǎn)上成功建植。

目前草種子活力測定的研究主要集中在重要牧草和飼料作物上，而 ISTA 活力委員會十分鼓勵針對廣泛物種的活力測定研究［246］。有研究表明RE、EC 等方法在鄉(xiāng)土植物種子活力測定方面具有重要潛力［247］，未來應(yīng)擴展研究物種的多樣性，尤其是針對耐寒、旱、鹽堿的優(yōu)質(zhì)特色鄉(xiāng)土草種開展種子活力評價的研究，開發(fā)出切實可行的活力評價方法，以促進我國寒旱區(qū)、鹽堿地的草牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)改良。

牧草主要集中在豆科和禾本科兩科，其中部分豆科植物種子的硬實、禾本科植物種子的休眠和半透層可能給牧草種子活力測定帶來障礙。對硬實和休眠種子的活力測定，須采取不涉及萌發(fā)和幼苗評價的方法，重點考慮從生理生化特性和分子標記的角度入手開展活力評價，另外針對種子休眠和硬實調(diào)控機制的研究也可為活力測定提供重要科學(xué)依據(jù)。對于有半透層的禾本科牧草種子應(yīng)加強半透層定位、形成發(fā)育機制的基礎(chǔ)研究，為開發(fā)適宜于有半透層種子的活力評價方法提供理論基礎(chǔ)。

目前的牧草種子活力評價方法主要集中在萌發(fā)特性、幼苗評定和生理特性等傳統(tǒng)方法，而隨著電子信息和光學(xué)技術(shù)的發(fā)展，今后牧草種子的無損檢測是重要發(fā)展趨勢。應(yīng)開展牧草種子光學(xué)檢測機理研究，通過對種子光學(xué)特征、化學(xué)組分和活力相關(guān)代謝的研究，為光學(xué)技術(shù)開展牧草種子活力檢測提供理論基礎(chǔ)。此外針對重要牧草種和品種，建立算法模型和種子光譜數(shù)據(jù)庫，以便于技術(shù)從實驗室到生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化。另外開發(fā)小型便攜設(shè)備也將大大促進這些技術(shù)在牧草種子活力檢測中的應(yīng)用。

此外還應(yīng)重視牧草種子活力測定的標準化問題。盡管當前針對牧草種子活力測定的研究較多，但經(jīng)過ISTA 標準化的測定方法較少。無論哪種活力評價方法，均應(yīng)明確揭示因為活力的差異而導(dǎo)致的商品化牧草種子在田間建植或儲藏性能方面的差距，因此開展多種批研究對技術(shù)的標準化具有重要作用。今后應(yīng)借助ISTA等平臺，加強跨地區(qū)、國際化的實驗室溝通協(xié)作，采用多個商業(yè)種批開展研究，嚴格驗證活力測定方法的準確性、普適性和可重復(fù)性，最終實現(xiàn)技術(shù)方法的標準化。