賈晶瑩，劉寶寶，馬云，段紅娟，蔡小艷*

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

microRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，長(zhǎng)度一般為18～25 nt［1-2］。miRNA 通過(guò)靶向內(nèi)源性基因在動(dòng)植物生命過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，例如調(diào)節(jié)植物抗逆性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，參與免疫應(yīng)答、進(jìn)行母嬰調(diào)節(jié)等，此外，miRNA 還可以作為疾病診斷的標(biāo)記因子［3-9］。越來(lái)越多的研究表明，miRNA 不僅可以靶向生物體內(nèi)源性基因，還可以跨界調(diào)節(jié)其他物種體內(nèi)的生物過(guò)程。經(jīng)典的跨界調(diào)控有水稻（Oryza sativa）來(lái)源的miR168 通過(guò)靶向小鼠肝臟內(nèi)的低密度脂蛋白受體銜接蛋白（LDLRAP1）減緩血液中低密度脂蛋白的清除［10］；金銀花（Lonicera japonica）水煎液中的miR2911 抑制流感病毒的復(fù)制，降低H1N1、H5N1 以及H7N9 病毒的死亡率，加速SARS-CoV-2 感染患者的陰性轉(zhuǎn)化［11-13］；大豆（Glycine max）來(lái)源的miR159a 能夠通過(guò)抑制GSK-3β 介導(dǎo)的NF-κB 和TGF-β1 途徑預(yù)防肝纖維化［14-15］。

苜蓿（Medicago sativa）作為“牧草之王”，含有較高的蛋白質(zhì)、均衡的氨基酸配比，豐富的礦物質(zhì)元素及微生物活性成分［16］。早在2012 年，我國(guó)就實(shí)施了“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”，提倡給奶牛飼喂優(yōu)質(zhì)牧草苜蓿，以提高牛奶乳蛋白率和乳脂率。已有研究表明，均衡日糧條件下，適當(dāng)增加反芻動(dòng)物苜蓿采食量，不僅可以增加牛、羊的日增重，還能夠顯著增加羊羔體內(nèi)多不飽和脂肪酸和共軛亞油酸的含量，提高牛奶產(chǎn)量，增加牛奶中乳蛋白率、乳脂率和乳糖率［17-20］。在飼草維持動(dòng)物健康和高效生產(chǎn)的研究中，關(guān)注點(diǎn)往往集中于飼草中傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)動(dòng)物的作用，植物源miRNA 對(duì)動(dòng)物作用的研究較少。確定苜蓿來(lái)源的miRNA 對(duì)奶牛的跨界調(diào)控作用，為探究奶牛日糧的均衡配比提供了分子層面的支撐，對(duì)動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)與飼料研究具有重要意義。

課題組前期試驗(yàn)已經(jīng)篩選出在中苜1 號(hào)和新鹽52 號(hào)兩種苜蓿中差異表達(dá)的mtr-novel-miR54、mtr-miR156f，以及在兩種苜蓿中高表達(dá)的mtr-miR166a，并且通過(guò)高通量測(cè)序手段檢測(cè)了上述miRNA 在奶牛體內(nèi)的確存在。本研究基于對(duì)苜蓿源miRNA 影響牛奶品質(zhì)問(wèn)題的思考與前期試驗(yàn)結(jié)果的分析，篩選了高乳脂奶牛和低乳脂奶牛中差異表達(dá)的苜蓿源miRNA，并對(duì)其進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)分析與驗(yàn)證，以期為后續(xù)研究苜蓿源miRNA 靶向奶牛內(nèi)源性基因進(jìn)而調(diào)控牛奶乳脂率篩選具有參考性的靶基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 奶牛血液與牛奶采集 試驗(yàn)材料為高乳脂和低乳脂荷斯坦奶牛的牛奶和血液，于2021 年12 月采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)，采集奶牛全部為生產(chǎn)4 胎的奶牛，產(chǎn)犢間隔340～381 d，泌乳天數(shù)108～187 d，采樣牛編號(hào)為0001～0006，基本信息見(jiàn)表1。試驗(yàn)牛飼喂相同的平衡全混合日糧（表2）。篩選體細(xì)胞數(shù)在20 萬(wàn)個(gè)·mL-1以?xún)?nèi)，高乳脂組奶牛（high milk fat，HF）乳脂率＞4.2%，低乳脂組奶牛（low milk fat，LF）乳脂率＜3.5%，每組選擇3 頭奶牛進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 采樣?；拘畔able 1 Basic information of sampling cattle

表2 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 The dietary composition and nutrient level （DM basis）

尾靜脈采血法直接將奶牛血液采集于含有抗凝劑的真空采血管內(nèi)。同一奶牛每天早、中、晚采集3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的牛奶，按4∶3∶3 比例混勻。將血液和牛奶低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，血液置于-20 ℃冰箱保存，牛奶置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 細(xì)胞 奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMEC）和HEK-293T 細(xì)胞來(lái)自寧夏大學(xué)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期保存。

1.1.3 主要試劑 Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒由Takara 公司（大連）提供。DMEM/F 12 培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)于BI 公司。雙熒光素酶報(bào)告靶基因試劑盒購(gòu)買(mǎi)自promega（貨號(hào)：E1910）公司。mtr-miR168b mimics 與NC 序列委托廣州銳博生物公司合成。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀（SYNERGY/LX，美國(guó)）、普通PCR 儀（T100，美國(guó)）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX 96 Touch，美國(guó)）均為Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛奶DHI 檢測(cè) 混勻的奶牛牛奶委托寧夏農(nóng)牧廳DHI 測(cè)定中心進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（dairy herd improvement，DHI），具體檢測(cè)指標(biāo)包括乳脂肪、乳蛋白、乳糖、總固形物以及尿素氮含量等。

1.2.2 牛奶和血液中總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol 試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行總RNA 提取。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA 濃度，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量及完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.3 氧化試驗(yàn) 在10 μL 提取的牛血RNA 樣品中，加入10 mmol·L-1高碘酸鈉進(jìn)行混合，-20 ℃氧化40 min 后離心，加入1 mL 無(wú)水乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行重懸，將懸液置于-20 ℃孵育過(guò)夜后再次離心，棄去上清液后加入20 μL 無(wú)酶水溶解沉淀，對(duì)氧化后的RNA 溶液中mtr-miR168b 和bta-miR-16a 進(jìn)行定量，驗(yàn)證植物源miRNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）測(cè)定miRNAs 表達(dá)量 除了前期試驗(yàn)結(jié)果篩選的mtr-novel-miR54、mtr-miR156f 和mtr-miR166a 外。本研究還選擇了已有跨界調(diào)控功能的植物源miR168 家族的mtr-miR168b 和mtr-miR168c-3p 兩個(gè)miRNAs。將上述5 個(gè)苜蓿源miRNAs 在奶牛血液和牛奶中的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。

根據(jù)成熟miRNAs 序列設(shè)計(jì)引物，試驗(yàn)所需引物使用Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表3），由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。以U6 作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為預(yù)混液 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA 樣品（100 ng·μL-1）2 μL，加入ddH2O 將反應(yīng)體系補(bǔ)全至20 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；39 個(gè)循環(huán)，95 ℃，10 s。

表3 miRNAs 引物信息Table 3 Primer information of miRNAs

1.2.5 BMEC 轉(zhuǎn)染mtr-miR168b BMEC 培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素的基礎(chǔ)DMEM/F12 培養(yǎng)基，在含5% CO2，37 ℃的恒溫加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5 μg·mL-1的胰島素，5 μg·mL-1的氫化可的松和20 ng·mL-1的催乳素即為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%左右融合度時(shí)，根據(jù)Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染在6 孔板中進(jìn)行，每個(gè)轉(zhuǎn)染組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每孔加入50 nm mtr-miR168b mimics（mimics）或mtrmiR168b NC（NC），以NC 組為對(duì)照組，mimics 組為處理組進(jìn)行成脂標(biāo)志基因檢測(cè)。48 h 后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此時(shí)記為誘導(dǎo)0 d。誘導(dǎo)期間每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，每4 d 收集細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)成脂標(biāo)志基因進(jìn)行檢測(cè)，所測(cè)基因引物使用Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表4），由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

表4 引物信息Table 4 Primer information

1.2.6 mtr-miR168b 在牛體內(nèi)的靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析 根據(jù)miRNAs 靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan 提供的?；蛐畔?，與聯(lián)川生物平臺(tái)（https：//www.omicstudio.cn/index）聯(lián)合分析預(yù)測(cè)mtr-miR168b靶基因。對(duì)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，篩選出參與調(diào)控乳脂合成的相關(guān)信號(hào)通路的靶基因。使用RNAhybrid 進(jìn)一步對(duì)靶基因進(jìn)行篩選。運(yùn)用Bgee 網(wǎng)站查找預(yù)測(cè)靶基因在牛組織內(nèi)的表達(dá)分?jǐn)?shù)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）測(cè)定表達(dá)量 對(duì)篩選出的與乳脂相關(guān)的靶基因進(jìn)行定量檢測(cè)。將mtrmiR168b mimics 和mtr-miR168b NC 分別轉(zhuǎn)染至BMEC，48 h 后收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞中預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行定量檢測(cè)。試驗(yàn)所需引物由Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表4），由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系同1.2.4。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告靶基因 根據(jù)STARD7和CPT1A的序列，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)包含mtrmiR-168b 種子區(qū)在內(nèi)的靶基因3' UTR 區(qū)引物（表4），并在引物5'端上分別添加X(jué)ho Ι 和Not Ι 的酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基。目的片段經(jīng)雙酶切和純化回收后，與psiCHECKTM-2 載體連接，構(gòu)建STARD7和CPT1A與Psicheck-2 野生型（WT-CPT1A）載體。基因突變型載體（MUT-CPT1A）委托上海生工生物公司合成，酶切位點(diǎn)與載體同上。將mtr-miR168b mimics 和mtr-miR168b NC 分別與構(gòu)建好的野生型和突變型載體共轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipo 3000，轉(zhuǎn)染方法與說(shuō)明書(shū)一致。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果用 2-ΔΔCt進(jìn)行處理，每組數(shù)據(jù)至少設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。使用GraphPad Prism 7 軟件的t檢驗(yàn)對(duì)RT-qPCR 結(jié)果和雙熒光結(jié)果作圖并進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著（*），P＜0.01 為差異極顯著（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液和牛奶采集牛的選擇

根據(jù)DHI 檢測(cè)結(jié)果篩選出3 頭高乳脂奶牛和3 頭低乳脂奶牛，對(duì)牛進(jìn)行重新編號(hào)方便后續(xù)試驗(yàn)。上述6 頭奶牛各項(xiàng)指標(biāo)見(jiàn)表5。其中，3 頭高乳脂奶牛牛號(hào)分別為0001、0002 和0003，牛奶中脂肪含量＞4.2%；3 頭低乳脂奶牛牛號(hào)分別為0004、0005 和0006，牛奶中脂肪含量＜3.5%。在此說(shuō)明，高乳脂奶牛為采集樣品中乳脂含量相對(duì)較高且穩(wěn)定的3 頭奶牛，并不代表牛場(chǎng)中牛奶乳脂含量的最高水平。

表5 基于DHI 檢測(cè)的高乳脂與低乳脂奶牛的奶產(chǎn)量及奶品質(zhì)Table 5 Milk yield and quality of high-fat and low-fat dairy cows based on DHI detection

2.2 血液和牛奶中苜蓿源miRNA 的篩選與驗(yàn)證

對(duì)前期篩選出的mtr-novel-miR54、mtr-miR156f、mtr-miR166a，以及mtr-miR168b 和mtr-miR168c-3p 共5 個(gè)苜蓿源miRNAs 在牛血液和牛奶中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述苜蓿源miRNAs 在高乳脂奶牛（HF）和低乳脂奶牛（LF）的血液（圖1a）和牛奶（圖2a）中均可檢測(cè)到。

圖1 苜蓿源miRNAs 在奶牛血液中相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression level of alfalfa miRNAs in bovine blood

圖2 苜蓿源miRNAs 在奶牛牛奶的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of alfalfa miRNAs in milk

在奶牛血液中，僅有mtr-miR168b 在低乳脂奶牛中的表達(dá)量極顯著高于在高乳脂奶牛中的表達(dá)量（P＜0.01；圖1b）。在奶牛牛奶中，mtr-miR168b 在低乳脂奶牛中的表達(dá)量顯著高于在高乳脂奶牛中的表達(dá)量（P＜0.05；圖2b）。氧化試驗(yàn)表明，與內(nèi)源性bta-miR-16a 相比，植物源mtr-miR168b 在被氧化后的牛血液RNA 中仍具有較高的表達(dá)水平（圖3），說(shuō)明牛血液中的mtr-miR168b 來(lái)自植物，可以抵抗高碘酸鈉的氧化。

圖3 氧化前后牛血液中內(nèi)源性miRNA 與外源性miRNA 表達(dá)量檢測(cè)Fig. 3 The expression levels of endogenous and exogenous miRNA in bovine blood before and after oxidation

定量結(jié)果顯示，僅有mtr-miR168b 在高乳脂和低乳脂奶牛血液和牛奶中表達(dá)量穩(wěn)定且有顯著差異（P＜0.05），并且氧化試驗(yàn)證實(shí)了miR168b 的確來(lái)自植物miRNA，故對(duì)mtr-miR168b 在奶牛體內(nèi)的作用進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 mtr-miR168b 過(guò)表達(dá)抑制BMEC 中脂代謝基因的表達(dá)

為驗(yàn)證mtr-miR168b 高表達(dá)對(duì)奶牛乳脂的影響，構(gòu)建了mtr-miR168b mimics 處理后mtr-miR168b 在BMEC中不同誘導(dǎo)時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)8 d 后，mtrmiR168b 的表達(dá)量仍極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖4a）。脂代謝相關(guān)基因PPARγ、SCD1、CEBP/β和SREBP1的表達(dá)量在mimics 組被抑制，且抑制作用在誘導(dǎo)第4和8 天顯著。說(shuō)明mtr-miR168b 過(guò)表達(dá)抑制乳脂的合成，并且抑制作用隨著時(shí)間的推移而增加（圖4）。

圖4 mtr-miR168b 高表達(dá)抑制奶牛BMEC 乳脂的合成Fig.4 High expression of mtr-miR168b inhibits the synthesis of milk fat in cow mammary epithelial cells

2.4 mtr-miR168b 靶基因GO 功能富集分析

通過(guò)TargetScan 和RNAhybrid 預(yù)測(cè)得到的mtrmiR168b 靶基因中，有1834 條靶基因與GO 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)成功。將預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行GO 功能富集分析（圖5），結(jié)果顯示：注釋到生物過(guò)程層面顯著富集的功能或代謝路徑為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，DNA-模板、氧化還原過(guò)程和半橋粒組裝，分別有14、11 和10 條靶基因富集到上述功能。注釋到細(xì)胞成分層面顯著富集的功能或代謝路徑為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和膜的整體成分，分別有41、34 和34 條靶基因富集。注釋到分子功能層面顯著富集的功能條目為ATP 結(jié)合、鋅離子結(jié)合和肌動(dòng)蛋白結(jié)合，分別有19、18 和14 條靶基因富集。

圖5 mtr-miR168b 在牛體內(nèi)靶基因GO 功能富集分析Fig.5 Enrichment analysis of mtr-miR168b target gene GO function in cattle

2.5 mtr-miR168b 靶基因KEGG 功能富集分析

預(yù)測(cè)得到的mtr-miR168b 靶基因中，有296 條靶基因與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)成功，獲得注釋。KEGG 的注釋結(jié)果按照KEGG 通路類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)，得到靶基因KEGG 通路類(lèi)型分類(lèi)圖（圖6）。對(duì)mtr-miR168b 的靶基因進(jìn)行Pathway 富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靶基因注釋到的全部KEGG 通路中，N-聚糖生物合成（3.72%）、cGMP-PKG（環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷酸-依賴(lài)性蛋白激酶）信號(hào)通路（2.37%）和血管平滑肌收縮（2.37%）為富集最顯著的信號(hào)通路。另外，甘油磷脂代謝（1.69%）通路也被顯著富集。

圖6 mtr-miR168b 在牛體內(nèi)靶基因KEGG 通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of mtr-miR168b target gene KEGG function in cow

2.6 脂代謝相關(guān)靶基因篩選

通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)分析，得到部分與脂肪代謝相關(guān)的靶基因與信號(hào)通路，如SERINC1、CPT1A和STARD7等。通過(guò)網(wǎng)站查詢(xún)預(yù)測(cè)靶基因在牛奶、乳腺以及乳腺脂肪內(nèi)的表達(dá)評(píng)分。表達(dá)評(píng)分高，證明該基因在特定組織表達(dá)豐度高，具有更明顯的調(diào)控作用。由表6 可知，SERINC1、CPT1A和STARD7在牛奶和乳腺脂肪中的表達(dá)評(píng)分均高于80，而CLN8和CPTP在牛奶中的表達(dá)評(píng)分較低。SERINC1與磷脂生物合成和鞘脂代謝過(guò)程相關(guān)；STARD7參與脂質(zhì)代謝信號(hào)通路、甘油磷脂合成以及磷脂代謝信號(hào)通路；CPT1A參與脂肪酸β 氧化信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路以及PPAR-α 信號(hào)通路。上述預(yù)測(cè)到的3 個(gè)mtr-miR168b 靶基因在牛奶和乳腺脂肪中具有較高的表達(dá)評(píng)分，且均參與脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路，可作為載體構(gòu)建的首選靶基因。

表6 mtr-miR168b 脂質(zhì)代謝靶基因與組織表達(dá)評(píng)分Table 6 mtr-miR168b lipid metabolism target gene and tissue expression score

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)靶基因

將mtr-miR168b mimics 和NC 分別轉(zhuǎn)染到BMEC 中，對(duì)上述結(jié)果中篩選出來(lái)的SERINC1、CPT1A和STARD7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。結(jié)果表明，CPT1A和STARD7mimics 組中基因表達(dá)量與NC 組相比均有顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.01），這為mtr-miR168b 與CPT1A和STARD7靶向關(guān)系提供了進(jìn)一步佐證（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)染后乳腺上皮細(xì)胞預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)量Fig.7 Predicting target gene expression level of breast epithelial cells after transfection

2.8 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證mtr-miR168b 和CPT1A 基因靶向關(guān)系

構(gòu)建了CPT1A和STARD73' UTR-psiCHECKTM-2 重組雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將靶基因質(zhì)粒與mtrmiR168b mimics 或NC 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h 后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示：WT-STARD7+mtr-miR168b mimics 組較WT-STARD7+mtr-miR168b NC 組熒光素酶活性顯著下降（P＜0.01）。MUT-STARD7+mtrmiR168b mimics 組與MUT-STARD7+mtr-miR168b NC 組熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8），CPT1A與STARD7熒光結(jié)果趨勢(shì)一致。這證明mtr-miR168b 與STARD7和CPT1A基因均具有靶向關(guān)系。

圖8 相對(duì)熒光素酶活性Fig.8 Relative luciferase activity

3 討論

多種植物或中草藥已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料，用以提高養(yǎng)殖水平，改善肉品質(zhì)。已有報(bào)道稱(chēng)，給豬灌喂或者讓其自由采食玉米（Zea mays），均可以在豬的脂肪和肌肉中檢測(cè)到豐富的玉米源miRNAs［21-22］。黎夢(mèng)等［23］研究表明，給小鼠灌服植物源miRNAs 導(dǎo)致小鼠肌肉脂代謝比例顯著增加，附睪脂肪沉積顯著減少。此外，植物miR167e-5p，干燥堅(jiān)果中的miR159a 和miR156c 也被確定可以通過(guò)靶向動(dòng)物體內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)脂肪的生成［24-25］。上述結(jié)果表明，植物源miRNAs 可以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并參與畜禽體內(nèi)肌肉和脂肪形成的調(diào)節(jié)。本研究得到的結(jié)論與其一致，即苜蓿源miR168b 進(jìn)入奶牛體內(nèi)調(diào)節(jié)脂代謝。研究植物源miRNAs 對(duì)畜禽脂代謝相關(guān)靶基因的作用關(guān)系，對(duì)改善肉用家畜的肉品質(zhì)及乳用家畜的乳脂率具有重要意義。

本研究在正常飼喂的高乳脂和低乳脂奶牛的血液和牛奶中均檢測(cè)到苜蓿源miRNAs，這證明了苜蓿源miRNAs 可以通過(guò)采食進(jìn)入牛體內(nèi)。苜蓿源miRNA 隨著奶牛采食苜蓿進(jìn)入奶牛體內(nèi)，參與奶牛體內(nèi)的血液循環(huán)到達(dá)乳腺細(xì)胞，隨著乳腺細(xì)胞合成牛奶的過(guò)程最終進(jìn)入牛奶中，故在奶牛血液和牛奶中都可以檢測(cè)到苜蓿源miRNAs 的存在。同一組不同牛的血液和牛奶中，苜蓿源miRNAs 的表達(dá)量有較大的差異，這可能與牛自身的攝入量和代謝相關(guān)。其中，奶牛自身對(duì)miRNA 的代謝差異可能是導(dǎo)致miRNA 在不同奶牛體內(nèi)差異表達(dá)的主要原因。但mtr-miR168b 在高乳脂和低乳脂奶牛血液和牛奶中均穩(wěn)定存在，并且高乳脂組mtr-miR168b 的表達(dá)量顯著高于低乳脂組，故推測(cè)mtr-miR168b 在奶牛體內(nèi)靶向的基因中有與脂代謝密切相關(guān)的基因?；谏鲜鐾普摚ㄟ^(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性提高了BMEC 中mtr-miR168b 的表達(dá)水平，結(jié)果表明mtr-miR168b 高表達(dá)后，脂代謝標(biāo)志基因PPARγ、SCD1、CEBP/β和SREBP1在BMEC 中的表達(dá)量均被抑制，且隨著時(shí)間推移，表達(dá)量下降更加明顯。為了進(jìn)一步闡明mtr-miR168b 對(duì)BMEC 脂肪生成影響的作用機(jī)制，對(duì)mtr-miR168b 靶基因進(jìn)行了功能富集分析，并篩選出了mtr-miR168b 與脂代謝密切相關(guān)的CPT1A和STARD7兩個(gè)靶基因（圖9）。

圖9 苜蓿源mtr-miR168b 影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)代謝Fig.9 Summary of pathway by which mtr-miR168b from alfalfa influences lipid metabolism in BMECs

STARD7蛋白是一種脂質(zhì)結(jié)合蛋白，在脂質(zhì)運(yùn)輸、甘油磷脂合成信號(hào)通路中均發(fā)揮重要作用。并且已有研究表明，嘉興黑豬脂肪細(xì)胞內(nèi)的miR-206 通過(guò)靶向STARD7抑制了脂肪細(xì)胞的增殖［26］。CPT1 是脂肪分解代謝的關(guān)鍵酶，也是脂肪酸β 氧化過(guò)程中的限速酶，CPT1A是其中一種亞型基因。已有研究表明，CPT1A基因表達(dá)量與各肌肉組織肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，還可以減少小鼠肝臟中的脂肪變性［27-28］。STARD7主要調(diào)節(jié)的脂類(lèi)為磷脂和鞘脂，而磷脂和鞘脂是包裹乳脂的乳脂球膜（milk fat globular membrane，MFGM）的主要組成成分［29］。已有研究表明，MFGM 磷脂的變化對(duì)牛乳的乳化性、穩(wěn)定性和理化性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而改變牛乳品質(zhì)，并且如果牛乳中脂肪含量增加，則會(huì)形成比較大的脂肪球，這也揭示了脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)與脂肪球大小呈正相關(guān)的現(xiàn)象［30-31］。

mtr-miR168b 靶基因顯著富集在A(yíng)TP 結(jié)合與GTP 結(jié)合條目，甘油磷脂通路和mTOR 信號(hào)通路。ATP 與GTP 之間結(jié)合與轉(zhuǎn)化可以通過(guò)三羧酸循環(huán)完成，是機(jī)體重要的供能方式，參與多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中AMPK信號(hào)通路由于細(xì)胞內(nèi)ATP 減少、AMP/ATP 增加被激活。AMPK 信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸的攝入，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇、糖原、蛋白質(zhì)、脂肪酸的合成與氧化，以滿(mǎn)足能量需求，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝［32-33］。mTOR 有mTORC1 和mTORC2 兩個(gè)亞型，mTORC2 通過(guò)誘導(dǎo)AKT 蛋白氨基酸位點(diǎn)磷酸化激活A(yù)KT，激活的AKT 通過(guò)磷酸化2448 位點(diǎn)的蘇氨酸激活mTORC1，之后被完全激活的AKT/mTOR 信號(hào)通路開(kāi)始調(diào)節(jié)細(xì)胞中脂肪的生成、葡萄糖的代謝和細(xì)胞的凋亡［34-35］。mtr-miR168b 的靶基因CPT1A同時(shí)位于A(yíng)MPK 信號(hào)通路和mTOR 信號(hào)通路，此外STARD7基因參與甘油磷脂合成（R-HSA-1483206）代謝通路。故本研究推測(cè)mtr-miR168b 主要通過(guò)靶向CPT1A和STARD7基因參與AMPK、mTOR 和甘油磷脂合成信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)奶牛體內(nèi)的脂代謝。并且CPT1A和STARD7基因與牛乳中乳脂率的調(diào)節(jié)也有一定聯(lián)系，這為mtr-miR168b 在基因水平調(diào)控奶牛乳脂代謝提供了驗(yàn)證方向。

4 結(jié)論

DHI 檢測(cè)篩選出高乳脂奶牛和低乳脂奶牛，并在兩組奶牛的血液和牛奶中均檢測(cè)到了苜蓿源miRNAs，其中mtr-miR168b 在高乳脂奶牛血液和牛奶中的表達(dá)量與低乳脂奶牛相比具有顯著差異。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mtrmiR168b 高表達(dá)抑制了BMEC 中脂代謝標(biāo)志基因PPARγ、SCD1、CEBP/β和SREBP1的表達(dá)量。為明確mtrmiR168b 對(duì)乳脂的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)mtr-miR168b 在牛體內(nèi)的靶基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)靶基因主要與N-聚糖生物合成（3.72%）、cGMP-PKG 信號(hào)通路（2.37%）和甘油磷脂代謝通路（1.69%）顯著相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了CPT1A和STARD7與mtr-miR168b 靶向關(guān)系，為后續(xù)驗(yàn)證苜蓿源miRNAs 調(diào)控奶牛乳脂提供了可進(jìn)一步驗(yàn)證的基因。