王占軍，季波，紀童，蔣齊

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)與草地生態(tài)研究所，寧夏防沙治沙與水土保持重點實驗室，寧夏 銀川 750002）

干旱生境是限制草地生產(chǎn)力與畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素之一［1］。豆科牧草作為優(yōu)質(zhì)的牧草資源，在營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與生態(tài)改良方面有著巨大優(yōu)勢，是退化草原補播改良或人工草地建植不可或缺的草種選擇。因此，進行優(yōu)良耐旱豆科牧草品種的遴選以及耐旱性識別和評估，對于引進優(yōu)質(zhì)牧草、促進草地畜牧業(yè)發(fā)展與改良生態(tài)環(huán)境十分重要。

豆科牧草的根系較為發(fā)達，能夠深入土層，吸收更多的水分和養(yǎng)分，增加其抗旱能力，在土壤含水量極低的條件下，植物會從蒸騰系統(tǒng)、生長調(diào)節(jié)系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)、根系系統(tǒng)、激素系統(tǒng)等多個系統(tǒng)做出調(diào)節(jié)以抵御干旱脅迫［2］，如調(diào)節(jié)氣孔、激活根系生長、積累有機質(zhì)、增加抗氧化酶、分泌激素等多種方式。其中抗氧化酶系統(tǒng)在干旱脅迫研究中最為突出，車軒等［3］研究發(fā)現(xiàn)紅豆草（Onobrychis viciaefolia）抗氧化酶系統(tǒng)的相互協(xié)調(diào)能力要優(yōu)于變異小冠花（Coronilla varia），其可減少自由基對細胞的損害，保護細胞膜的完整性，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進而表現(xiàn)出較強的抗旱性；蘇日古嘎等［4］研究發(fā)現(xiàn)白花草木樨（Melilotus albus）通過葉片中積累可溶性糖與增加抗氧化酶活性來適應(yīng)干旱脅迫；洪開祥等［5］對5 種一年生豆科牧草苗期的抗旱性進行研究，發(fā)現(xiàn)毛苕子（Vieia villosa）抗旱性最強。

此外在干旱脅迫下，牧草不僅在抗氧化酶系統(tǒng)做出反應(yīng)，其外部性狀也被作為評判植物是否抗旱的直觀表現(xiàn)，缺失水分植物會出現(xiàn)生長速度減慢、葉片卷曲變黃、凋謝死亡等形態(tài)特征的變化，不同品種的牧草其環(huán)境適應(yīng)力也不盡相同［6］。因此利用牧草農(nóng)藝性狀得出準確的牧草抗旱土壤含水量閾值，對于準確評判植物抗旱性意義重大。

寧夏地處我國西北內(nèi)陸，屬于典型的溫帶大陸性氣候，區(qū)內(nèi)干燥少雨，蒸發(fā)量大，年平均降水量在250 mm 左右，且分布極不均勻，多集中分布于7、8、9 月［7］，引進抗旱性強的豆科牧草對該地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展以及退化草地恢復(fù)具有十分重要的意義。因此本研究以5 種多年生豆科牧草草木樨狀黃芪（Astragalus melilotoides）、牛枝子（Lespedeza potaninii）、達烏里胡枝子（Lespedeza davurica）、小冠花、鷹嘴紫云英（Astragalus cicer）為研究對象，通過測定土壤水分和牧草農(nóng)藝性狀（綠葉數(shù)與株高），利用均方根偏差法［8］計算綠葉數(shù)和株高離散度與土壤水分離散度，及兩者間的權(quán)衡關(guān)系，以土壤水分為自變量，權(quán)衡值為因變量，利用分位數(shù)模型［8］界定維持植物正常生命活動的土壤水分閾值，同時結(jié)合干旱脅迫下牧草生理指標(biāo)，達到科學(xué)評價牧草抗旱性的目的，從而為干旱區(qū)優(yōu)質(zhì)抗旱牧草的建植及草地生態(tài)修復(fù)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取5 種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草：草木樨狀黃芪、牛枝子、達烏里胡枝子、小冠花、鷹嘴紫云英進行抗旱性研究（表1）。

表1 供試牧草信息Table 1 Information of tested forage

1.2 試驗設(shè)計

于2019 年4 月在寧夏農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)與草地生態(tài)研究所試驗基地（E 106°30′，N 37°04′），采用盆栽法，裝入統(tǒng)一的大田土壤（土壤理化性質(zhì)見表2），將豆科牧草種子種于花盆中，于實驗室溫室內(nèi)進行培育，6 月5 日苗期穩(wěn)定后間苗，保證花盆中苗數(shù)相同，并搬至有遮雨條件的室外進行干旱脅迫試驗。設(shè)置干旱脅迫組與對照組，其中每種牧草干旱脅迫組設(shè)置7 個重復(fù)，對照組3 個重復(fù)，5 種牧草共計50 組花盆。于7 月10 日-29 日進行脅迫試驗，脅迫前進行澆水處理，保證土壤水分充足，處理組進行斷水處理，對照組每日正常澆水，測定各處理組生理指標(biāo)、土壤含水量以及植物農(nóng)藝性狀（綠葉數(shù)、株高）。

表2 供試土壤基本情況Table 2 Soil base conditions for testing

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 生理指標(biāo)測定 為防止陽光直射，取樣時間定為上午9：00。選取牧草中上部長勢一致的新鮮健康葉片、放入冰盒，帶回實驗室進行測定。取樣方法如表3。

表3 指標(biāo)測定方法Table 3 Measurement of indicators

1.3.2 相對值的計算 抗旱脅迫指數(shù)（drought resistance index，DRI）=

1.3.3 抗旱性評價

式中：μxk：第k個指標(biāo)的正反隸屬函數(shù)值；xk、xmin、xmax、分別表示第k個指標(biāo)的指標(biāo)值、指標(biāo)最小值、指標(biāo)最大值、指標(biāo)平均值；xik：i材料的第k 個指標(biāo)值；vk：標(biāo)準差系數(shù)；wk：權(quán)重；D：綜合評價值。

1.3.4 土壤含水量測定與計算 試驗開始前將所有試驗處理所用花盆進行標(biāo)記稱重，記作M2，在試驗期間每日稱量花盆重量記作M1，在脅迫試驗結(jié)束后，稱量每個帶土花盆重后，將每個花盆土混合均勻，隨機選擇6 個土樣，置于鋁盒內(nèi)帶回實驗室烘干，得出干土重（M3，kg）。利用試驗中每日的花盆重量（M1，kg），計算每日每個花盆的土壤質(zhì)量含水量（S1，%）。

田間土壤含水量采用土壤多參數(shù)傳感器（Hydra Probe，可測定土壤水分、溫度和鹽分）測定。5-8 月定期進行土壤體積含水量的監(jiān)測。

1.3.5 綠葉數(shù)和株高測定 間苗后將牧草進行定株標(biāo)記，每日測定株苗上的綠葉數(shù)，并用卷尺測定牧草株高。

1.3.6 土壤含水量閾值確定 綠葉數(shù)-株高的土壤含水率相對收益。

式中：Wi、Gi、Wmin、Wmax、Gmin、Gmax分別是土壤水分、農(nóng)藝性狀、土壤水分在所有樣本中的最小值和最大值、農(nóng)藝性狀在所有樣本中的最小值和最大值。

圖1 為均方根偏差法收益示意圖，圖中指標(biāo)收益大小為坐標(biāo)點到1∶1 線的距離，來表征二者之間的權(quán)衡關(guān)系：在0 權(quán)衡線上代表當(dāng)前土壤含水量恰好能夠維持當(dāng)前牧草正常生長發(fā)育，當(dāng)處于權(quán)衡線下半部分時，當(dāng)前土壤含水率能夠維持當(dāng)前牧草正常生長發(fā)育；相反，當(dāng)處于權(quán)衡線上半部分時則說明當(dāng)前土壤含水率不能夠維持當(dāng)前牧草正常生長發(fā)育。

圖1 均方根偏差法Fig.1 Root mean square deviation method

1.3.7 分位數(shù)回歸 分位數(shù)回歸［8］被廣泛應(yīng)用于探究因變量的整體分布或了解某一分位點因變量的分布狀況。為避免牧草死亡或抗旱系統(tǒng)嚴重破壞數(shù)據(jù)集影響，分位點的確定需要保證數(shù)據(jù)權(quán)衡值≥0，各牧草分位點基本情況見表4。

表4 各牧草分位點Table 4 Forage quantile

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excle 進行基礎(chǔ)統(tǒng)計計算以及作圖，采用R 語言agricolae 與quantreg 函數(shù)包進行方差分析與分位數(shù)回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠葉數(shù)和株高變化特征

2.1.1 綠葉數(shù) 由圖2 可知，牧草草木樨狀黃芪（A）、達烏里胡枝子（C）綠葉數(shù)均表現(xiàn)為試驗前期（7 月10 日-7月13 日）與對照組差異不顯著（P＞0.05），牧草牛枝子（B）與小冠花（D）綠葉數(shù)，在試驗前期（7 月13 日）就已顯著低于對照組，僅牧草鷹嘴紫云英（E）在試驗后期（7 月24 日-7 月29 日）綠葉數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖2 豆科牧草綠葉數(shù)Fig.2 Green leaves number of legume forages

2.1.2 株高 由圖3 可知，牧草草木樨狀黃芪（A）除7 月21 日外，對照組與處理組均無顯著性差異（P＞0.05），牧草牛枝子（B）脅迫后期（7 月29 日）對照組顯著高于處理組，僅牧草鷹嘴紫云英（E）株高在全脅迫時期均表現(xiàn)為對照組與處理組無顯著差異（P＞0.05），牧草達烏里胡枝子（C）、小冠花（D）在脅迫中期與后期表現(xiàn)為對照組株高顯著高于處理組（P＜0.05），且牧草達烏里胡枝子（C）、小冠花（D）在脅迫前期出現(xiàn)處理組株高高于對照組的現(xiàn)象。

圖3 豆科牧草株高Fig.3 Plant height for legume forages

2.2 土壤含水量響應(yīng)閾值

2.2.1 土壤含水量閾值 豆科牧草達烏里胡枝子（C）、小冠花（D）綠葉數(shù)分位數(shù)回歸模型未通過顯著性檢驗（P＞0.05）。草木樨狀黃芪（A）、牛枝子（B）、鷹嘴紫云英（E）分位數(shù)回歸方程通過了顯著性檢驗（P＜0.05），3 種牧草回歸線與X 軸的交點分別為17%、10%、5%（土壤水分閾值），當(dāng)?shù)陀谕寥浪珠撝禃r說明當(dāng)前水分不足以維持植物正常生長（圖4）。鷹嘴紫云英（E）土壤含水量閾值符合土壤干旱程度分級標(biāo)準［14］（重度干旱土壤5%左右），證明鷹嘴紫云英（E）能夠在該地區(qū)重度干旱土壤中維持自身生長，可作為優(yōu)質(zhì)引選牧草。

圖4 綠葉數(shù)-分位數(shù)模型Fig.4 Green leaf number-single digit model

由圖5 可知，豆科牧草達烏里胡枝子（C）、小冠花（D）株高分位數(shù)回歸模型未通過顯著性檢驗（P＞0.05），草木樨狀黃芪（A）、牛枝子（B）、鷹嘴紫云英（E）分位數(shù)回歸方程通過了顯著性檢驗（P＜0.05），3 種牧草回歸線與X軸的交點分別為16%、14%、10%（土壤水分閾值），鷹嘴紫云英（E）土壤含水量閾值，符合土壤干旱程度分級標(biāo)準［14］（中度干旱土壤8%左右），證明牧草鷹嘴紫云英（E）能夠在該地區(qū)中度干旱土壤中維持自身生長，可作為優(yōu)質(zhì)引選牧草。

圖5 株高-分位數(shù)模型Fig.5 Plant height-single digit model

2.2.2 模型檢驗 由圖6 可知，牧草草木樨狀黃芪（A）與牛枝子（B）綠葉數(shù)分位數(shù)模型擬合系數(shù)為0.2792、0.2852，精度較低，株高分位數(shù)模型擬合系數(shù)為0.6214、0.8465，精度較高；牧草鷹嘴紫云英（E）株高與綠葉數(shù)分位數(shù)模型擬合系數(shù)均較高，分別為0.9954、0.7706，說明鷹嘴紫云英（E）（綠葉數(shù)、株高）的土壤含水量響應(yīng)閾值具有科學(xué)意義。

圖6 模型檢驗Fig.6 Model checking

2.3 生理指標(biāo)對干旱脅迫的響應(yīng)

由圖7 可知，除牧草牛枝子（B）外，4 份供試牧草的過氧化物酶活性在脅迫前期均與對照組差異不顯著（P＞0.05），干旱脅迫后期5 種牧草過氧化物酶活性均顯著高于其余處理組與對照組（P＜0.05）。

圖7 干旱脅迫指數(shù)Fig.7 Drought stress index

牛枝子（B）超氧化物歧化酶活性隨脅迫時間延長呈上升趨勢，脅迫中期與后期顯著高于對照組與初期（P＜0.05），其余4 種牧草超氧化物歧化酶活性均呈先上升后下降趨勢。

5 份供試牧草中牛枝子（B）、達烏里胡枝子（C）、鷹嘴紫云英（E）過氧化氫酶活性整體呈上升的趨勢，脅迫后期過氧化氫酶活性顯著高于對照組（P＜0.05）。小冠花（D）脅迫后期出現(xiàn)過氧化氫酶活性下降的趨勢，顯著低于對照組（P＜0.05）。

5 份供試牧草中葉綠素含量整體呈先上升后下降的趨勢，牧草脅迫初期葉綠素含量均顯著高于對照組與其余處理組（P＜0.05）。

丙二醛含量與可溶性糖含量隨脅迫時間延長逐漸升高，除小冠花（D）丙二醛含量脅迫前中后期差異不顯著（P＞0.05）外，剩余4 種牧草丙二醛含量均在脅迫后期顯著高于其余處理組與對照組（P＜0.05）?？扇苄蕴呛砍」诨ǎ―）外，其余4 種牧草脅迫后期均顯著高于對照組（P＜0.05）。

牧草草木樨狀黃芪（A）、牛枝子（B）、達烏里胡枝子（C）與小冠花（D）脅迫后期脯氨酸含量顯著高于對照組與其余處理組（P＜0.05），鷹嘴紫云英（E）對照組顯著高于其余處理組（P＜0.05）。

2.4 抗旱性評價

選取參試5 份牧草的過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛、可溶性糖、脯氨酸、葉綠素共計7 項生理指標(biāo)進行模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)值評價，并以綜合評價D 值的高低評價5 種豆科牧草抗旱性。由表5 可知，牧草牛枝子（B）生理指標(biāo)綜合評價排名最高，D 值為0.74。

表5 綜合評價D 值Table 5 Comprehensive evaluation D value

3 討論

3.1 綠葉數(shù)和株高對干旱脅迫的響應(yīng)

植物在面對水分脅迫時，會做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)，如生理生化調(diào)節(jié)，細胞結(jié)構(gòu)改變等，而最直觀的表現(xiàn)在植物外部形態(tài)上，如生長速度減緩，葉片顏色變化，老化等［14］，株高和綠葉數(shù)是被廣泛用于評價牧草抗旱性的直觀指標(biāo)。本研究中豆科牧草在脅迫后期均出現(xiàn)了綠葉數(shù)與株高顯著低于對照組的趨勢，表明干旱脅迫程度越高，牧草的農(nóng)藝性狀受到的負面影響就越大。尹飛［15］對玉米（Zea mays）進行干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時間的延長，玉米出現(xiàn)葉片萎縮，株高下降的特征；常雪剛［16］研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致7 種鵝觀草屬（Roegneria）18 份野生種質(zhì)材料株高、葉綠素含量以及葉片含水量等出現(xiàn)下降，本研究結(jié)果與其一致。

試驗中不同牧草對干旱脅迫的表現(xiàn)不同，牧草C 于脅迫中期（7 月21 日）就已出現(xiàn)死亡，而牧草E 則在全脅迫階段株高并無顯著變化，表明不同牧草品種對于干旱脅迫的耐受能力不同。

試驗中還發(fā)現(xiàn)牧草E 在 7 月10 日出現(xiàn)表觀性狀增長的情況，原因可能為在牧草生長過程中，其根系會儲備大量的水分，當(dāng)遇到干旱脅迫時，牧草會利用儲備的水分進行生長，此外牧草在受到干旱脅迫時會調(diào)整其生理代謝，使其更加高效地利用已儲存的水分，使其正常生長。陸姣云等［17］發(fā)現(xiàn)輕度水分脅迫有利于紫花苜蓿（Medicago sativa）產(chǎn)量和品質(zhì)的提高；羅冬等［18］研究表明，輕微干旱對4 種牧草狹葉錦雞兒（Caragana stenophylla）、黃花草木樨（Melilotus suavelens）、內(nèi)蒙準格爾苜蓿（M.sativacv.Neimeng Zhungeer）和沙打旺（Astragalus adsurgens）種子萌發(fā)和幼苗生長均有促進作用。

3.2 土壤水分閾值確定

牧草農(nóng)藝性狀與土壤水分梯度存在極強的相關(guān)關(guān)系，但這種相關(guān)關(guān)系需要建立在牧草自身抗旱系統(tǒng)未被破壞的條件下［19］，因此需要引入權(quán)衡值與分位數(shù)模型，消除因植物死亡或抗旱系統(tǒng)嚴重破壞的數(shù)據(jù)集影響，得到更加準確的土壤含水量閾值。本研究發(fā)現(xiàn)，牧草E 株高與綠葉數(shù)土壤含水量閾值均較低（株高：10%，綠葉數(shù)：5%）且檢驗組模型擬合系數(shù)也較高（株高：0.9954，綠葉數(shù)：0.7706），根據(jù)土壤干旱分級標(biāo)準［14］，土壤含水率5%以下時即為重旱地區(qū)，8%左右為中旱地區(qū)，本研究表明，牧草E 能夠適應(yīng)典型中重度干旱地區(qū)，可以作為優(yōu)質(zhì)引進牧草品種，同時也表明，利用權(quán)衡值與分位數(shù)模型可以有效消除極端數(shù)據(jù)影響，以此界定土壤水分閾值，可以為牧草引種以及建植牧草提供科學(xué)方法和理論依據(jù)。

3.3 生理指標(biāo)綜合評價

植物在遭受干旱脅迫時，會采取一系列生理機制來抵御干旱脅迫的影響，以確保其生長和生存［20-21］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的重要抗氧化酶，其作用是將超氧陰離子（O2-）轉(zhuǎn)化為氧氣（O2）和過氧化氫（H2O2），從而減輕生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激和氧化損傷［22-23］，過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase，POD）是兩種重要的抗氧化酶，它們都參與了生物體內(nèi)清除過氧化氫（H2O2）的過程，起到保護細胞的作用。通過測定豆科牧草3 種抗氧化酶活性，進行抗旱性評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牧草植物A 存在脅迫后期過氧化物酶活性上升，超氧化物歧化酶活性下降的現(xiàn)象，原因可能為植物受到外界脅迫時，POD 和SOD的活性通常會同時上升，以應(yīng)對氧化應(yīng)激的影響，但當(dāng)脅迫的程度加劇時，可能會出現(xiàn)POD 活性上升，而SOD 活性下降的現(xiàn)象，此外POD 和SOD 的活性也受到基因表達的調(diào)控，有些基因可以促進POD 的表達，同時抑制SOD的表達，從而導(dǎo)致POD 活性上升，而SOD 活性下降的現(xiàn)象。Fu 等［24］發(fā)現(xiàn)草地早熟禾（Poa pratensis）在長期的干旱脅迫下，3 種氧化酶活性均出現(xiàn)下降現(xiàn)象。DaCosta 等［25］也發(fā)現(xiàn)長期的干旱脅迫導(dǎo)致翦股穎屬草坪草超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性下降，本研究結(jié)果與其一致。牧草D 過氧化氫酶與超氧化物歧化酶活性存在整體下降的趨勢，可能因為牧草D 隨著脅迫時間延長，重度干旱脅迫積累了較多的超氧自由基與有害物質(zhì)，體內(nèi)氧化脅迫防御系統(tǒng)遭到了破壞，植物細胞抗氧化能力逐漸減弱，酶活性降低，對干旱的適應(yīng)能力明顯下降［26-27］。

利用隸屬函數(shù)法對5 種豆科牧草進行生理指標(biāo)抗旱性評價發(fā)現(xiàn)牧草抗旱性由大到小分別為牛枝子＞達烏里胡枝子＞小冠花＞鷹嘴紫云英＞草木樨狀黃芪，7 項指標(biāo)的隸屬函數(shù)值排序均不相同，這進一步說明了牧草苗期生長是受多因素影響的結(jié)果，因此，實現(xiàn)多變量和多目標(biāo)的控制，模糊整體可以消除系統(tǒng)中單個指標(biāo)的片面性，使得研究成果更加科學(xué)可靠。

結(jié)合各牧草土壤含水量閾值排序（鷹嘴紫云英＞牛枝子）與牧草生理指標(biāo)抗旱評價（牛枝子＞達烏里胡枝子＞小冠花＞鷹嘴紫云英＞草木樨狀黃芪）得出，鷹嘴紫云英與牛枝子不僅在重旱地區(qū)能夠維持自身農(nóng)藝性狀，且牛枝子抗旱生理機制也十分突出，因此試驗篩選出牛枝子作為引選牧草。

4 結(jié)論

1）干旱脅迫程度越高，牧草的農(nóng)藝性狀受到的負面影響就越大；不同牧草的基因型與抗旱機制不同，其耐受程度和范圍也有差異；適度的干旱可以促進抗旱牧草的生長發(fā)育并提高牧草質(zhì)量。

2）綠葉數(shù)-土壤含水量閾值分別為草木樨狀黃芪（17%）、牛枝子（10%）、鷹嘴紫云英（5%），株高-土壤含水量閾值分別為草木樨狀黃芪（16%）、牛枝子（14%）、鷹嘴紫云英（10%），其余牧草分位數(shù)模型均未通過顯著性檢驗。

3）5 種多年生豆科牧草抗旱性強弱表現(xiàn)為：牛枝子＞達烏里胡枝子＞小冠花＞鷹嘴紫云英＞草木樨狀黃芪。

4）抗旱生理綜合評價中牛枝子抗旱生理較強，且牛枝子土壤含水量閾值符合典型干旱區(qū)域土壤含水量，能夠適應(yīng)中度干旱區(qū)域，可以作為干旱區(qū)域的引進牧草。

5）相較于傳統(tǒng)牧草抗旱性生理評價，結(jié)合牧草表征性狀與并入土壤水分閾值概念更能綜合且全面的分析牧草抗旱性。