彭 也,許健成,余璐璐,何正權(quán),徐 飛

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,宜昌 443002;2.武漢生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究中心,武漢 430415)

煙草(NicotianatabacumL.)為茄科煙草屬一年生草本植物,在我國南北方均有種植,主要用作工業(yè)原料,以及用于藥用麻醉、催汗和鎮(zhèn)痛等方面,應(yīng)用范圍廣且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。煙草也是一種重要的模式植物,是研究細(xì)胞脫分化和再分化的理想材料,也是植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因功能鑒定分析的重要載體[2]。

愈傷組織培養(yǎng)是獲得再生植株和遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ),已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園林等各項(xiàng)生產(chǎn)中,在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程等研究領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用,因此,如何獲得優(yōu)良的愈傷組織對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及科學(xué)研究尤為重要。通過葉片外植體誘導(dǎo)煙草愈傷組織較為常見[3]。根和莖等組織也是適合誘導(dǎo)愈傷組織的材料[4]。采用葉片等作為外植體誘導(dǎo)愈傷,雖然技術(shù)成熟,但此類外植體來源耗時(shí)長,消毒過程中容易對(duì)外植體造成損傷,且操作過程污染率較高。若能以種子直接誘導(dǎo)愈傷,不僅能縮短獲得外植體的時(shí)間,且種皮能保護(hù)種子從而減少在消毒過程中的損傷,提高出愈率。然而較之小麥、玉米和水稻等作物,煙草利用種子誘導(dǎo)愈傷組織的技術(shù)體系鮮有報(bào)道。

愈傷組織的誘導(dǎo)除了受外植體的影響,還與培養(yǎng)基的類型和外源激素成分、比例等因素有關(guān)[5]。在培養(yǎng)植物愈傷組織的過程中,激素發(fā)揮著重要的作用。以往研究中,愈傷組織誘導(dǎo)多以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,再施加5種常用植物激素作為誘導(dǎo)劑,包括生長素類(auxins)的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophe noxyacetic acid,2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)和3-吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,IBA),以及細(xì)胞分裂素類(cytokinins)的6-芐氨基嘌呤(6-benzylami nopurine,6-BA)和激動(dòng)素(kinetin,KT)[6-9]。不同外植體誘導(dǎo)愈傷的最佳激素配比不盡相同[8-9]。換言之,在培養(yǎng)基中引入不同比例的生長素和細(xì)胞分裂素,會(huì)影響誘導(dǎo)愈傷組織的成功率。

本研究以煙草種子為研究對(duì)象,探究不同濃度的2,4-D和6-BA激素配比對(duì)煙草愈傷組織形成的影響,并對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)的比較觀察,旨在為利用煙草種子直接誘導(dǎo)愈傷組織提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的煙草種子為普通煙草(NicotianatabacumL.cv NC89)。新鮮收取或儲(chǔ)藏期不超過3個(gè)月的種子用于研究。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度2,4-D和6-BA兩種激素,用NaOH將培養(yǎng)基pH值調(diào)整到5.8～6.0。將配好的培養(yǎng)基高壓滅菌(0.15 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min)后備用。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究中發(fā)現(xiàn),高濃度(>2.0 mg/L)的2,4-D和6-BA不利于種子誘導(dǎo)出愈傷組織,為進(jìn)一步明確兩者對(duì)種子誘導(dǎo)愈傷的最佳條件,本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了6個(gè)水平的2,4-D和6個(gè)水平的6-BA,共12種組合進(jìn)行比較與分析。具體激素濃度處理方案如表1所示。

表1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的激素組合

1.2.2 芽分化培養(yǎng)基

以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂固體培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,添加0.3 mg/L NAA+2.35 mg/L 6-BA,用NaOH將培養(yǎng)基pH值調(diào)整到5.8～6.0。將配好的培養(yǎng)基高壓滅菌(0.15 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min)后備用。

1.2.3 煙草種子的預(yù)處理

取適量煙草種子,用蒸餾水浸泡24 h后,用84消毒液消毒7～8 min,然后用無菌水清洗5次。將消毒后的煙草種子均勻接種在不同激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)入16 h光照[60～100 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗,(25±1) ℃條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.4 煙草愈傷組織觀察、統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)時(shí)記錄煙草愈傷組織誘導(dǎo)情況,并在體式顯微鏡(SteREO Discovery.V20,卡爾蔡司管理有限公司)下觀察愈傷組織生長狀況,比較不同激素配比誘導(dǎo)煙草種子愈傷組織情況的差異。

統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基上煙草種子誘導(dǎo)形成愈傷組織的數(shù)量,并計(jì)算誘導(dǎo)率;誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織的種子數(shù)/接種的種子數(shù))×100%。本實(shí)驗(yàn)中,以愈傷組織直徑≥1 mm定義為誘導(dǎo)出了愈傷組織。

1.2.5 煙草愈傷組織切片觀察

取誘導(dǎo)出的煙草愈傷組織,經(jīng)FAA固定后,依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、展片、脫蠟、番紅固綠染色和封片操作后制成石蠟切片,并使用光學(xué)顯微鏡采集圖像信息[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)煙草種子出愈速率的影響

為探究不同激素配比對(duì)煙草種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響,采用不同濃度的2,4-D和6-BA進(jìn)行組合處理煙草種子。結(jié)果表明:不同激素配比均能誘導(dǎo)出煙草種子愈傷組織,但出愈速度及愈傷形態(tài)存在明顯差異。種子在不含激素的培養(yǎng)基中正常生長,葉片和根系長勢好(對(duì)照組材料);相比之下,在僅含有1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,種子萌發(fā)后的幼苗整體呈水漬狀,愈傷組織小且質(zhì)量差(圖1)。在僅含有1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中,種子萌發(fā)后未快速進(jìn)入愈傷組織生長狀態(tài),而是呈現(xiàn)出較為明顯的根系發(fā)育,雖然其生長比對(duì)照組緩慢(圖1)。值得注意的是,種子在1.0 mg/L 2,4-D+(0.5～2.0)mg/L 6-BA激素配比條件下未見根系的發(fā)育,而胚軸基部逐漸分化出愈傷組織(圖1)。同樣,種子在1.0 mg/L 6-BA+(0.5～2.0)mg/L 2,4-D激素配比培養(yǎng)條件下也能逐漸培養(yǎng)出愈傷組織(圖1)。

空白對(duì)照(CK)及不同激素配比處理7 d(a)和14 d(b)愈傷組織生長狀態(tài),濃度(mg/L)。

統(tǒng)計(jì)愈傷組織出愈速率發(fā)現(xiàn),雖然培養(yǎng)兩周后2,4-D和6-BA組合均能誘導(dǎo)煙草種子長出愈傷,且出愈率為100%,但在不同2,4-D和6-BA濃度配比培養(yǎng)基上長出愈傷的速度和大小不同。煙草種子在1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,搭配0.5～2.0 mg/L 6-BA可較快誘導(dǎo)出愈傷組織(表2);當(dāng)用1.0 mg/L 2,4-D搭配0.1 mg/L 6-BA培養(yǎng)時(shí),種子出愈速率較慢。相比之下,煙草種子在1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中,搭配0.1～2.0 mg/L 2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織能力較差,在培養(yǎng)的前7 d出愈率低于40%(表2);盡管如此,1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D在10 d以后出愈率明顯提升,愈傷大小和質(zhì)量也較好。

表2 不同激素組合對(duì)出愈率的影響

2.2 不同激素配比對(duì)愈傷組織生長的影響

進(jìn)一步比較分析不同激素配比對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織后期生長的影響,將獲得的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)至21 d后,通過愈傷組織的致密性、顏色、直徑和鮮重綜合評(píng)估愈傷組織的質(zhì)量。結(jié)果表明,在不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中愈傷組織質(zhì)量存在顯著差異。在僅含有1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,幼苗下胚軸及根部仍保持著明顯的玻璃化現(xiàn)象,其膨大的下胚軸及根部呈透明水浸狀,愈傷組織生長最慢,直徑和鮮重在所有處理組中最小,最終無法呈現(xiàn)出良好的愈傷組織(圖2,表3);在僅含有1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中,幼苗發(fā)育有短且粗壯的根系,根部周圍產(chǎn)生少量的白色松散狀愈傷組織,誘導(dǎo)出的愈傷組織體積小,質(zhì)量不佳(圖2)。當(dāng)培養(yǎng)基中含有1.0 mg/L 2,4-D搭配0.5～1.0 mg/L 6-BA時(shí),誘導(dǎo)出的愈傷組織長勢較好,這些愈傷組織的輪廓層次較清晰,呈淡綠色半透明堆塊狀,在體積和質(zhì)量上與僅使用2,4-D激素誘導(dǎo)的愈傷相比都有明顯優(yōu)勢(圖2)。相比之下,1.0 mg/L 6-BA搭配0.5～2.0 mg/L 2,4-D處理?xiàng)l件下,愈傷組織塊也進(jìn)一步膨大,但較為松散,尤其是2,4-D濃度高于1.5 mg/L時(shí)(圖2)。

空白對(duì)照(CK)及愈傷組織培養(yǎng)至21 d后的顯微觀察;隨機(jī)取3株材料用體式顯微鏡觀察并拍照;濃度(mg/L)。圖中標(biāo)尺長度為2 mm。

表3 不同激素組合誘導(dǎo)愈傷組織的比較分析

總體來看,當(dāng)培養(yǎng)基中含1.0 mg/L 2,4-D時(shí),隨著6-BA的濃度減小愈傷組織的玻璃化程度會(huì)增加;當(dāng)培養(yǎng)基中含有1.0 mg/L 6-BA,隨著2,4-D濃度的增加愈傷組織越松散(圖2,表3)。其中,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA組合誘導(dǎo)出的愈傷組織淡綠色,堆塊狀,體積較大;0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA組合誘導(dǎo)出的愈傷組織淡綠色,較致密。綜合分析,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA這兩種激素配比是誘導(dǎo)煙草愈傷組織的最佳組合。

2.3 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的分化

為進(jìn)一步分析獲得的愈傷組織是否具有可誘導(dǎo)分化能力,移取培養(yǎng)30 d的愈傷組織到芽分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果表明,分化培養(yǎng)7 d后,取自0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中生長的愈傷組織開始分化出不定芽[圖3(a)]。相比之下,取自1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中生長的愈傷組織未分化出芽,但愈傷組織的體積持續(xù)增大[圖3(b)]。將這兩種愈傷組織進(jìn)行切片觀察發(fā)現(xiàn),前者具有分生細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu),其細(xì)胞體積較小,排列規(guī)整緊密且邊界明顯,具有旺盛的細(xì)胞分裂能力,屬于胚性細(xì)胞[圖3(c)];后者細(xì)胞的排列不規(guī)則,細(xì)胞核較小,屬于非胚性細(xì)胞[圖3(d)和(e)]。結(jié)果表明,0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比可用于誘導(dǎo)致密型胚性愈傷組織,適合用于再分化等實(shí)驗(yàn)。1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比可用于誘導(dǎo)非胚性愈傷組織,這種愈傷組織可長期保持旺盛的生長。

3 討論與結(jié)論

外植體的選擇及愈傷誘導(dǎo)能力是影響煙草基因工程進(jìn)展和種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要因素。雖然離體葉片作為外植體誘導(dǎo)煙草愈傷組織的技術(shù)已較為成熟,但仍存在誘導(dǎo)率低、前期準(zhǔn)備周期長等局限性。以往的研究表明,外植體離合子胚階段越遠(yuǎn),就需要越多的細(xì)胞重編程過程形成胚性愈傷;合子胚中的細(xì)胞很容易發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生,也具有較強(qiáng)的分裂能力,是誘導(dǎo)愈傷組織較合適的外植體材料[5,12-13]?？紤]到成熟種子含有合子胚,本實(shí)驗(yàn)以成熟煙草種子作為外植體材料,探索并建立了直接利用種子誘導(dǎo)出愈傷組織的體系,尤其是能分化出胚性愈傷組織的誘導(dǎo)方法。

基于本研究,在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定濃度范圍(0.1～2.0 mg/L)的2,4-D和6-BA可促進(jìn)煙草種子向愈傷組織生長,但誘導(dǎo)出的愈傷組織大小和質(zhì)量差異明顯。相比之下,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的組合條件最適合煙草種子誘導(dǎo)松散的非胚性愈傷組織,0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的組合條件下最適合煙草種子誘導(dǎo)致密的胚性愈傷組織。本研究結(jié)果與利用煙草葉片等外植體在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)所適用的激素濃度存在明顯差異。以往研究顯示,煙草葉片誘導(dǎo)愈傷時(shí)采用的2,4-D激素濃度為1.0～2.0 mg/L[9,14];而關(guān)于6-BA的激素濃度選擇,董行健等[15]采用0.20 mg/L 6-BA,而岳彩鵬等[16]采用0.5 mg/L 6-BA誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織。這些濃度對(duì)本研究中種子誘導(dǎo)愈傷也適用,但不是最佳的濃度比例,表明同一材料不同組織部位愈傷組織的誘導(dǎo)受激素比例的差異調(diào)控。

植物激素對(duì)體外植物組織培養(yǎng)有重要的影響,其中,生長素和細(xì)胞分裂素一直被認(rèn)為是誘導(dǎo)外植體生成愈傷組織的關(guān)鍵激素,前者主要通過誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性形成愈傷組織,后者主要刺激愈傷組織再分化形成離體苗[17-19]。本實(shí)驗(yàn)采用的生長素和細(xì)胞分裂素分別是2,4-D和6-BA,兩者均是組織培養(yǎng)中最常用的激素,對(duì)啟動(dòng)植物細(xì)胞脫分化過程十分重要[6,19]。本研究發(fā)現(xiàn)僅使用2,4-D或6-BA處理煙草種子時(shí),誘導(dǎo)生成的愈傷組織呈水浸狀透明色,無法發(fā)育成質(zhì)量良好的愈傷塊。當(dāng)在培養(yǎng)基中同時(shí)添加2,4-D和6-BA后才能誘導(dǎo)出質(zhì)量較好的愈傷組織,這表明兩種激素在愈傷組織的誘導(dǎo)過程中存在協(xié)調(diào)作用[6,17,20]。盡管如此,不同外植體愈傷誘導(dǎo)的最佳激素配比不盡相同,這其中的生化、分子機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。