楊婭琳,武自強,劉 麗,張東華,馬煥成,伍建榕

(1.西南林業(yè)大學 生物多樣性保護學院 云南省高校森林災害預警控制重點實驗室,昆明 650224;2.西南林業(yè)大學 林學院 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室,昆明 650224)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是中國特有的木本油料植物,屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)常綠小喬木或灌木,為木本油料植物[1-2]。在山地上種植,可以綠化荒山,提高森林覆蓋率,保持水土,提高土壤肥力。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)不僅是推動綠色發(fā)展的重要推手,也是保障國家糧油安全、助力國民健康長壽的綠色產(chǎn)業(yè)[3-4]。2020—2021年在云南省德宏傣族景頗族自治州大面積油茶種植基地調(diào)查發(fā)現(xiàn),當?shù)赜捎陂L期集約化種植、品種單一和不良環(huán)境條件的影響,炭疽病發(fā)生嚴重,致油茶落葉和落果,農(nóng)民經(jīng)濟損失慘重。

叢枝菌根真菌(AMF)菌絲可侵染絕大多數(shù)陸生植物的根系,通過產(chǎn)生叢枝和泡囊連接植物根系與AMF,形成基于雙向養(yǎng)分交換的共生關(guān)系[5-6]。大量研究表明,AMF能夠促進植物生長,改善植物品質(zhì),增強植物對病蟲害和非生物因素脅迫的抵抗等[8-9]。張鈺等[10]發(fā)現(xiàn)接種AMF異形根孢囊霉Rhizophagusirregularis能增強楊樹抗?jié)儾〉哪芰?高巖等[11]發(fā)現(xiàn)接種AMF能顯著降低雞蛋花干腐病的發(fā)病率和感病指數(shù);劉芳潔[12]發(fā)現(xiàn)接種AMF可以提高紫蘇對根腐病的抗性等。AMF可通過競爭減少病原菌的侵染位點,顯著降低死株率、發(fā)病率和病情指數(shù)[13]。機理研究表明,AMF可以誘導植物迅速產(chǎn)生防御酶類,如過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等。此外,AMF定殖能夠誘導植株合成內(nèi)源信號物質(zhì),如生長素、赤霉素、水楊酸、茉莉酸等,激活植物防御體系,從而提高其抗病性[14]。

油茶感染炭疽病后,其根際土壤 AMF 群落如何發(fā)生變化尚不清楚。本研究以德宏州不同樣地健康植株、發(fā)病植株根系和根區(qū)土壤為研究材料,依孢子形態(tài)和分子特征[7]鑒定油茶根區(qū)土壤 AMF 的種類,并分析油茶根際土壤 AMF 群落組成、多樣性及結(jié)構(gòu)對炭疽病發(fā)病的影響,為后續(xù)應用 AMF 防控油茶炭疽病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

德宏州地處云南省西部邊陲,位于北回歸線以北,東經(jīng)97°31′～98°43′,北緯23°50′～25°20′,屬南亞熱帶季風氣候,年降水量1 400～1 700 mm,年平均氣溫為18.4～20 ℃,干旱指數(shù)0.4～1.2,雨量充沛,年溫差小,日溫差大,霜期短。選擇德宏州的中營村、翁冷村、平山村3個樣地,土壤類型均為紅壤(表1)。

表1 采樣地基本情況

1.2 油茶發(fā)病率及病情指數(shù)的調(diào)查

2019和2020年7—9月,選擇10年生的白花油茶,每個樣點同一地塊隨機選取健康植株和發(fā)病植株各10株,每株油茶按照東南西北4個方向各抽查30片葉片。發(fā)病率=感病植株(或葉片)數(shù)/調(diào)查總植株(或葉片)×100%。病情分級標準如下:0級——植物葉片健康無病斑;Ⅰ級——病斑面積占總面積的0～25%;Ⅱ級——病斑面積占總面積的26%～50%;Ⅲ級——病斑面積占總面積的51%～75%;Ⅳ級——75%以上面積壞死。經(jīng)課題組實驗鑒定,本次油茶炭疽病的主要病原菌為暹羅炭疽菌Colletotrichumsiamense、喀斯特炭疽菌Colletotrichumkarstii和膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides等[15]。

1.3 樣品采集及處理

分別選取健康和發(fā)病植株(葉部明顯輪紋狀病斑,果實病斑明顯,有的植株甚至枯死)各10株。去除林下腐殖質(zhì)即土壤表面的枯落物,采取5～30 cm土層的根際土壤1 kg左右裝入自封袋中(各土樣均為東西南北方向各取一部分,混勻)。采集對應植株帶須根的根系,選取距離植物主干 50 cm的根系,東西南北方向各采集5～20 cm,再將根系放置于FAA溶液(福爾馬林5 mL、冰醋酸5 mL、70%乙醇90 mL,用時稀釋1倍)中,貼好標簽并帶回實驗室4 ℃保存,用于AMF侵染率的測定;土壤樣品風干后保存,用于AMF分離鑒定[16]。

1.4 AMF分離鑒定

(1)形態(tài)學鑒定。稱取20 g土壤樣品,放置燒杯內(nèi)用水浸泡過夜,采用濕篩沉淀法分離AMF孢子,將分離得到的孢子置于立體顯微鏡下觀察并計數(shù)。將孢子置于光學顯微鏡下,采用伍建榕等[16]的方法觀察孢子形態(tài),進行形態(tài)學鑒定。

(2)分子鑒定。采用單孢子提取法,在體視鏡下挑取單個完整飽滿的AMF孢子,將孢子破壁后加入30 μL TE Buffer和20%螯合樹脂(Chelex-100),沸水浴(95 ℃)10 min,冰浴10 min,10 000 r/min離心5 min,取15～20 μL上清液即DNA。參考龍良鯤等[17]和劉潤進等[9]的方法進行PCR擴增(巢氏PCR)、電泳。PCR引物(表2)參考Maarte等[18],由上海生工生物工程有限公司合成,第一輪PCR反應體系50 μL:DNA模板4 μL,上下游引物各2.5 μL,2×TaqPCR Mix 16.2 μL,無菌水24.8 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,循環(huán)30次;72 ℃再延伸10 min。將第一輪PCR反應產(chǎn)物稀釋5倍后作為第二輪擴增模板,第二輪PCR反應體系50 μL:DNA模板2 μL,上下游引物各2.5 μL,2×TaqPCR Mix 20.2 μL,無菌水22.8 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,循環(huán)30次;72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送擎科生物科技有限公司測序。測序結(jié)果通過MAARJAM的Blast檢索系統(tǒng)進行同源序列搜索。

表2 供試引物序列

1.5 AMF菌根定殖率檢測

將浸泡在FAA溶液中的根段取出,用蒸餾水清洗4～5次,用苯胺藍染色法對根系進行水浴解離、酸化、染色、脫色[9,19]。所有處理完成后,選取油茶根系的二級側(cè)根,將每個根段裁切為1 cm左右的小段,保證選取的樣本可以裁切30個根段即可。將已經(jīng)處理完全的根段放置在顯微鏡下進行鏡檢,待觀察到根段組織中的AMF結(jié)構(gòu)時,拍照并計算其定殖率[20]。

菌根真菌定殖率=∑(0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+……+100%×根段數(shù))/觀察總根段數(shù)

1.6 AMF多樣性分析

物種豐富度(SR)指油茶根際土樣中AMF孢子數(shù)量[21],并按Margalef豐富度指數(shù)[D=(S-1)/InN]來計算,Shannon-wiener多樣性指數(shù)(H′)[22]按公式[H′=∑PiInPi(Pi=Ni/N)]來計算,式中Pi=Ni/N,Ni為種i的數(shù)量,N為土樣中AMF孢子的總數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003和SPSS 22.0等統(tǒng)計分析軟件,對所有試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。用SPSS 22.0軟件進行兩組t檢驗,以P<0.05表示差異程度,雙變量相關(guān)分析發(fā)病率、病情指數(shù)和AMF之間的關(guān)系。利用MEGA6對目的序列與相關(guān)菌株序列進行分析并構(gòu)建Neighbor-Joining發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶炭疽病的發(fā)病率、病情指數(shù)、孢子密度和定殖率

3個樣地的油茶分別形成了不同程度的菌根共生體(泡囊、菌絲和叢枝),見圖1。對各個樣地的AMF定殖率、孢子密度、發(fā)病率及病情指數(shù)進行調(diào)查,結(jié)果顯示,中營村的健康植株和感病植株土壤樣本的孢子密度分別為37.98個/g和18.09個/g,總定殖率分別為10.80%和7.28%,該樣地的孢子密度和總定殖率最低。翁冷村的健康植株和感病植株土壤樣本的孢子密度分別為82.28個/g和32.55個/g,總定殖率分別為23.29%和9.22%。平山村的健康植株和感病植株的孢子密度分別為80.01個/g和47.89個/g,總定殖率分別為25.08%和13.06%(表3)。3個樣地健康植株和感病植株的土壤樣品AMF孢子密度及總定殖率均有顯著差異。孢子密度和菌根定殖率最低的樣地,發(fā)病率和病情指數(shù)最高,分別是58.06%和43.53,孢子密度和定殖率最高的樣地,發(fā)病率和病情指數(shù)最低,分別是39.40%和25.37。

(a)泡囊、菌絲;(b)叢枝。

表3 油茶炭疽病病害及根際AMF調(diào)查結(jié)果

2.2 AMF孢子分子鑒定結(jié)果

通過巢式PCR擴增出AMF相應的特異性DNA序列,PCR產(chǎn)物的DNA片段大小為750 bp(圖2),符合AMF分子鑒定要求?；谀繕藚^(qū)段構(gòu)建油茶根際土壤AMF的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),AM-1、AM-2、AM-3、AM-4、AM-5、AM-6、AM-8、AM-14、AM-15、AM-16、AM-18屬于類球囊霉屬Paraglomus,AM-9、AM-10、AM-11、AM-12、AM-17屬于球囊霉科Glomeraceae,AM-7屬于球囊霉屬Glomus,AM-13屬于無梗囊霉屬Acaulospora。

圖2 AMF孢子擴增目的片段電泳圖

2.3 AMF孢子形態(tài)

通過分子鑒定結(jié)果,結(jié)合形態(tài)學特征將孢子鑒定到種,AM-1為Paraglomussp.1,AM-3、AM-4、AM-5、AM-6為Paraglomussp.2,AM-2、AM-8為隱類球囊霉Paraglomusoccultum,AM-14、AM-15、AM-16、AM-18為Paraglomussp.3,AM-9、AM-10為黃金球囊霉Glomusaureum,AM-11為黑球囊霉Glomusmelanosporum,AM-12、AM-17為縮球囊霉Glonusconstrictum,AM-7為幼套球囊霉Glonusetunicatum,AM-13為刺無梗囊霉Acaulosporaspinosa;從3個樣地中通過形態(tài)鑒定分離出孢子9屬24種(圖4,表4),包括無梗囊霉屬Acaulospora的4種,雙型囊霉屬Ambispora的1種,近明球囊霉屬Claroideoglomus的1種,多樣孢囊霉屬Diversispora的1種,巨孢囊霉屬Gigaspora的1種,球囊霉屬Glomus的11種,根孢囊霉屬Rhizophagus的2種,類球囊霉屬Paraglomus的2種,盾巨孢囊霉屬Scutellospora的1種。結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學鑒定,本次鑒定孢子歸屬9屬26種。在3個樣地中,中營村健康油茶土樣中共分離鑒定出孢子5屬20種,炭疽病發(fā)病植株土樣中共分離鑒定出孢子4屬18種。翁冷村健康油茶土樣中共分離鑒定出孢子7屬21種,炭疽病發(fā)病植株土樣中共分離鑒定出孢子7屬19種。平山村健康油茶土樣中共分離鑒定出孢子8屬24種,炭疽病發(fā)病植株土樣中共分離鑒定出孢子7屬20種。

(a)細凹無梗囊霉;(b)瑞氏無梗囊霉;(c)刺無梗囊霉;(d)淺窩無梗囊霉;(e)芬蘭雙型囊霉;(f)近明球囊霉;(g)扭形多樣孢囊霉;(h)易誤巨孢囊霉;(i)縮球囊霉;(j)黃金球囊霉;(k)棒球囊霉;(l)弗墨球囊霉;(m)多梗球囊霉;(n)凹坑球囊霉;(o)網(wǎng)狀球囊霉;(p)幼套球囊霉;(q)黑球囊霉;(r)大果球囊霉;(s)變形球囊霉;(t)隱類球囊霉;(u)P.sp.1.;(v)明根孢囊霉;(w)木薯根孢囊霉;(x)美麗盾巨孢囊霉。

表4 油茶根際AMF群落系統(tǒng)分類表

2.4 AMF豐富度和多樣性

中營村樣點健康植株土樣與感病植株土樣的物種豐富度最低,分別為0.84和0.68,翁冷村樣點分別為1.39和1.21,平山村樣點分別為1.39和1.21。3個樣地的物種豐富度均無顯著差異。中營村樣點健康植株土樣與感病植株土樣的Shannon-winer多樣性指數(shù)(H′)分別為0.97和0.96,翁冷村樣點分別為1.32和1.25,平山村分別為1.40和1.21(表5),可以看出,油茶炭疽病在發(fā)病后,AMF孢子的Shannon-winer多樣性指數(shù)(H′)均呈下降趨勢,但差異不顯著。同時發(fā)現(xiàn),孢子豐富度越高,多樣性指數(shù)也越高,反之則越小。

表5 油茶根際土壤叢枝菌根真菌物種豐度和多樣性指數(shù)

2.5 相關(guān)性分析結(jié)果

AMF定殖率與病情指數(shù)呈現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與發(fā)病率呈現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系(P<0.01);孢子密度、物種豐富度與油茶炭疽病的發(fā)病率與病情指數(shù)呈現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系(P<0.01);多樣性指數(shù)與油茶炭疽病的發(fā)病率與病情指數(shù)呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)關(guān)系(P<0.05),即AMF菌根定殖率、孢子密度、豐富度、多樣性指數(shù)越高,病情指數(shù)越小,發(fā)病率越低(表6)。

表6 發(fā)病率、病情指數(shù)與AMF各指標之間的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

通過對發(fā)病程度不同的3塊樣地土壤樣品采用濕篩沉淀法進行AMF孢子的分離,結(jié)合形態(tài)學和分子學對AMF孢子進行鑒定,共分離得到9屬26種AMF孢子。其中球囊霉屬Glomus所占比例最多,是土壤中的優(yōu)勢屬,與相關(guān)報道[23-25]的研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)油茶根系中AMF的定殖率與油茶炭疽病發(fā)病率和病情指數(shù)呈現(xiàn)顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.01),說明AMF的定殖能在一定程度上減少油茶炭疽病的發(fā)生,能對植物病害的發(fā)展起到一定的抑制作用,這與李淑君等[26]、尼瑪此姆等[20]的結(jié)果一致,Ding等[27]也表明AMF的定殖可以延緩野豌豆炭疽病的發(fā)生,降低植物的發(fā)病率和病情指數(shù)。研究還發(fā)現(xiàn)AMF的孢子密度與油茶炭疽病的發(fā)病率以及病情指數(shù)呈現(xiàn)顯著負相關(guān)性(P<0.01),即孢子密度越大則病害發(fā)病率及病情指數(shù)越小。研究發(fā)現(xiàn)油茶感病后根區(qū)土壤內(nèi)AMF的豐富度與多樣性降低,且豐富度和多樣性與發(fā)病率和病情指數(shù)有負顯著相關(guān)性,即AMF孢子種類越豐富,則油茶炭疽病發(fā)病程度越低。相關(guān)研究也表明,增加AMF的孢子種類多樣性,能降低植物的發(fā)病率,提高植物的抗病性[11]。

綜上所述,AMF的孢子密度、定殖率及多樣性均能夠增強油茶的抗病能力。故油茶接種AMF可以有效地防治油茶炭疽病,具有較好的應用前景。AMF提高植物抗病性是一個復雜的作用過程,對植物、病原菌、土壤及AMF之間的相互作用機制有待進一步研究,才能充分發(fā)揮AMF的生防作用。