張世凱,徐 清,劉 林,楊正友,趙鳳春

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,泰安 271018)

近年來,抗生素的耐藥性已經(jīng)成為威脅人類健康的最嚴(yán)重的挑戰(zhàn)之一[1]。同時(shí),癌癥成為非傳染性疾病引起的過早死亡的主要原因之一[2]。因此,尋找新的治療感染和癌癥的藥物迫在眉睫。另一方面,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中化學(xué)農(nóng)藥的濫用會(huì)對(duì)人類生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生惡劣影響,還會(huì)導(dǎo)致病蟲害抗性等問題。從微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中開發(fā)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性顯著的先導(dǎo)化合物現(xiàn)已成為人類尋找和開發(fā)新型農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)[3]。

在過去的幾十年里,植物內(nèi)生真菌因具有產(chǎn)生多種次生代謝物的能力而受到廣泛關(guān)注[4]。其所產(chǎn)生的天然產(chǎn)物具有多種生物活性,如抗菌、抗寄生蟲、抗氧化、免疫抑制劑和抗癌活性等[5-8]。白花前胡(Peucedanumpraeruptorum)是傘形科(Umbellales)前胡屬(Peucedanum)的多年生草本植物[9],是我國一種傳統(tǒng)中藥材,具有散風(fēng)清熱、降氣化痰的功效,臨床上用于風(fēng)熱咳嗽痰多、痰熱喘滿、咳痰等[10]。研究表明,白花前胡中主要含有香豆素類化學(xué)成分,其類型包括簡單香豆素、呋喃香豆素和吡喃香豆素,此外還含有揮發(fā)油、甾醇和有機(jī)酸等化學(xué)成分[11-12];這些成分具有多種良好的生物活性,如抗真菌、抗氧化、抗腫瘤和抗炎等[13]。

一些藥用植物內(nèi)生菌因長時(shí)間與宿主協(xié)同進(jìn)化,可產(chǎn)生某些與宿主植物相似或相同的代謝物質(zhì)[14]。因此,從白花前胡內(nèi)生菌中有望獲得具有抗菌和抗腫瘤的生物活性物質(zhì)。目前,關(guān)于白花前胡內(nèi)生真菌的報(bào)道較少,為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌種資源,本研究對(duì)白花前胡內(nèi)生菌進(jìn)行分離,對(duì)其粗提物進(jìn)行抗菌和抗腫瘤活性初篩,并進(jìn)一步選取一株活性較好的菌株進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植株、菌株及細(xì)胞

2020年10月在山東省泰安市岱岳區(qū)桃花峪采集新鮮健康、生長旺盛的白花前胡,植物樣品采集后放入干凈的聚乙烯袋中避光保存于4 ℃冰箱。

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)、腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisATCC 13076)、大腸埃希氏菌(EscherichiacoliATCC 8739)和銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)等4種細(xì)菌,禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)和白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)等4種真菌,人肺癌細(xì)胞A549和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231兩種癌細(xì)胞均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器

MTT溶液。稱取0.1 g MTT粉末,用20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS,10 mmol/L)溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌,配好后放于棕色瓶中,于4 ℃冰箱避光保存。

麥芽汁液體培養(yǎng)基(ME)。稱取20 g生麥芽,加入適量去離子水煮沸30 min,4層脫脂棉紗布過濾,濾液中添加20 g蔗糖、1 g蛋白胨,溶解后調(diào)整pH值為7.2,定容至1 L,分裝到錐形瓶中,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

綠豆培養(yǎng)基。稱取綠豆20 g洗凈,加入適量去離子水煮沸30 min,用4層脫脂棉紗布過濾,定容至1 L,pH自然,分裝到錐形瓶中,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

水瓊脂。稱取1.5 g瓊脂粉,加去離子水定容至100 mL,轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

半制備高效液相色譜儀FL-H050GS( Agela Phenomenex公司);多功能酶標(biāo)儀CLARIO star(BMG LABTECH 公司);臺(tái)式全溫振蕩器THZ-C-1(蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);光學(xué)顯微鏡SK2009U8(深圳市賽克數(shù)碼科技開發(fā)有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱HF151(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離

采用組織塊法進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離[15]:將白花前胡樣品用去離子水沖洗干凈,用0.05% Tween-20溶液浸泡60 s,然后用5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min,再用2.5%硫代硫酸鈉溶液浸泡10 min,最后用70%乙醇浸泡3 min。將樣品用無菌水沖洗3次,切成1 cm×1 cm的小塊,接種在含有雙抗的PDA平板上(100 μg/mL氨芐西林鈉,50 μg/mL鏈霉素),取100 μL最后一次沖洗的無菌水涂布于PDA平板上作為對(duì)照組,28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d。待植物組織表面長出菌絲時(shí),采取尖端菌絲挑取法,在新鮮PDA培養(yǎng)基上四區(qū)劃線,反復(fù)分離純化培養(yǎng),直到純化出單菌落。

1.2.2 內(nèi)生真菌的發(fā)酵及粗提物的制備

將保藏的菌種于PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,隨后把長滿菌絲的瓊脂劃分為1 cm×1 cm的菌塊,取5塊轉(zhuǎn)接到100 mL ME中,28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d,得到菌種發(fā)酵液。發(fā)酵液中加入等體積乙酸乙酯萃取兩次,將上層萃取液合并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得到粗提物,將粗提物稱重后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 粗提物的抑菌活性測(cè)定

使用管碟法測(cè)定粗提物對(duì)病原細(xì)菌和病原真菌的抑制作用[16],在培養(yǎng)皿中倒入10 mL的水瓊脂,待其凝固后均勻放置4～5個(gè)牛津杯;隨后將150 μL的病原菌液(細(xì)菌菌懸液或真菌孢子液)和15 mL融化后的固體培養(yǎng)基混合后倒入平板內(nèi)(加入菌液前培養(yǎng)基需冷卻至50 ℃左右,細(xì)菌使用LB培養(yǎng)基,真菌使用PDA培養(yǎng)基),培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯。實(shí)驗(yàn)組每孔加入50 μL粗提物溶液(20 mg/mL,甲醇溶解);抗細(xì)菌或抗真菌陽性對(duì)照孔加入50 μL氨芐西林鈉溶液(10 mg/mL)或制霉素溶液(2萬單位/mL);陰性對(duì)照孔加入50 μL甲醇;37 ℃靜置培養(yǎng)12 h(抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn))或28 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d(抗真菌實(shí)驗(yàn));采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,觀察對(duì)病原菌的抑菌效果。

菌液制備方法如下:將病原細(xì)菌于固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,用接種環(huán)挑取單菌落接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,制得病原細(xì)菌懸液。將病原真菌于PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,取5塊1 cm×1 cm的菌塊,加入到100 mL綠豆培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5～7 d,得到病原真菌孢子液。

1.2.4 粗提物的細(xì)胞毒活性鑒定

采用MTT法測(cè)定粗提物的細(xì)胞毒活性[17]。每孔加入100 μL細(xì)胞稀釋液(1×DMEM,10% FBS,4 000 cells/well),在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h,每孔再添加80 μL培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加20 μL粗提物稀釋液(粗提物終濃度為100 μg/mL),陽性對(duì)照組加入20 μL鹽酸阿霉素(終濃度為0.05 μg/mL),陰性對(duì)照組加入20 μL培養(yǎng)基;混勻后培養(yǎng)48 h,吸出培養(yǎng)液,緩慢加入200 μL PBS洗滌一次,然后每孔加入含20% MTT的培養(yǎng)液100 μL培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩孵育10 min,測(cè)定570 nm下吸光度。另設(shè)置空白對(duì)照組,孔中只含有培養(yǎng)基不含細(xì)胞。

1.2.5 活性菌株鑒定

將菌種接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,觀察菌株的菌落和菌絲形態(tài)特征,使用光學(xué)顯微鏡,觀察菌絲和分生孢子等顯微形態(tài)。提取基因組DNA,送至青島睿博興科公司進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測(cè)序,將所得的ITS序列與GenBank網(wǎng)站中已知菌株的序列進(jìn)行Blast分析,從中獲得與菌株ITS具有相似同源性典型菌株的ITS的序列,用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 活性菌株化合物分離鑒定

對(duì)菌株活性最好的一株菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵,經(jīng)過萃取、旋蒸濃縮得到粗提物浸膏。首先使用硅膠柱層析,以石油醚和乙酸乙酯作為洗脫劑,按照體積比石油醚∶乙酸乙酯為10∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例依次進(jìn)行洗脫,對(duì)粗提物進(jìn)行初步分離,后續(xù)利用C18反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析及半制備HPLC等方法對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。將單體化合物用500 μL氘代丙酮或氘代DMSO進(jìn)行溶解,轉(zhuǎn)移到干凈的核磁管中,測(cè)定化合物的1H NMR譜和13C NMR譜,通過對(duì)比文獻(xiàn)確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離及粗提物的制備

從新鮮健康白花前胡中分離出內(nèi)生真菌7株,編號(hào)為bhqh-1～bhqh-7,菌株形態(tài)如圖1所示。

圖1 7株白花前胡內(nèi)生真菌菌株形態(tài)圖

各菌株發(fā)酵后制備粗提物,粗提物的產(chǎn)量、顏色和狀態(tài)如表1所示。結(jié)果表明不同菌株粗提物產(chǎn)量存在較大的差異。bhqh-2、5、7的菌落形態(tài)相似,其粗提物的產(chǎn)量也較高。其中bhqh-2的粗提物產(chǎn)量最高,為232.4 mg/100 mL,bhqh-7和bhqh-5次之,分別為213.8和195.2 mg/100 mL。

表1 7株內(nèi)生真菌粗提物產(chǎn)量及特征

2.2 粗提物抑菌活性的測(cè)定

通過管碟法測(cè)定7株白花前胡內(nèi)生真菌粗提物對(duì)病原細(xì)菌和病原真菌的抑菌活性。發(fā)酵粗提物對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果如表2所示,其中bhqh-1、bhqh-2、bhqh-3、bhqh-5和bhqh-7對(duì)4種細(xì)菌都有抑制效果,bhqh-2的抑菌效果最好,對(duì)病原細(xì)菌的抑菌圈直徑均在30.0 mm以上。

表2 7種粗提物對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果

發(fā)酵粗提物對(duì)病原真菌的抑菌效果如表3所示,所有內(nèi)生真菌的粗提物都對(duì)1種以上的病原真菌有抑制活性。bhqh-2、bhqh-3、bhqh-5和bhqh-7這4株內(nèi)生真菌的粗提物對(duì)4種病原真菌均具有抑制作用,其中bhqh-2的抑菌效果最好,特別是其對(duì)V.dahliae的抑菌圈直徑為29.3 mm,與陽性對(duì)照所產(chǎn)生的抑菌圈直徑(30.1 mm)相近。

表3 7種粗提物對(duì)病原真菌的抑菌效果

2.3 粗提物細(xì)胞毒活性的測(cè)定

內(nèi)生真菌的粗提物對(duì)A549和MDA-MB-231的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖2所示。菌株bhqh-2、bhqh-3、bhqh-5、bhqh-7的粗提物對(duì)A549表現(xiàn)出顯著的抑制活性,bhqh-2、bhqh-3、bhqh-4、bhqh-5、bhqh-7的粗提物對(duì)MDA-MB-231表現(xiàn)出顯著的抑制活性,抑制率均達(dá)到95%以上,推測(cè)其次級(jí)代謝產(chǎn)物中含有細(xì)胞毒活性較高的物質(zhì)。

圖2 粗提物對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的抑制率

2.4 菌株bhqh-2的鑒定

內(nèi)生菌粗提物抑菌活性和細(xì)胞毒活性的初篩表明,內(nèi)生真菌bhqh-2活性最好,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。如圖3所示,bhqh-2菌落正面從中心往四周分別呈黑色、綠色、白色,菌落形態(tài)呈放射狀,菌絲較短,有孢子生成,背面菌落呈米白色,菌落中心有褶皺。顯微鏡下(10×40)觀察,有球形的分生孢子頭,分生孢子梗直徑約為14.1 μm,孢子直徑約為3.1 μm,初步判定為曲霉屬(Aspergillus)。

(a)正面;(b)反面;(c)顯微形態(tài)。

經(jīng)ITS測(cè)序獲得bhqh-2菌株ITS序列(GenBank No.ON202823.1),用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示其與棒曲霉(Aspergillusclavatus)聚為一族(圖4),因此將該菌株命名為A.clavatusbhqh-2。

2.5 化合物的分離純化

對(duì)bhqh-2進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵,經(jīng)過萃取、旋蒸濃縮得到10 g粗提物浸膏。通過硅膠柱層析,得到Fr.1～Fr.45,通過薄層層析檢測(cè)合并相似組分,獲得Fr.A～Fr.I共9個(gè)組分。后續(xù)利用C18反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析及HPLC等方法從Fr.C中分離獲得化合物1～3,從Fr.D中分離獲得化合物4～6。

2.6 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

從內(nèi)生菌A.clavatusbhqh-2中共獲得6個(gè)化合物,其核磁數(shù)據(jù)如下所示。

化合物1:白色固體,1H NMR (400 MHz,Acetone-d6):δ7.83(s,1H),7.72(s,1H),6.79(d,J=3.0 Hz,1H),6.65(d,J=8.5 Hz,1H),6.58(dd,J=8.5,3.0 Hz,1H),4.68(s,2H),3.34 (s,1H)。13C NMR(101 MHz,Acetone-d6):δ151.88,149.57,129.89,117.28,115.81,115.65,62.46。結(jié)合文獻(xiàn)[18]數(shù)據(jù),化合物1的結(jié)構(gòu)被確定為2,5-二羥基苯甲醇。

化合物2:白色粉末,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6):δ6.48(q,J=2.3 Hz,1H),5.44(t,J=5.5 Hz,1H),4.30(ddd,J=18.6,5.4,2.4 Hz,1H),4.17(ddd,J=18.6,5.4,2.1 Hz,1H),3.98(d,J=4.0 Hz,1H),3.94(dd,J=3.9,2.3 Hz,1H)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):δ192.21,192.07,149.77,129.62,57.30,54.15,54.03。結(jié)合文獻(xiàn)[19]數(shù)據(jù),化合物2的結(jié)構(gòu)被確定為phyllostine。

化合物3:淡黃色油狀物,1H NMR(400 MHz,Acetone-d6):δ6.52(ddq,J=5.5,3.0,1.5 Hz,1H),4.57(d,J=4.9 Hz,1H),3.76(ddd,J=3.7,2.5,1.3 Hz,1H),3.42(dd,J=3.7,1.1 Hz,1H),3.31(s,1H),1.76(t,J=1.3 Hz,3H)。13C NMR(101 MHz,Acetone-d6):δ 195.66,141.97,134.25,64.23,59.54,54.70,16.55。結(jié)合文獻(xiàn)[20]數(shù)據(jù),確定化合物3的結(jié)構(gòu)為epiepoformin。

化合物4:淡黃色結(jié)晶狀固體,1H NMR(400 MHz,Acetone-d6):δ8.30(s,1H),7.13(t,J=7.8 Hz,1H),6.87(t,J=2.0 Hz,1H),6.81(d,J=7.2 Hz,1H),6.70(dd,J=7.9,2.6 Hz,1H),4.56(d,J=3.3 Hz,2H),4.25(d,J=6.0 Hz,1H)。13C NMR(101 MHz,Acetone-d6):δ158.38,145.03,130.10,118.52,114.67,114.39,64.72。結(jié)合文獻(xiàn)[21]數(shù)據(jù),確定該化合物為間羥基苯甲醇。

化合物5:淡黃色固體,1H NMR(400 MHz,Acetone-d6):δ7.25(t,J=7.9 Hz,1H),6.92(ddd,J=7.6,1.6,0.9 Hz,1H),6.87～6.84(m,1H),6.80(ddd,J=8.0,2.6,0.9 Hz,1H),5.95(ddt,J=1.9,1.3,0.6 Hz,1H),5.92(dt,J=4.5,2.3 Hz,1H),5.78(s,1H),4.83(d,J=11.9 Hz,1H),4.67(d,J=11.9 Hz,1H),4.62(ddd,J=17.1,2.6,1.2 Hz,1H),4.39(ddd,J=17.1,4.5,0.7 Hz,1H)。13C NMR(101 MHz,Acetone-d6):δ 168.75,155.93,152.1,148.71,138.36,129.99,120.34,115.27,114.86,111.26,107.53,92.48,69.99,59.19。結(jié)合文獻(xiàn)[22]數(shù)據(jù),該化合物被確定為pintulin。

化合物6:白色晶體,1H NMR(400 MHz,Acetone-d6):δ6.10～6.01(m,3H),4.66(dd,J=17.4,2.6 Hz,1H,),4.39(dd,J=17.3,3.7 Hz,1H)。13C NMR(101 MHz,Acetone-d6):δ169.74,153.02,147.20,110.69,109.30,89.41,59.79。結(jié)合文獻(xiàn)[23],確定該化合物為展青霉素。

3 討論及結(jié)論

在白花前胡內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物活性的研究方面,馬逢時(shí)等[24]從白花前胡中分離得到25株內(nèi)生菌,其中5株對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制活性,抑制效果最好的一株為青霉屬。Wang等[25]對(duì)白花前胡內(nèi)生菌Aspergillusudagawae進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物研究,獲得4個(gè)具有細(xì)胞毒活性的新化合物Aspergilfuranones A-D。這些研究表明,從白花前胡內(nèi)生菌中獲得具有抗菌或抗腫瘤的活性化合物是可行的。本研究共獲得7株白花前胡內(nèi)生真菌,有6株內(nèi)生真菌粗提物對(duì)至少1種病原細(xì)菌有抑制作用,所有的內(nèi)生真菌粗提物對(duì)至少1種病原真菌具有抑制活性,有5株內(nèi)生菌的粗提物至少對(duì)一種腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到95%以上。對(duì)一株發(fā)酵產(chǎn)量最高,活性最好的菌株bhqh-2進(jìn)行鑒定,確定其為棒曲霉菌。對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵和次級(jí)代謝產(chǎn)物研究,獲得6個(gè)已知化合物,分別為2,5-二羥基苯甲醇、phyllostine、epiepoformin、間羥基苯甲醇、pintulin和展青霉素。其中,phyllostine、epiepoformin和展青霉素曾被報(bào)道具有良好的抗菌活性[26];pintulin也被報(bào)道具有抗菌和腫瘤細(xì)胞毒活性[24]。以上表明這些化合物是該菌株具有抗菌和抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究從傳統(tǒng)中藥植物白花前胡中分離到活性良好的內(nèi)生真菌,進(jìn)一步獲得其次級(jí)代謝產(chǎn)物,豐富了白花前胡內(nèi)生真菌的研究,為藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)掘提供了菌種資源和理論基礎(chǔ)。