付亞亭,郭冬陽(yáng),吳清發(fā)

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,合肥 230027)

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV)屬于斐濟(jì)病毒屬,是一種無(wú)包膜的二十面體病毒,其基因組由10個(gè)雙鏈RNA片段組成[1-2]。SRBSDV由白背飛虱專一性傳播,灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)可以攜帶SRBSDV,但不能傳播病毒,褐飛虱(Nilaparvatalugens)既不能攜帶病毒也不能傳播病毒[3-4]。白背飛虱以持久增殖型方式傳播SRBSDV[5],這意味著在白背飛虱取食帶毒水稻后,病毒需克服白背飛虱的天然免疫屏障,完成從消化道入侵、組織擴(kuò)增并最終回到唾液腺的巡回過(guò)程,才能進(jìn)一步傳播[6-7]。因此,研究SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的侵染、復(fù)制、擴(kuò)散等過(guò)程的機(jī)制,對(duì)發(fā)展有效手段來(lái)控制病毒傳播至關(guān)重要。

病毒入侵細(xì)胞的一種主要方式是通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[8-9],在這種作用方式下,病毒與宿主細(xì)胞膜受體識(shí)別并形成受體-配體復(fù)合物,使膜受體分子構(gòu)象發(fā)生改變,從而使受體-配體復(fù)合物向胞漿凹陷(凹陷側(cè)富含網(wǎng)格蛋白),并最終與細(xì)胞膜脫離形成囊泡,囊泡與胞漿中的內(nèi)體融合后,進(jìn)一步與溶酶體融合,導(dǎo)致內(nèi)容物被降解,病毒釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[10-11]。借助網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的病毒有很多,如水皰性口炎病毒 (VSV) 和水稻矮縮病毒(RDV)等[12-15]。

組織蛋白酶D(CathD)是天冬氨酸型肽鏈內(nèi)切酶,在細(xì)胞自噬和內(nèi)吞通路中起著水解蛋白質(zhì)的重要作用[16]。研究報(bào)道呼腸孤病毒進(jìn)入小鼠成纖維細(xì)胞需要內(nèi)體中天冬氨酸CathD,抑制CathD的活性可有效減少呼腸孤病毒的復(fù)制[17]。SRBSDV是呼腸孤病毒科成員,目前對(duì)SRBSDV通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入白背飛虱細(xì)胞后的釋放機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型白背飛虱在人工氣候箱飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件為溫度26 ℃,濕度60%,12 h光照12 h黑暗交替循環(huán)。水稻品種為秈稻TN1。攜帶SRBSDV的水稻病株為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周國(guó)輝教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 白背飛虱顯微注射

本實(shí)驗(yàn)所用到的雙鏈RNA(dsRNA)由T7 transcription kit (TOYOBO,Japan)體外轉(zhuǎn)錄制備。用于合成CathD dsRNA的模板DNA引物是P1:T7-TGTTGCAGCTAAATTCGACG,P2:T7-AGGTCCGACAATGAGA-CTGG,用于合成GFP dsRNA的模板DNA引物是P1:T7-ACGTAAACGGCCACAAGTTC,P2:T7-TGTTCTGCTGGTAGTGGTCG。實(shí)驗(yàn)選擇2～3齡的白背飛虱若蟲用于注射dsRNA,注射部位為白背飛虱胸部中足以及后足之間的外側(cè)表皮處。在顯微注射時(shí),首先用適量CO2麻醉飛虱;隨后用毛筆將飛虱若蟲在注射平板上排成一行,這樣利于快速注射;設(shè)置顯微注射儀(EPPENDORF)的參數(shù)為注射壓強(qiáng)1 300 hPa,注射時(shí)間0.3 s,補(bǔ)償壓10 hPa;向每只白背飛虱若蟲注射20～30 nL dsRNA。注射完成后將白背飛虱若蟲分裝在直徑3 cm,高9.5 cm的小管中,管內(nèi)裝有在濕潤(rùn)的廚房用紙上生長(zhǎng)的新鮮水稻苗,用尼龍網(wǎng)封住管口,每管若蟲不超過(guò)30頭。注射24 h后,收集5頭白背飛虱,提取總RNA,用于下游的qRT-PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 白背飛虱獲毒試驗(yàn)方法

顯微注射CathD基因的dsRNA到2～3齡白背飛虱若蟲體內(nèi),注射濃度5 μg/μL,注射體積20～30 nL,同期對(duì)照組白背飛虱注射GFP基因的dsRNA。注射完畢后將白背飛虱若蟲轉(zhuǎn)移至裝有健康水稻苗的小管中觀察,24 h后將實(shí)驗(yàn)組白背飛虱和對(duì)照組白背飛虱轉(zhuǎn)移至攜帶SRBSDV病毒的水稻苗飼喂,48 h后將飼喂完畢的飛虱若蟲轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)有健康水稻苗的組培罐中培養(yǎng),每罐可容納飛虱若蟲不超過(guò)100頭。在飼毒后潛伏期第4天、第8天和第12天分別收集各組白背飛虱20～30只,分別提取每只飛虱的總RNA,RT-PCR檢測(cè)白背飛虱飼毒后的帶毒比率,qRT-PCR檢測(cè)白背飛虱在飼毒后潛伏期第4天的病毒帶毒量(圖1)。

圖1 白背飛虱獲毒試驗(yàn)流程圖

1.2.3 果蠅S2細(xì)胞dsRNA干擾以及病毒侵染實(shí)驗(yàn)

制備果蠅dmCathD基因的dsRNA方法同上。用于合成dmCathD的 dsRNA的模板DNA引物是P1:T7-TCACCTACTTGCCCGTTACC,P2:T7-CCGGACAGACAG-ATGGTCTT,用于合成Ago2和β-gal基因dsRNA的DNA模板引物參考文獻(xiàn)[18-19]。果蠅S2細(xì)胞培養(yǎng)在加有體積分?jǐn)?shù)分別為10%滅活血清和1%雙抗的昆蟲完全培養(yǎng)基(Sigma)中,待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期,收集果蠅S2細(xì)胞懸液,1 400 r/min離心5 min后棄去上清液,使用不添加抗生素和血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至細(xì)胞密度為1.5×106mL-1。將8 μg dsRNA使用250 μL無(wú)菌水稀釋后加至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING),然后加入500 μL重懸的S2細(xì)胞輕輕混勻,25 ℃饑餓處理30 min后,每孔中加入1 mL的完全培養(yǎng)基,最后補(bǔ)加血清至終含量為10%。48 h后向每孔中加入稀釋到105濃度的病毒200 μL,培養(yǎng)48 h后即可檢測(cè)S2細(xì)胞的病毒復(fù)制情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA干擾后白背飛虱的存活曲線

通過(guò)注射dsRNA到白背飛虱體內(nèi)敲低CathD基因表達(dá)水平,然后飼喂SRBSDV病毒后,觀察到dsCathD組在潛伏期第4天已經(jīng)有部分白背飛虱羽化為成蟲,在潛伏期第8天已經(jīng)全部長(zhǎng)成成蟲,與對(duì)照組白背飛虱相比無(wú)形態(tài)和發(fā)育異常。存活曲線顯示,敲低CathD的白背飛虱在獲毒后的生存率與對(duì)照組白背飛虱相比沒(méi)有明顯差異(log-rank檢驗(yàn)),見圖2。結(jié)果表明沉默表達(dá)CathD的白背飛虱在飼喂SRBSDV病毒后對(duì)白背飛虱的發(fā)育和生存沒(méi)有明顯影響。

ns為差異不顯著。

2.2 dsRNA干擾CathD基因后白背飛虱帶毒率降低

注射dsRNA 24 h后提取5只白背飛虱的總RNA并進(jìn)行qRT-PCR,結(jié)果顯示CathD基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào)至對(duì)照組的13.8%[圖3(a)]。在帶毒水稻苗飼毒2 d后,將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組白背飛虱轉(zhuǎn)移到健康苗培養(yǎng),并在SRBSDV潛伏期第4天、第8天和第12天分別收集20～30只白背飛虱,提取單只試蟲的總RNA。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射dsGFP的白背飛虱在第4天、第8天和第12天的帶毒比率分別為80.9%、81.7%和79.2%,而注射dsCathD的白背飛虱在SRBSDV潛伏期的第4天、第8天和第12天的帶毒比率分別為64.0%、69.2%和61.7%[圖3(b)]。

(a)白背飛虱顯微注射dsRNA 24 h后CathD基因的干擾效率(以RP-L4為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理);(b)沉默CathD的白背飛虱在飼毒后潛伏期第4天、第8天和第12天的帶毒比率;(c)沉默CathD的白背飛虱在飼毒后潛伏期第4天的平均帶毒量(以RP-L4為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理)。(a)～(c)展示了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和誤差值,顯著性分析結(jié)果由t檢驗(yàn)獲得(* 為P<0.05,** 為P<0.01,**** 為P<0.000 1,ns為差異不顯著)。

2.3 dsRNA干擾CathD基因后白背飛虱帶毒量降低

沉默表達(dá)CathD的白背飛虱在飼喂SRBSDV病毒后,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SRBSDV潛伏期第4天的平均病毒復(fù)制量明顯下調(diào),dsCathD組的SRBSDV的RNA相較dsGFP組下調(diào)至32.2%[圖3(c)],進(jìn)一步證明CathD蛋白具有協(xié)助SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)復(fù)制的作用,我們猜測(cè)CathD蛋白可能是通過(guò)內(nèi)吞作用機(jī)制協(xié)助病毒在白背飛虱體內(nèi)的擴(kuò)散增殖。

2.4 CathD在果蠅細(xì)胞中具有協(xié)助DCV病毒復(fù)制的作用

為了檢測(cè)CathD蛋白幫助病毒復(fù)制的機(jī)制是否保守,選擇在果蠅S2細(xì)胞水平上進(jìn)行dsRNA敲除實(shí)驗(yàn)。RNAi通路是果蠅主要的抗病毒通路,Argonaute-2(Ago2)蛋白參與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的形成,RISC可以切割病毒RNA,斷裂的病毒RNA被進(jìn)一步降解,從而達(dá)到抑制病毒的作用。Ago2蛋白是已經(jīng)鑒定的具有抗DCV病毒復(fù)制功能的蛋白[20-21],本研究選擇Ago2蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示,相較陰性對(duì)照dsβ-gal組,CathD基因和Ago2基因的mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)至16.7%和31.4%[圖4(a)],敲低果蠅S2細(xì)胞CathD基因的表達(dá)沒(méi)有觀察到對(duì)S2細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖的任何影響。隨后進(jìn)行DCV的侵染,48 h后收集S2細(xì)胞提取總RNA開展qRT-RCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組dsβ-gal相比,敲低果蠅S2細(xì)胞中陽(yáng)性對(duì)照Ago2基因后,DCV的mRNA水平上調(diào)約2.3倍,而敲低CathD基因后,DCV的mRNA水平下調(diào)至對(duì)照組的0.34倍,說(shuō)明CathD在果蠅細(xì)胞中具有幫助DCV復(fù)制的作用,這和白背飛虱在成蟲水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[圖4(b)]。

3 討論與結(jié)論

許多病毒依賴內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞,如水皰性口炎病毒 (VSV) 和水稻矮縮病毒(RDV)等[12-14]。RDV病毒粒子的外殼蛋白P2從病毒粒子表面伸出,與昆蟲介體細(xì)胞表面受體相接觸,從而通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞[14,22]。SRBSDV與RDV都屬于感染水稻的呼腸孤病毒,其病毒粒子也擁有類似突出狀結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)對(duì)病毒粒子侵入宿主細(xì)胞具有十分重要的作用[23],但目前對(duì)SRBSDV通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入白背飛虱細(xì)胞內(nèi)的釋放機(jī)制尚不清楚。

CathD蛋白是溶酶體中的酸性蛋白水解酶。本研究證明敲低白背飛虱細(xì)胞內(nèi)CathD基因的表達(dá)水平,會(huì)降低SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的帶毒率和帶毒量,表明CathD蛋白有助SRBSDV從細(xì)胞內(nèi)體/溶酶體中釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。已知果蠅DCV病毒是通過(guò)依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入果蠅細(xì)胞[24],研究結(jié)果表明敲低果蠅CathD基因的表達(dá)也會(huì)降低DCV在果蠅細(xì)胞的復(fù)制水平。這些結(jié)果表明CathD促進(jìn)病毒從細(xì)胞內(nèi)體/溶酶體中釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)機(jī)制可能是保守的,可以作為防控SRBSDV病害的潛在靶標(biāo)分子。我們計(jì)劃進(jìn)一步研究CathD蛋白在白背飛虱侵染SRBSDV時(shí)發(fā)揮作用的分子機(jī)制。